N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶的功能与机制

N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶(endo-beta-N-acetylglucosaminidase,ENGase)广泛分布于各种生物中,主要通过降解错误折叠的糖蛋白,参与细胞和生命的调控。ENGase也是糖链编辑的有效工具酶,可专一性水解游离寡糖链及糖肽或糖蛋白上核心五糖的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)之间的β-14糖苷键。其水解产物是寡糖链和一个GlcNAc,或带有一个GlcNAc的糖肽或糖蛋白。本文对ENGase的发现、分布、蛋白质结构、酶学反应及生物学功能进行阐述,为ENGase的生物学研究提供思路,为糖生物学与糖组学的应用研究奠定基础。

布氏锥虫来源内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的异源表达和活性鉴定

内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶(Endo-β-N-acetylglucosaminidase,ENGase)是一类可以水解N-糖链中核心壳二糖之间β-1,4-糖苷键的糖苷内切酶,其中糖苷水解酶85家族(glycoside hydrolasefamilies 85,GH85)的ENGase除了水解活性之外还具有转糖基活性,能够以切除后再将均一的寡糖链转移到N-糖蛋白的β-N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)上的方式,改造医药糖蛋白的N-糖基化修饰。通过数据库检索,在布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的基因组中找到了GH85家族ENGase的同源序列,并命名为Endo-Tb基因,对其克隆后在带有Nus融合蛋白的原核(E.coli)表达载体上成功表达并纯化。检测到融合蛋白Nus-Endo Tb能够水解高甘露糖型和双天线的复合型糖链,但不能作用于三天线的复合型糖链。同时Nus-Endo Tb可以水解核糖核酸酶B和人类转铁蛋白上的N糖链。当用唾液酸糖肽(SGP)作为糖基供体,MU-GlcNAc作为糖基受体时,通过荧光基质底物四甲基伞形酮(MU)检测到Nus-Endo Tb具有转糖基活性。

β-N-乙酰葡萄糖苷内切酶Endo S异源表达及发酵优化

Endo S(EC 3.2.1.96)是一种来源于化脓链球菌的β-N-乙酰葡萄糖苷内切酶,可以特异性水解免疫球蛋白G(Ig G)可结晶区(Fc片段)N糖链。为实现其高效表达,本研究构建endo S重组表达大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-endo S,并验证表达蛋白糖苷水解活性,在摇瓶水平单因素优化蛋白质表达,考察了基础培养基种类、碳源、氮源、无机盐、培养基初始pH、发酵温度和时间等因素对产酶的影响,确定最优发酵培养基组成为(g/L):酵母粉10.0,甘油4.0,牛肉浸膏25.4,NaCl 5.0,pH 8.0,最优培养条件为:20℃诱导表达24 h,蛋白表达量为225 mg/L发酵液,是优化前的4.5倍,同时也是目前报道最高表达量的5.6倍。

以2-甲氧基-4-(2′-硝基乙烯基)酚-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷为底物测定尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性

目的评价以2-甲氧基-4-(2′-硝基乙烯基)酚-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MNP-NAG)为底物的全液体试剂两点终点法测定尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性。方法尿样中NAG作用于底物MNP-NAG水解产生游离MNP,其生成速率与酶活性在一定范围内成正比。结果该法显色最大吸收波长为505nm,试剂1和试剂2最适pH值分别为4.6和10.2,最适底物浓度为16mmol/L,线性范围达198U/L,批内变异系数(CV)和批间CV分别为2.2%和3.8%。166例健康体检者尿样NAG活性参考范围为:(6.21±4.53)U/gCr(x-±1.96s)。结论MNP-NAG底物法测定尿NAG灵敏度高,操作简便,结果可靠,适合临床应用。

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶新型底物的合成及在肾小管疾病诊断中的应用

目的优化N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)的新型底物6-甲基-2-吡啶基-1-硫-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的合成方法,探讨其在肾小管疾病诊断中的应用价值。方法采用活泼中间物(1-氯-1-脱氧乙酰糖)与6-甲基-2-巯基吡啶成苷合成底物;以MPT-NAG为底物,采用全自动生化仪测定糖尿病肾病、肾病综合征、肾移植患者和正常对照者尿液样本中NAG的活性。结果底物MPT-NAG的结构经元素分析和1HNMR谱鉴定,高效液相色谱(HPLC)检测纯度达99.8%。NAG活性测定结果表明,糖尿病肾病、肾病综合征和肾移植患者的尿NAG活性增高,与正常对照者比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论经优化制备工艺合成获得NAG新型底物MPT-NAG,所用原料成本低、操作简便且产物得率较高,在肾小管疾病的诊断中具有临床应用价值。

MPT-NAG测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的应用价值

目的应用新型底物6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰--βD-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)建立检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的紫外动力学新方法,用于尿液中NAG活性测定。方法基于NAG催化水解对硝基苯-N-乙酶-β-D-氨基葡萄糖苷生成有色的对硝基酚这一反应,对缓冲液离子强度、pH值、底物浓度等最佳反应条件及各种实验参数进行研究。用该法测定了多种病尿样中NAG活活性。结果该法最低检出限为1.5 U/L,线性范围可达250 U/L(r=0.998 9),批内CV为<3%,批间CV<5%,回收率为101.3%。结论本法灵敏度高,线性、精密度好,结果准确,且操作简便快速,适用于全自动生物化学分析仪操作。

一种新的氨基葡萄糖苷酶检测底物的合成

首次合成了N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶检测底物———2-氯-4-乙酰基苯基-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(CAP-NAG),并对其合成方法进行了研究,最终找到一种操作简便,成本较低,收率较高的合成方法。合成方法如下:以2-氯-4-乙酰基苯酚和氯代乙酰氨基葡萄糖为原料,在丙酮-无水碳酸钾体系中进行缩合反应,得到固体粗品经重结晶后,在甲醇-甲醇钠体系中进行脱乙酰基反应即得标题化合物,产物结构经红外光谱、核磁共振谱及元素分析确证。

苜蓿链霉菌内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的克隆、表达及酶学性质

内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶广泛应用于糖生物学研究和工业生产。本研究从苜蓿链霉菌Streptomyces alfalfae ACCC 40021中克隆并原核表达了一个新的内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,该酶最适反应温度为35℃,最适pH为6.0,具有良好的pH稳定性、温度稳定性和高比活(1×10^6 U/mg)的特性,可催化不同蛋白底物去糖基化,具有作为工具酶和生物催化剂的潜力。

阿维链霉菌来源EndoH在枯草芽孢杆菌中的表达及应用

内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶H(Endo H)是一类识别并切割与糖肽和糖蛋白的天冬氨酸残基连接的寡聚糖上N-乙酰氨基壳糖核心的糖苷酶,可用于糖组学中大规模糖基化位点的鉴定。克隆阿维链霉菌来源的endo H,成功构建p MA0911.1-Endo H重组质粒,并转化到枯草芽孢杆菌WB600中。发酵液经疏水层析和离子交换层析等技术手段得到目的蛋白Endo H。通过重组Endo H高效率酶切RNase B及对鸡卵清标准糖蛋白(OVA)的N-糖链结构的鉴定,表明重组Endo H在糖组学N-糖链结构研究中具有良好的应用前景。

血清胱抑素C、RBP及尿中NAG联合检测对过敏性紫癜患儿早期肾损伤的诊断价值

目的探讨血清胱抑素C、视黄醇结合蛋白(RBP)及尿中N-乙酰-β-D-氨基-葡萄糖苷酶(NAG)联合检测对过敏性紫癜(HSP)患儿早期肾损伤的诊断价值。方法 76例HSP患儿依据尿清蛋白排泄率(UAER)水平分成UAER正常组、UAER微量组和UAER大量组,另选择同期健康体检者25例作为对照组,观察各组血清胱抑素C、RBP和尿中NAG水平。结果 HSP各组患儿血清胱抑素C、RBP水平以及UAER微量组和UAER大量组尿中NAG水平与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。HSP组血清胱抑素C、RBP及尿中NAG单项阳性检出率均明显低于联合检测阳性率,差异有统计学意义(P<0.01)。血清胱抑素C与血清RBP、尿中NAG呈正相关(r=0.514、0.426,均P<0.05)。结论联合检测上述3项指标能明显提高HSP患儿肾损伤的早期诊断阳性率,提高诊断准确性,为HSP的早期治疗和预防提供参考。

Dispersin B:一种可用于生物被膜防治的糖苷水解酶

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(dispersin B, DspB)是一种活性高、稳定性强的糖苷水解酶,其相对分子质量为40 000。DspB由361个氨基酸残基组成,具有8个β/a结构域,折叠后形成TIM桶状结构。其中,β4结构域存在高度保守的位点Asp183和Glu184。作为糖苷水解酶家族20(glycoside hydrolase family 20, GH20)成员,DspB不像其他β-己糖胺酶那样具有多个功能域,DspB只有单一的功能域,且具有独特的底物专一性、底物结合与释放特性。由于DspB能够水解细菌生物被膜基质中的聚β-(1,6)-N-乙酰葡萄糖胺(poly-β-1,6-N-acetyl-D-glucosamine, PNAG),使生物被膜发生解聚而变成游离状态,增加抗生素疗效,因此有望用于细菌引起的植入医疗器械感染的治疗。现分别从DspB所在GH20家族成员概况、DspB的结构和DspB的功能与应用三个方面对相关的最新研究进展进行分析与总结。

不同肥料对稻田红壤碳、氮、磷循环相关酶活性的影响

采用中国科学院千烟洲生态站1998年开始的定位试验数据,研究不同肥料(猪粪、秸秆、化肥)对稻田红壤碳、氮、磷养分及相关酶活性[β-1,4-葡萄糖苷酶(βG)、β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶(NAG)、L-亮氨酸氨基肽酶(LAP)、酸性磷酸酶(AP)]的影响.结果表明:施用猪粪(OM)土壤中的βG、NAG和LAP活性显著高于其他处理,比对照(不施任何肥料)分别高1.4、2.6和1.9倍;土壤C/N提高、βG/(NAG+LAP)降低,说明施用猪粪有利于土壤中纤维素的降解和有机碳的积累.施用化肥提高了土壤中βG、NAG和LAP活性,而AP活性比对照低34%;土壤βG/AP和(NAG+LAP)/AP较高,而C/P和N/P较低,说明施用化肥导致稻田红壤无机磷的积累,抑制了土壤中分解磷酸多糖和磷脂的微生物功能.

蒙药孟根乌苏(水银)-18味丸对大鼠肾汞蓄积及肾早期损伤的影响

目的:观察孟根乌苏(水银)-18味丸对大鼠肾汞蓄积及肾早期损伤指标的影响。方法:将Wistar雄性大鼠,根据体质量随机分为正常对照组,孟根乌苏(水银)-18味丸低剂量组[0.29 g·(kg·d)^(-1)]、中剂量组[1.47 g·(kg·d)^(-1)]、高剂量组[(2.9 g·(kg·d)^(-1)],孟根乌苏(水银)炮制品低剂量组[0.033 g·(kg·d)^(-1)],硫化汞组[17.39 mg·(kg·d)^(-1)]、氯化汞组[4.06 mg·(kg·d)-1],氯化亚汞组[7.06 mg·(kg·d)^(-1)],共8组,每组10只。各组大鼠适应1周后,灌胃给药15 d后分别计算肾脏指数,检测大鼠血清尿素、肌酐,肾组织形态学变化,用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)和电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测肾汞蓄积量;并于实验第7天和第15天,收集24 h尿液,用尿液分析仪检测尿蛋白和pH值,酶联免疫吸附法(Elisa)检测尿液β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(n-acetyl-β-glucosaminidase,NAG)、尿视黄醇结合蛋白(retinol binding protein,RBP)、β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)、肾损伤因子-1(kidney injury factor,KIM-1)含量。结果:大鼠连续给药15 d后,与正常对照组和孟根乌苏炮制品低剂量组比较,氯化汞组、氯化亚汞组大鼠肾脏指数显著升高(P<0.01);各组大鼠血清肌酐和尿素含量无显著差异(P>0.05)。肾脏病理检查结果表明,孟根乌苏-18味丸低剂量组,即临床常用剂量组大鼠肾脏出现了一定的病理损伤,表现为肾小球轻度肥大,肾小管上皮中度肿胀变性;孟根乌苏-18味丸中剂量组和高剂量组肾脏也出现了一定损伤,硫化汞、氯化汞、氯化亚汞组大鼠肾病理变化更显著。与正常对照组和孟根乌苏炮制品低剂量组比较,氯化汞组和氯化亚汞组大鼠肾汞蓄积量显著升高(P<0.01);给药7d和15 d后,孟根乌苏-18味丸各剂量组尿蛋白和尿液NAG、β2-MG、RBP和KIM-1含量无显著差异(P>0.05);给药7 d后,氯化汞组尿蛋白有升高趋势,尿液β2-MG含量显著升高(P<0.01),给药15 d时,尿蛋白有升高趋势,尿液β2-MG、KIM-1含量显著升高(P<0.01,P<0.05);给药7 d和15 d后,氯化亚汞组尿蛋白有升高趋势,尿液RBP、β2-MG、KIM-1含量显著升高(均为P<0.05)。结论:大鼠连续给药15 d后,孟根乌苏-18味丸肾汞蓄积量和尿液NAG、β2-MG、RBP、KIM-1含量无显著变化。

液体型MPT-NAG匀相速率法试剂测定NAG活性

目的建立以6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)为底物的液体型匀相速率法试剂测定NAG活性。方法在含表面活性剂的柠檬酸缓冲液中,NAG催化MPT-NAG分解产生6-甲基-2巯基吡啶(MPT),用全自动生化分析仪监测340 nm处吸光度的变化速率,与标准液比较后计算出样本中NAG活性。结果该法线性范围为0 U/L^380 U/L,平均回收率为98.8%;批内、批间相对标准差(RSD)分别为1.2%~3.3%和2.4%~3.9%;与参考方法相比的回归方程及相关系数分别为y=1.01x+0.24,r=0.9986。结论用液体型MPTNAG匀相速率法试剂测定NAG活性,具有快速、稳定、简便等优点,适合临床应用。