单增李斯特菌内化素A分段表达及多克隆抗体的制备

为了研究单增李斯特茵（Listeria monocytogenes）InlA蛋白入侵细胞时各段相关功能，试验采用PCR技术扩增得到L．monocytogenes 08—5923株InlA基因片段，测序后利用GenBank对InlA氨基酸序列进行分段，分为2个基因片段，即InlAl（1-1488bp）和InlA2（1315—2403bp），将其分别克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中，并转化至宿主茵中诱导表达，表达的重组蛋白经Western—blot和间接ELISA法鉴定，用纯化的重组蛋白分别免疫家兔，并用ELISA法检测家兔多克隆抗体的特异性。结果表明：表达的2种重组蛋白分子质量分别约为79ku和64ku，以其制备的多克隆抗体均可与单增李斯特茵InlA天然蛋白发生反应；2种重组蛋白均能有效诱导抗体反应，其中InlA2（new flag）诱导产生的抗体效价较高，与单增李斯特茵InlA天然蛋白结合能力较强。

产单核细胞李氏杆菌内化素G单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

本研究旨在建立一种快速检测产单核细胞李氏杆菌的方法。通过PCR扩增产单核细胞李氏杆菌(LM)内化素G(InlG)基因,构建pET-32a-InlG重组表达载体,通过诱导表达获得InlG重组蛋白,将其纯化后免疫小鼠(100μg·只^(-1)),经细胞融合、克隆和筛选共获得了3株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为1D2、1D2-1和2H10。经鉴定,其分泌抗体亚型均为IgG 1。利用制备的1D2-1作为捕获抗体,产单核细胞李氏杆菌兔多抗作为检测抗体,初步建立检测产单核细胞李氏杆菌的双抗体夹心ELISA方法。Western blot结果显示3株单克隆抗体(mAb)与InlG均可发生特异性反应。双抗体夹心ELISA方法的特异性试验结果显示,与沙门菌、大肠杆菌、枯草杆菌、白色葡萄球菌和柠檬色葡萄球菌均不发生反应。灵敏度试验结果显示,该方法检测LM纯培养物的检测限为1.0×10^(6)CFU·mL^(-1)。重复性试验结果显示,各组变异系数在5%~10%之间(<10%)。综上,本研究利用抗内化素G蛋白的mAb和兔多抗建立了双抗体夹心ELISA方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于产单核细胞李氏杆菌感染的快速诊断检测。

单核细胞增生李斯特氏菌内化素InlJ对噬菌体敏感性及生物被膜形成的影响

为深入探索单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,Lm)inlJ基因在噬菌体敏感性和生物被膜中的作用及功能,本研究通过同源重组构建inlJ基因缺失株Lm NJ05-ΔinlJ,鉴定其生长、黏附及侵袭特性,解析其对噬菌体敏感性和生物被膜形成中的作用机制。结果表明:与野生型Lm NJ05相比,构建的缺失株Lm NJ05-ΔinlJ对RAW264.7细胞的黏附率和侵袭率分别为20.05%和4.42%,黏附和侵袭能力显著减弱;Lm NJ05-ΔinlJ对李斯特菌噬菌体vB-LmoM-NJ05的成斑率提高至2.72倍;体外裂解分析表明噬菌体vB-LmoM-NJ05对缺失株Lm NJ05-ΔinlJ裂解效果更强;噬菌体效价分别在105PFU/mL和108PFU/mL能够完全抑制和清除Lm NJ05-ΔinlJ生物被膜;生物被膜形成相关基因的转录分析表明,噬菌体作用缺失株Lm NJ05-ΔinlJ后,degU、agrA、agrD、luxS、yneA、recA和hpt基因的转录均下调(表达水平趋向于0)。由此可见,inlJ基因的缺失能够增强Lm对噬菌体敏感性,下调Lm对细胞侵袭力和生物被膜形成能力。因此,内化素基因inlJ不仅具有调控Lm自身的作用,还能够调节其对噬菌体的相互作用,为噬菌体的生物防控技术开发和应用奠定基础。

内化素G在单增李斯特菌入侵巨噬细胞中的作用研究

为探究内化素G在单增李斯特菌(LM)致病性及生物学特性中的作用,以单增李斯特菌ATCC19111标准株为模板,扩增出用于缺失内化素G(Inl G)的上、下游同源臂。应用同源重组将上、下游同源臂融合扩增得到LM-ΔInl G缺失株,然后比较分析标准株与缺失株的生长特性、对细胞的侵袭能力及转录组测序结果。结果显示,LM-ΔInl G的生长速度与LM相比无显著变化,Inl G不参与温度调节,不影响细菌对酸碱的耐受性;细胞黏附侵袭试验表明,LM-ΔInl G增强了LM对细胞的内化作用(P<0.01);GO富集分析显示,显著差异表达基因主要富集在裂解酶活性、小分子结合和氮化合物代谢过程;KEGG pathway分析,显著差异表达基因主要参与群体感应、丙酸代谢,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、甘油磷脂代谢和丁酸代谢等22个代谢通路。表明Inl G与LM的毒力有关,缺失Inl G可以加强对细胞的内化作用,为阐明LM的致病机理提供了科学依据。

单增李斯特菌内化素基因inlA多态性分析

目的分析全球不同地区单增李斯特菌内化素A编码基因inlA的多态性,及其与菌株家系、血清群和序列型(sequence types,ST)之间的相关性。方法收集不同国家的4115株单增李斯特菌基因组信息,分析inlA基因的序列多态性,确定其等位基因型,构建基于inlA基因的系统进化树。结果4115株单增李斯特菌基因组中,除3株菌外均携带inlA基因,根据基因序列分为370个inlA等位基因型。编码完整InlA的等位基因型有292种(3164株菌),因点突变出现提前终止密码子(premature stop codon,PMSC)的截短型InlA等位基因型有78种(948株菌),其中84种新的编码完整InlA的等位基因型和16种PMSC类型为首次报道。系统发育分析显示,单增李斯特菌inlA基因与菌株家系、CC克隆群及ST型具有相关性。发生PMSC突变的inlA序列型也呈现多态性,尤其家系II菌株截短的InlA编码基因多样性更高。截短的InlA多见于血清群IIa和IIc菌株中,较少见于临床菌株常见的IVb血清群菌株中。结论inlA基因在单增李斯特菌中普遍存在且序列型呈现多态性,部分inlA的等位基因型与单增李斯特菌ST型具有较强的相关性,可作为特定型别菌株快速筛查的靶标。单增李斯特菌家系I和家系II菌株中截短的InlA编码基因的提前终止位点具有多样性,截短的InlA常见于IIa和IIc血清群菌株中。

内化素A/B对单增李斯特菌在模拟酸性胃环境中耐受性的影响

单核细胞增生李斯特菌(Listeria Monocytogenes,LM)是一种重要的食源性病原菌,它可以通过人口途径进入胃肠道,并穿越屏障进入肠道细胞中定殖并感染,由此可见该菌引起食物中毒的首要条件是抵抗人体内恶劣的酸性胃环境。本研究以单增李斯特菌LM90SB2及内化素基因缺失株LM90SB2ΔInlAB、LM90SB2ΔInlA、LM90SB2ΔInlB为受试菌,对4株菌进行生长曲线的测定,对其携带毒力基因溶血素(hly)扩增验证;不同pH条件下的生长曲线测定,以及模拟酸性胃环境中的耐受性研究。结果表明2~6 h 4株菌处于对数生长期,并均携带溶血素O的毒力基因hly,适宜生长的pH为6~7,pH=9时LM90SB2生长显著高于LM90SB2ΔInlAB(P<0.05)。受试菌在模拟胃环境中的存活率与其pH及作用时间相关,当pH=3.5时,4株菌的存活率依次为LM90SB2>LM90SB2ΔInlA> LM90SB2ΔInlB>LM90SB2ΔInlAB;当pH=2.5时LM90SB2生长极显著高于LM90SB2ΔInlAB(P<0.01),且随着时间的推移,4株菌生长曲线均呈下降趋势;当pH=1.5时,LM90SB2在l h、2 h时分别有0.075%及0.03%的存活率,而缺失株的存活率为0。研究表明,内化素A/B在LM抵抗人体酸性胃环境中发挥重要作用。

单核细胞增生李斯特菌新型内化素lmo0549的分子特征及其表达

应用PCR技术对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)新型内化素lmo0549基因进行克隆和测序,并对其进行生物信息学分析;通过扩增获得Lmo0549蛋白氨基端抗原集中区序列,并将其亚克隆至pET-32a(+)表达载体,转入大肠杆菌中用异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,简称IPTG)诱导表达,应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(western blot)鉴定重组蛋白的表达形式及其抗原特异性。序列分析结果表明,扩增得到的lmo0549基因全长为2 034 bp,编码677个氨基酸,其信号肽序列是前23个氨基酸,在Lmo0549蛋白氨基酸序列中,从N端到C端分别包括5个富含亮氨酸的重复基序(LRR)、1段PKD重复序列和1个WxL结构域;同时还存在N-联糖基化位点10个、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点14个、蛋白激酶C磷酸化位点15个。同源性分析显示,LM-SB5 lmo0549基因编码的蛋白氨基酸序列与标准株李斯特菌EGD-e,(NC003210.1)蛋白氨基酸序列的同源性为88.04%,且在单核细胞增生李斯特菌中具有较高的保守性。SDS-PAGE分析显示,表达的Lmo0549蛋白氨基端抗原集中区具有与理论值33.8 ku相符的分子质量;蛋白质印迹法分析表明,重组蛋白Lmo0549与LM阳性血清可发生特异性免疫反应,为进一步探讨Lmo0549在LM侵入宿主细胞的分子作用机制奠定了前期基础。

4b型单核细胞增生李斯特菌内化素基因NTSN_0462的功能初探

目的单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)对宿主的粘附、侵袭作用与其多种内化素蛋白密切相关。本研究以4b型菌株LmNTSN的內化素基因NTSN_0462为研究对象,初步探究其致病作用。方法利用同源重组技术构建该基因缺失的突变株,研究0462基因对NTSN在生长、细胞侵袭和体内定植中的作用。人结肠腺癌细胞Caco-2、人肝癌细胞HepG2的侵袭率,以及BALB/c小鼠体内肝、脾脏中定植能力的差异。结果缺失株的生长曲线结果显示,NTSN_0462基因对Lm在BHI培养基中的生长及代谢未造成明显影响。以人结肠腺癌细胞Caco-2、人肝癌细胞HepG2进行的体外试验表明,缺失株的侵袭能力低于野生株(P<0.001)。以BALB/c小鼠进行的体内试验显示,缺失株在肝脏中定殖的能力显著低于野生株(P<0.001),在脾脏中无统计学差异。结论 NTSN_0462基因在LmNTSN入侵肝脏和定植中发挥重要作用,是侵袭相关的重要毒力因子。

单核细胞增生李斯特菌LLO-InlP缺失株的构建及部分生物学特性研究

目的构建单核细胞增生李斯特菌LLO-InlP缺失株,探究LLO、InlP基因对单核细胞增生李斯特菌生物学特性的影响。方法通过温度敏感型(Ts)质粒载体基因敲除法,构建单核细胞增生李斯特菌LM681ΔInlP、LM681ΔLLO-InlP基因缺失株,通过检测不同时间的OD 600 nm值绘制生长曲线分析LM681、LM681ΔInlP、LM681ΔInlP-ΔLLO三株菌的体外生长能力;以感染复数MOI值为10感染细胞,测定LM681、LM681ΔInlP、LM681ΔInlP-ΔLLO对人绒毛膜滋养层细胞(HTR-8/SV40)、人绒毛膜癌细胞(JEG-3)黏附侵袭能力;动物水平上测定小鼠半数致死量、感染后的脑、肝、脾载菌量。结果成功获得片段大小为1125 bp的缺失株LM681ΔInlP、LM681ΔInlP-ΔLLO(亲本株LM681为2292 bp);生长曲线结果显示,各菌OD 600值无统计学差异;3株菌体外感染HTR-8/SV40细胞、JEG-3细胞黏附侵袭试验结果显示,LM681ΔInlP、LM681ΔInlP-ΔLLO较LM681对HTR-8/SV40细胞、JEG-3细胞黏附侵袭率均极显著降低(HTR-8/SV40细胞F LM681ΔInlP-LM681=102.792、F_(LM681ΔInlP-ΔLLO-LM681)=128.459,均P<0.01,JEG-3细胞F LM681ΔInlP-LM681=203.755、F_(LM681ΔInlP-ΔLLO-LM681)=81.279,均P<0.01);LM681亲本株的LD_(50)为10^(6.78),LM681ΔInlP缺失株的LD_(50)为107.45,在攻毒剂量范围LM681ΔInlP-ΔLLO不存在LD_(50),LM681ΔInlP-ΔLLO较LM681的LD_(50)提高了6.78个对数数量级,LM681ΔInlP-ΔLLO组织载菌量整体较亲本株LM681降低。结论LLO、InlP基因缺失在动物感染水平和体外培养细胞感染水平上均极大程度的降低了LM的的毒力,且InlP基因对LM681菌株黏附侵袭滋养层细胞具有一定意义,为研究InlP在单核细胞增生李斯特菌致病中的作用奠定基础。

单核细胞增生性李斯特菌inlA和inlB基因缺失菌株的构建

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是人畜共患的食源性致病菌,其对恶劣环境有较强的抵抗力,广泛存在于各种食品加工环境,容易引起严重的食品安全问题。LM是一种胞内寄生菌,其毒力因子内化素A(internalin A,InlA)和内化素B(internalin B,InlB)被认为在LM穿透宿主屏障、入侵宿主细胞以及胞间传播等过程中起到重要作用。本文利用同源重组法将LM野生菌株EGDe的inlA和inlB基因的敲除,对inlA和inlB基因缺失菌株的基本生物学特性进行研究,并运用RealTime-PCR监测LM的毒力基因表达。实验结果表明,基因的缺失对突变菌株的生长以及对环境中的氯化钠(NaCl)和乙醇(EtOH)的耐受能力没有影响,但多个毒力基因的表达量明显下降。该缺失菌株的构建为进一步研究InlA和InlB在LM入侵宿主细胞过程中的具体功能提供了重要材料。

食源性单增李斯特菌inlA/inlB/inlC基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为探究内化素inlA/inlB/inlC基因对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)生物学特性的影响,本研究采用融合PCR方法构建Lm681 inlC基因缺失突变体,并构建pKSV7-△inlC穿梭载体,将其转化Lm681-△inlAB感受态细胞,利用温度(42℃)和氯霉素(10μg/mL)抗性双重压力来实现同源重组,筛选同源重组子进行鉴定并研究其部分生物学特性。结果显示,PCR和测序结果证实成功构建了3基因缺失株(Lm681-△inlABC),且缺失株的生长特性与野生株相比无明显差异,溶血特性与野生株保持一致;小鼠感染试验显示,野生株Lm681、Lm681-△inlAB和Lm681-△inlABC对小鼠的致死率分别为80%(8/10)、60%(6/10)和40%(4/10),对小鼠的LD50分别为4.36×10~4、1.35×10~6和2.95×10~7 CFU,且Lm681-△inlABC在肝脏、脾脏及脑组织中的定植能力极显著低于野生株(P<0.01)。研究结果表明,inlA/inlB/inlC基因对Lm致病性发挥具有一定的作用,为深入研究inlX基因介导Lm入侵宿主细胞过程中的作用机制提供了科学依据。

2000—2004年浙江省食品中产单核李斯特菌污染状况调查

目的：掌握浙江省食品中产单核李斯特菌污染状况。以及内化素基因（Inl）和李氏溶血素O（Hly）两种致病基因携带情况。方法：按GB4789．30方法分离单增生李斯特菌，采用PCR技术检测李斯特菌的两种致病基因。结果：2000～2004年从2282份食品中共分离产单核李斯特菌163株，总污染率为7．14％（163／2282）。生肉类、熟肉及水产品的污染率分别为12．80％、7．67％和2．24％；114份生食蔬菜中1份标本分离到产单核李斯特菌；285份乳及乳制品、59份冰激凌均未分离到产单核李斯特菌；163株产单核李斯特菌有155株同时检测到内化素基因和李氏溶血素O基因。结论：我省存在发生李斯特菌食物中毒的潜在危险。

添加扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法的建立与应用

以单增李斯特菌inl A基因为靶基因,设计一对特异性引物,以16S rRNA为扩增内标对照,建立了一种含有扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法。优化了PCR反应体系,并对PCR检测方法的特异性、灵敏度、人工污染样品及食品样品检测效果进行了测试。对2株单增李斯特菌、1株英诺克李斯特菌以及19株非李斯特菌菌株进行PCR检测,结果显示,只有2株单增李斯特菌能被检出大小为826 bp的特异性片段,其余20株细菌只能检出1 500 bp的扩增内标片段。灵敏度实验结果显示,基因组DNA和纯培养物的最低检出限分别为1.80×10~2fg/μL和1.21×10~2CFU/m L。当人工污染牛乳样品中单增李斯特菌在最低接种量为0.48 CFU/m L时,经8 h增菌培养后可被该方法检出。采用该研究建立的检测方法对36种食品样品进行检测,证实了该检测方法可以指示检测过程中出现的假阴性现象。综上所述,该研究建立的PCR检测方法能特异性的检测单增李斯特菌,并可有效排除检测过程中出现的假阴性现象,提高检测的准确性。

PCR检测食品中单核细胞增生性李斯特菌毒力基因

目的 检测食品中分离的单核细胞增生性李斯特菌毒力基因携带率。方法 应用GB4789 3 0 -94单核细胞增生性李斯特菌的检验方法分离菌株 ,采用PCR检测李斯特菌的两种致病因子。结果 从 2 0 0 0～2 0 0 1年我省采集的 2 72份食品中分离出 3 5株单核细胞增生性李斯特菌 ,其中 11株含有内化素基因(Internalin ,In1)和李斯特菌溶血素 0基因 (Listerialysin 0 ,Hly) ,1株仅含有内化素基因 ;其它 2 3株两种基因均为阴性。结论 我省存在发生李斯特菌食物中毒的潜在危险。建立PCR方法检测李斯特菌毒力基因对快速诊断单核细胞增生性李斯特菌有现实意义。

不同来源单核细胞增多性李氏杆菌inlB和actA基因的克隆测序分析及基因缺失株的毒力试验

根据GeneBank上发表的单核细胞增多性李氏杆菌(Listeria monocytogenes,LM)的内化素B(internalin B,inlB)和肌动蛋白A(actin A,actA)基因设计特异性引物,对5株不同来源的健康绵羊单核细胞增多性李氏杆菌和一株临床分离的单核细胞增多性李氏杆菌的inlB及actA基因进行PCR扩增,克隆测序分析其序列,并对2株部分基因缺失的单增李氏杆菌进行小鼠攻毒试验。结果表明:5株健康绵羊分离株单增李氏杆菌与临床分离株有较高的同源性,并且发现2株部分基因缺失的单增李氏杆菌;小鼠攻毒试验表明缺失株毒力有降低,但是不明显。

inlA和inlB基因缺失对单核细胞增生性李斯特菌侵袭HT29结肠癌细胞的影响

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是人畜共患的食源性致病菌,其可以穿透多个宿主屏障,而内化素蛋白家族被认为是LM穿透宿主屏障过程中起重要作用的毒力因子。本研究利用同源重组的方法构建了LM野生菌株EGDe的inl A和inl B基因双缺失菌株,利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测其主要毒力基因表达的变化,并以HT29结肠癌细胞为对象,研究inl A和inl B基因缺失对LM侵袭宿主细胞能力的影响。结果表明基因的缺失对其生长能力没有影响,但多个毒力基因的表达发生了不同程度的变化,同时发现inl A和inl B基因的缺失使LM侵袭HT29结肠癌细胞的能力显著下降(P<0.05)。本研究成功构建LM的inl A和inl B基因双缺失菌株,并初步研究了基因缺失对LM侵袭宿主细胞能力的影响,为深入研究内化素Inl A和Inl B在LM入侵宿主细胞过程中的具体作用提供了支持。

毒力因子InlA和InlB缺失影响单增李斯特菌侵袭宿主细胞和诱导凋亡的能力

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种毒力较强、人畜共患的食源性致病菌,其具有穿透宿主屏障、胞内寄生的特点,因而致死率较高,被其污染的食品容易引发严重的食品安全问题。本研究使用前期构建的LM重要的毒力因子内化素A(internalin A,InlA)和InlB基因缺失菌株,以人结肠癌腺细胞Caco-2和人肝癌上皮细胞Hep G2为研究对象,探究InlA和InlB缺失对LM侵袭宿主细胞和诱导细胞凋亡的影响。实验结果表明,InlA和InlB的缺失使LM侵袭宿主细胞的能力明显降低(P<0.05),与野生株相比侵袭量下降超过50%,同时也降低了其诱导宿主细胞凋亡的能力(P<0.05),与野生株相比凋亡细胞的比例下降幅度达到30%~50%。本实验确定了InlA和InlB在LM侵袭宿主细胞和诱导细胞凋亡的过程中具有重要的作用,有助于对LM的致病机理以及引起宿主相关免疫反应、诱导细胞凋亡相关分子机制的深入研究。

内化素在产单核细胞李氏杆菌入侵宿主细胞过程中的作用

单核细胞增生李氏杆菌是一种人畜共患的革兰阳性细菌。近年来,对于该细菌入侵宿主细胞方面取得诸多成就。内化素作为一个蛋白家族在入侵过程中发挥重要作用。本文就内化素家族主要成员及其受体的作用机制进行简要综述,以期为李氏杆菌病防控中寻找理想药物靶点起到指导作用。

单核细胞增生李斯特菌感染所致炎症反应性疾病的研究进展

单核细胞增生李斯特菌（单增李斯特菌）是一种广泛存在于自然界的典型剧毒性食源性病原体,它可穿越血脑屏障、肠道屏障及胎盘屏障,导致免疫功能低下的人群,尤其是新生儿、老年人、体质虚弱、或怀孕个体发生一系列严重疾病,包括脑膜炎、脑炎、败血症、自发感染性流产等,病死率高达20%~30%。单增李斯特菌主要通过其毒力因子内化素或溶血素O等侵入并感染宿主细胞。在感染过程中,单增李斯特菌能够引发免疫细胞之间一系列复杂的相互作用,并导致感染部位发生炎症反应。我们对单增李斯特菌感染导致炎症反应性疾病的种类及发病机理方面的研究进展做简要综述。

单增李斯特菌InlB的原核表达与多克隆抗体制备

为了进一步研究单增李斯特菌分泌的细菌侵袭相关蛋白内化素B(InlB)的功能,试验通过原核表达载体pET-28a分别表达InlB的N36~321和C392~630,并通过Ni^2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,纯化的蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体,通过Western-blot检测单增李斯特菌InlB的表达情况。结果表明:成功构建重组表达质粒及诱导表达重组蛋白,制备的针对InlB N端和C端的多克隆抗体均能特异性检测单增李斯特菌中的InlB,但不能通过免疫荧光检测该菌表面的InlB。说明本研究制备的多克隆抗体可进一步用于研究单增李斯特菌InlB的功能。