内毒素受体TLR4基因多态性“Asp299Gly”的分型检测

目的 :建立一种用于内毒素受体 TL R4基因多态性“Asp2 99Gly”检测的方法 ,并在中国汉族人中进行该位点的检测。 方法 :以等位基因特异性 PCR原理为基础 ,在两个等位基因特异性引物的 3′端第 3位引入不配对碱基以增加特异性 ,与共同的下游引物分别构成两个 PCR反应体系。采用 PCR定点突变方法得到含和不含“Asp2 99Gly”突变位点的 DNA片段插入质粒作为标准模板 ,用以验证这一方法的鉴别效果 ,并采用 PCR- RFL P分析和测序加以验证。 结果 :该方法用于“Asp2 99Gly”检测的结果 ,与 PCR- RFL P分析的结果及测序的结果完全相符 ,采用我们建立的已知基因型的突变型和野生型重组质粒作模板验证 ,结果也完全相符。采用该方法共检测 92份汉族人群 DNA样本 ,未发现“Asp2 99Gly”的携带者。结论 :以等位基因特异性 PCR原理为基础的检测方法 ,是一种可用于 TL R4基因多态性“Asp2 99Gly”检测的简便、快速、准确、适合于一般实验室的好方法。中国汉族人群携带这一突变的基因频率可能很低。

连续血液净化对MODS患者内毒素受体及其信号传导的影响

目的探讨连续性血液净化对MODS患者内毒素受体及其信号转导的影响。方法30例MODS患者随机分为低容量组和高容量组,分别检测治疗前、治疗后6h、1天、3天血浆TNF-α、IL-6水平,并观察血液净化治疗前后中性粒细胞(PMN)的CD14mRNA、CD14蛋白表达以及NF-κB活性改变。结果血液净化对血浆TNF-α无影响,IL-6水平较治疗前明显降低(P<0.05);MODS患者PMN膜CD14mRNA表达、PMN膜CD14蛋白表达、NF-κB活性经血液净化治疗后明显降低(P<0.01)。结论连续性血液净化能够削弱MODS患者内毒素受体表达及其信号转导。

创伤弧菌脓毒症大鼠肺组织内毒素受体CD14的基因表达及抗菌药物的干预效应

目的探讨创伤弧菌脓毒症大鼠肺组织内毒素受体CD14的基因表达以及头孢哌酮钠和乳酸左旋氧氟沙星联合抗炎治疗对其的干预效应。方法清洁级雄性SD大鼠随机分为11组。第1组：正常对照组（NC组）；第2～6组：创伤弧菌脓毒症组（VV组），于注射创伤弧菌后不同时点活杀；第7～11组：创伤弧菌脓毒症联合抗炎治疗干预纽（AA组），注射创伤弧菌后6h予腹腔注射头孢哌酮钠和乳酸左旋氧氟沙星，在注射创伤弧菌后不同时点活杀。尤菌取部分肺组织，采用RT—PCR法测定各组CD14mRNA的表达量。比较各组CD14mRNA的表达量。结果VV组各组大鼠肺组织CD14mRNA表达量均明显高于NC组（均P〈0．05）；AA组大鼠染菌后肺组织CD14mRNA表达量呈逐渐降低趋势，与同时点的VV组相比，AA组大鼠肺组织CD14mRNA表达量均明显降低（均P〈0．05）。结论创伤弧菌脓毒症大鼠肺组织CD14mRNA表达量明显增高，及早使用头孢哌酮钠和乳酸左旋氧氟沙星可明显减低创伤弧菌脓毒症大鼠肺组织CD14mRNA的表达水平，有利于抑制炎症反应。

亚低温对心跳骤停大鼠内毒素受体的影响

目的:研究心跳骤停大鼠内毒素受体的变化及亚低温对其影响。方法:建立大鼠心跳骤停模型,SD大鼠24只,随机分为3组:对照组、常规心肺复苏组、亚低温心肺复苏组,每组8只;三组大鼠分别在手术或复苏后24 h静脉注射3 mg/Kg LPS;并于手术或复苏后6 h、12 h、24 h,及注射LPS后1.5 h、3 h、6 h静脉取血;采用ELISA法,测定血浆可溶性内毒素受体CD14(sCD14)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量;免疫组织化学法测定注射LPS后6 h左肺肺泡及肺间质巨噬细胞表面内毒素受体CD14(mCD14)蛋白表达;观察肺组织病理改变。结果:与对照组比较,复苏组在复苏和注射LPS后血浆sCD14水平明显升高,但亚低温组低于常规组(P<0.05);注射LPS后,各组TNF-α水平均增高,且与sCD14水平成正相关(r=0.92,P<0.01);常规组肺泡巨噬细胞mCD14表达明显高于亚低温组(P<0.01);常规组肺损伤评分也大于亚低温组(P<0.05)。结论:心肺复苏后大鼠存在内毒素受体的上调,伴随着对内毒素敏感性的增强;亚低温对其有抑制作用,减轻复苏后内毒素对肺的损害。

内毒素结合蛋白与内毒素受体

肠源性内毒素血症时,细茵内毒素（Lipopofgsaachridc,LPS）刺激活化单核/巨噬细胞系统,产生多种炎性介质的瀑布效应,使机体处于一种自身无法控制混乱状态。因此,了解内毒素刺激单核/巨噬细胞活化机制,阐明其病生理过程,对开发治疗药物具有重要意义。下面我们将近年来这方面的研究情况进行综述。

内毒素受体基因多态性与脓毒症

脓毒症是临床危重患者的主要死亡原因之一,已成为现代危重病医学亟待解决的重大难题。以往脓毒症的不良预后一直归结为诊断错误或不及时,以及抗炎治疗不充分,现在人们认识到脓毒症临床表型及治疗反应不同与其遗传基因背景的差异可能有内在联系。免疫相关基因多态性(ppl-ymorphism)

内毒素受体及抗内毒素的研究进展

内毒素,又称脂多糖,是构成大多数革兰氏阴性细菌外膜外层的主要成分。内毒素的作用蛋白是抗内毒素药物开发的潜在靶点,跟踪最新的文献报道,对内毒素的受体结合蛋白进行分类总结,同时对当前抗内毒素治疗的途径进行归纳总结,给抗内毒素药物的开发带来一定的启示。

人肠粘膜上皮细胞三种内毒素受体的表达

目的研究人肠粘膜上皮细胞内毒素信号转导相关受体TLR4,CD14和MD2的表达特点,探讨其与人肠粘膜上皮细胞耐受内毒素的关系。方法以内毒素刺激的THP1细胞作为阳性对照,用免疫组化方法检测人正常肠粘膜上皮细胞TLR4、CD14和MD2的表达。结果人小肠和结肠粘膜上皮细胞TLR4、CD14和MD2均不表达。结论人正常肠粘膜上皮细胞不表达TLR4、CD14和MD2,可能是其耐受LPS的关键机制之一。

凉血解毒方干预慢性重型肝炎疗效及内毒素受体通路研究

目的:观察凉血解毒方干预慢性重型肝炎的临床疗效及对内毒素受体通路的干预作用。方法:选取慢性重型肝炎患者58例,随机分为对照组(基础治疗组)30例和观察组(基础治疗+凉血解毒方)28例,疗程2周,共2个疗程。观察治疗前后症状积分、血清学变化、治疗后总有效率,同时观察两组患者的血浆内毒素水平、可溶性CD14 sCD14水平、测定Toll样受体4基因(TLR4 mRNA)水平。结果:观察组总有效率(78.6%)优于对照组(66.7%),差异有统计学意义(P<0.05);两组均可改善临床症状,改善肝功能,升高凝血酶原活动度,观察组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);两组慢性重型肝炎治疗前内毒素水平、sCD14水平、TLR4 mRNA水平比较无显著性差异,有可比性,治疗后观察组血浆内毒素水平、sCD14水平、TLR4 mRNA水平较治疗前降低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:凉血解毒方治疗慢性重型肝炎可提高临床疗效,其机制可能与干预慢性重型肝炎患者内毒素受体通路有关。

不同的通气方式对大鼠肺和肺内毒素受体CD14表达的影响

目的观察不同的通气方式对大鼠肺及对内毒素受体CD14的影响。方法将成年雄性SD大鼠随机分为4组(每组12只):自主呼吸组(R组),不给予机械通气;机械通气组(M组),潮气量(Vt)=12ml/kg,呼气末正压(PEEP)=8mmHg;保护性机械通气组(P组),Vt=6ml/kg,PEEP=0mmHg;大潮气量机械通气组(N组),Vt=40ml/kg,PEEP=0mmHg。每组中6只大鼠实验开始2h后注射50mg/kg伊万斯蓝(EB)。分别于机械通气前(基础值)及机械通气1、2、3h行动脉血气分析,实验3h结束,放血处死大鼠。测定大鼠肺病理形态学积分、肺组织湿/干重比(W/D)、支气管灌洗液(BALF)炎性细胞数、血管壁通透性。酶联免疫分析法(ELISA)测血浆肿瘤坏死因子α(TNF-α)及巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)浓度。RT-PCR测肺组织内毒素受体CD14的表达,免疫组化法测BALF单核细胞的CD14表达。结果肺病理形态学积分:R组和P组无变化,M组有轻度升高,N组明显高于M组(分别为6·0±1·6、0·7±0·8,t=8,P=0·000)。肺W/D:与R组比较,P组和M组差异无统计学意义;N组高于R组(分别为5·73±0·39、4·91±0·24,t=4·38,P=0·000)。EB:与R组比较,P组和M组差异无统计学意义;N组明显高于R组(分别为84·50±3·01、32·33±1·75,t=36·63,P=0·000)。BALF中WBC:与R组比较,P组无显著变化;M组高于R组(分别为0·83±0·12、0·59±0·62,t=4·272,P=0·02),N组明显高于R组(分别为5·68±0·45、0·59±0·62,t=26·68,P=0·000)。TNF-α在4组都没有测到。MIP-2:P组(35·4±5·3)与R组(31·5±2·4)比较,差异无统计学意义,M组(44·7±6·9)升高(t=4·382,P=0·04),N组(167·7±11·8)明显升高(t=27·779,P=0·000)。BALF中单核细胞的CD14蛋白表达和肺组织CD14基因表达:R组和P组二者表达基本一致,M组蛋白表达与R组差异无统计学意义,但基因表达升高;N组二者表达都显著升高(P=0·000)。结论常规机械通气导致大鼠肺部发生轻度损伤,并可使肺部CD14基因表达上调,但是肺部CD14蛋白表达无改变;大潮气量机械通气导致大鼠的肺部损伤,使肺部CD14表达明显上调。保护性机械通气可使大鼠肺部避免上述改变的发生。

内毒素受体Tlr4及CD14基因在脓毒症大鼠肺、肝组织中的表达及其意义

目的采用盲肠结扎穿孔(CLP)法制备脓毒症模型,探讨脓毒症时大鼠肺、肝组织内毒素受体Tlr4及CD14mRNA的改变及其意义。方法50只SD大鼠,随机分为正常对照组(10只)、CLP组(40只),CLP后24、48、72和96h处死动物,留取肺、肝、肾及空肠组织,分别检测Tlr4、CD14mRNA的表达。CLP组24、48、72和96h肺、肝组织Tlr4及CD14mRNA的表达升高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),而肾、空肠组织Tlr4及CD14mRNA的表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论提示肺、肝组织中Tlr4及CD14基因的表达改变与脓毒症的发生发展过程有密切的关系。

内毒素相关受体基因共转染肠上皮细胞最佳转染条件的探索

目的探讨内毒素(LPS)相关受体CD14、Toll样受体4(TLR4)和MD-2基因共转染人小肠上皮细胞株(HIC)的最佳转染条件。方法用核糖核酸酶保护法(RPA)检测基因转染效率,分别研究质粒DNA的量、FuGENE 6转染试剂与质粒DNA的比例、转染试剂-质粒DNA复合物与靶细胞的作用时间及培养液中血清存在与否对转染效果的影响。结果FuGENE 6转染试剂转染HIC的最佳转染条件是:每种质粒DNA的量为2.0μg(使用6 cm培养皿)、转染试剂与质粒DNA的比例为4∶1、转染试剂-质粒DNA复合物与HIC的作用时间为5 h,而培养液中血清存在与否对转染效率无明显影响。结论建立了CD14、TLR4和MD-2三种表达质粒共转染HIC的优化转染方法。

人肠上皮细胞内毒素低反应性及其机制探讨

为探讨人正常肠上皮细胞对内毒素(LPS)刺激低反应性的机制 ,用ELISA法检测LPS刺激肠上皮细胞 18h后IL 8的分泌水平 ,用RT PCR及RPA法检测肠上皮细胞LPS跨膜信号转导相关受体TLR4、TLR2、CD14和MD2mRNA的表达及LPS刺激对其表达的影响。结果表明 ,LPS刺激不能引起肠上皮细胞IL 8的分泌 ,而IL 1β刺激却能引起其分泌 ;人正常肠上皮细胞TLR4、TLR2、CD14和MD2mRNA的表达均较弱。LPS刺激后 ,TLR4、CD14和MD2mRNA表达进一步降低 ,而TLR2的表达无显著变化。说明肠上皮细胞对LPS的低反应性与细胞表面LPS相关受体低表达有一定的内在联系 ,从而进一步证实TLR4、CD14。

静脉注射脂多糖上调小鼠肺及肝CD14和Toll-like受体4表达

目的观察静脉注射脂多糖(lipopolysacchafide,LPS)致小鼠肺、肝组织及血液中LPS受体CD14、Toll-like receptor 4(TLR4)表达的变化.方法BALB/C小鼠随机分为5组,尾静脉注射LPS(7 mg/kg),分别于注后0、2、6、12和24 h取血及肺、肝组织.采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)及Western Blot法分别检测肺和肝组织中CD14和TLR4 mRNA及蛋白表达,血清CD14(sCD14)蛋白表达.结果CD14和TLR4 mRNA在肺、肝组织中固有表达,LPS可使肺组织CD14和TLR4表达明显上调(P＜0.05),高峰出现在2-6 h(P＜0.05),24 h降至基础水平;而肝组织的变化明显滞后于肺,12 h达高峰(P＜0.05),24 h仍高于基础水平(P＜0.05).蛋白的变化与mRNA基本一致.血清CD14的表达则随时间延长而增加.结论LPS进入体内可诱导肺、肝和血液中内毒素受体CD14和TLR4的表达.不同组织中内毒素受体表达的时间差异表明肺是内毒素血症中较早受损的器官,肺组织损伤可能进一步引发肝损伤.

肝纤维化过程中Toll样受体4在肝脏的表达分布及意义

目的动态观察大鼠肝纤维化过程中Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)蛋白在肝脏的表达,探讨TLR4与肝纤维化发生发展的关系。方法以四氯化碳皮下注射复制大鼠肝纤维化模型,设立正常对照组和模型1周组、2周组、4周组、6周组。常规HE染色和天狼猩红胶原染色观察肝脏病变;检测肝组织羟脯氨酸和血浆内毒素含量;免疫组化和Western blot检测TLR4在肝组织中的表达,检测α-SMA观察活化的肝星状细胞(HSCs)。结果与正常对照组比较,CCl4作用2周时,肝组织羟脯氨酸含量开始明显增多(P<0.01);模型组各组血浆内毒素含量呈梯度上升(P<0.01),且与肝组织羟脯氨酸含量呈显著正相关关系(P<0.01);CCl4作用1周后肝组织TLR4的表达即明显增强(P<0.01),4周时和6周时有所下降(与2周组相比,P<0.05),但仍高于正常对照组(P<0.01)。TLR4阳性细胞包括枯否细胞、活化的HSCs及少量的肝细胞和内皮细胞。结论内毒素及其受体TLR4的改变可能在肝纤维化中起重要作用。