苏云金杆菌δ-内毒素基因及3′末端缺失基因在大肠杆菌和农杆菌中的亚克隆和表达

苏云金芽孢杆菌变种Bacillus thuringiensis aizawai 7-29 δ-内毒素基因及其3′末端缺失基因,亚克隆到质粒pUC19上,构建了pUCF33和pUCK63重组质粒。进一步将δ-内毒素基因及其3′端缺失基因,插入到植物表达载体pBI121.2质粒中,构建了pGY61和pGYCK63重组质粒。用^(32)中标记的δ-内毒素3′末端缺失的Kpn I DNA片段的探针,与重组质粒进行DNA-DNA分子杂交,结果阳性。带有全长和3′末端缺失重组质粒,转入大肠杆菌HB101和农杆菌LA4404受体细胞中,其克隆子细胞抽提物,对大菜粉蝶和玉米螟幼虫均具有杀虫生物活性。结果证明δ-内毒素基因不仅能在大肠杆菌HB101中,而且能在农杆菌LA4404中表达。

苏云金芽孢杆菌δ-内毒素基因穿梭质粒的构建

在农业生产中长期使用化学农药已对环境和生态平衡造成一定破坏作用,同时有不少害虫也逐渐产生抗药性从而引起某些害虫的大流行,给农业生产带来巨大损失。应用苏云金杆菌杀虫蛋白基因(Bt基因)可构建具有抗虫作用的抗虫工程菌,这样通过拌种或植物叶面喷雾可达到快速、经济、有效的防治虫害的目的。国际上抗虫工程菌研究应用很快,如美国将BI基因转入到一种正常情况下定居在植物组织中的棒杆菌,将这种工程菌拌玉米种子,这样随植物生长该菌在植物体内大量繁殖,当玉米螟在茎和叶取食时,即因食用表达苏云金杆菌毒蛋白的工程菌而死亡。 田颖川等已克隆了苏云金芽孢杆菌内毒素基因CryIA(b)和CryIA(c)。本文将Bt基因CryIA(c)插入到大肠-枯草穿梭载体pBE-2中构建成Bt毒蛋白基因穿梭质粒pAMY,利用电穿孔法转人大肠杆菌DH5a,枯草芽孢杆菌B.subtilis BR151,IA511,野生型蜡状芽孢杆菌B.cereusa-47,短芽孢杆菌B.brevis A-5和枯草芽孢杆菌90-8,获得了具有较高杀虫活性的工程菌克隆。

用昆虫病毒转移载体在大肠杆菌中表达苏芸金杆菌δ-内毒素基因

从八十年代初开始用昆虫核型多角体病毒(NPV)的多角体蛋白基因(ocu)构建转移载体以来,陆续表达了几十种外源基因。我们曾用大尺蠖核多角体病毒(BsNPV)的ocu基因构建了转移载体。

杀鞘翅目幼虫Bt菌株YM-03的δ-内毒素基因定位

苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）的morrisoni亚种YM－03（8a8b）是本实验室分离的对鞘翅目幼虫有高毒力的菌株。经PCR产物分析它含有cry3A基因，产生68ku的毒素蛋白。经质粒图谱分析，该菌株含有3个质粒，其大小分别为83，72，9Mu。以cry3A基因的PCR产物片段为模板标记探针，与YM－03总DNA杂交，结果显示该菌的δ－内毒素基因定位于染色体上，有望构建出稳定遗传的广谱工程菌。

转δ-内毒素基因棉与药剂对斜纹夜蛾活性的协同作用

[目的]为斜纹夜蛾的综合治理提供科学依据。[方法]以转δ-内毒素基因棉(苏抗103)和普通棉花(苏棉12)为材料,比较了两种棉花与4种药剂配合饲喂对斜纹夜蛾生长发育及其对化学药剂敏感性的影响。[结果]连续饲养3代后的斜纹夜蛾3龄幼虫对氰戊菊酯、灭多威、敌百虫、Bt可湿粉的敏感性,用苏抗103饲喂的是用苏棉12的0.54、0.610、.80、0.48倍,幼虫用苏抗103浸渍药剂饲喂及用苏棉12浸渍药剂饲喂,前者比后者对药剂的敏感性增强。与取食苏棉12相比,取食苏抗103的斜纹夜蛾幼虫。存活率降低了30%,幼虫期延长了9.6 d,龄数由6龄增加到8龄,且体内乙酰胆碱酯酶及羧酸酯酶的比活力明显提高。[结论]苏抗103与化学药剂配合使用后使得斜纹夜蛾的敏感性增强。

Ti质粒介导的B、t、k-δ内毒素蛋白基因转化大豆的初步研究

以Ｔｉ质粒为介导，将ｐＫＴ５４Ｂ７Ｃ５质粒上的Ｂ、ｔ、ｋ－δ内毒素蛋白基因导入东北大豆“黑农３７”、“黑农３９”等品种。采用多种外植体和感染方法，从胚轴和子叶节诱导出丛生芽与再生植株。经卡那霉素筛选和冠瘿碱检测，初步证明外源基因导入大豆基因组中。共获得８１株再生植株，其中成活３０株，仅３株结７个荚，得到７粒种子。ＰＣＲ检测和ＤＮＡ分子杂交，鉴定这７株再生植株呈阳性反应，证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组中。７粒种子均已萌发。

苏云金杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞及转基因植株再生的研究

以葡萄的胚性愈伤组织作为农杆菌介导,Ti质粒转化材料,利用共培养法将苏云金杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞,通过胚状体发生途径再生转基因植株。实验发现:80μmol/L的乙酰丁香酮诱导处理农杆菌和葡萄愈伤组织后可将转化效率提高50倍。OD值为0.8的农杆菌菌液稀释8—10信后与在G培养基预培养10天的胚性愈伤组织共培养2—3夭,Ti质粒对葡萄愈伤组织细胞的转化效率可达50%左右。筛选得到的转基因植株在含Km 30 mg/L的选择培养基上继代存活6个月,生长正常;提取叶片染色体DNA做Southern blot,杂交结果为阳性。将转基因植株各部分切段置于含Km 50 mg/L的选择培养基上,能够脱分化产生抗性愈伤组织并能增殖。

苏芸金芽孢杆菌kurstaki HD-1变种δ内毒素基因在大肠杆菌中表达

1987年Vaeck和Fischpoff分别将苏芸金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis简称B.t.)的δ内毒素基因转移至烟草及番茄中,得到了转基因植株,表达出δ内毒素对烟青虫等鳞翅目害虫作用。从此,植物杀虫基因工程的研究进入了一个新的阶段。 B.t.kurstaki HD-1菌株是一个毒杀鳞翅目害虫的优良菌株,在中国早已应用于B.t.菌剂的生产,对于防治蔬菜、玉米、棉花、松树等鳞翅目害虫效果显著。

遗传工程与害虫防治

遗传工程在害虫防治上有巨大的应用潜力,例如可以通过遗传工程技术来改善天敌的有益性或者增加对害虫有毒杀、拒避等作用的生理活性物质的生产,提高生物防治的作用。