耐高温重组CotA蛋白的胆红素氧化酶反应动力学及活性鉴定（英文）

已知源于枯草芽孢杆菌内生孢子的Cot A蛋白具有漆酶和胆红素氧化酶活性。然而,其分离纯化极为困难。本研究对表达与纯化的重组Cot A蛋白的胆红素氧化酶特性及氧化还原功能进行鉴定。基因转染及筛选获得了表达Cot A的P.pastoris菌株;继而,表达的重组Cot A蛋白经DEAESepharose FF及Sephadex G-75层析分离与纯化,产物得率为25%,纯化产物的酶比活性为4 U/mg。经SDS-PAGE和MALDI-TOF MS分析显示,其分子质量为65 k D。纯化的Cot A蛋白能够催化胆红素氧化,生成胆绿素,且催化反应速率受反应溶液中溶解氧含量的影响,提示纯化的重组CotA具有胆红素氧化酶活性。酶反应进一步证明,Cot A的胆红素氧化酶反应最适p H值为p H 8.0,最适温度为60℃。该酶在90℃条件下的半衰期为7 h,提示Cot A胆红素氧化酶具有高度的热稳定性。Cot A修饰的摄谱仪石墨电极可直接电催化分子氧(O2)还原,具有很好的电流响应。我们的结果表明,重组的Cot A蛋白具有耐高温胆红素氧化酶活性。更重要的是,我们的结果还提示重组的Cot A蛋白在酶生物燃料电池阴极的制备上具有较好的应用潜能。

在大肠杆菌中表达重组CotA蛋白的培养条件优化

为了提高大肠杆菌对重组CotA蛋白的表达量，对本实验室构建的含CotA基因表达载体的工程菌株的培养条件进行优化。通过单因素试验及正交试验L18（3 7）优化了产酶的最佳培养条件为：摇床转速为180r／min、装液量为100mL／500mL锥形瓶、接种量为5％、诱导温度25℃、诱导剂IPTG浓度为1．0mmol／L、诱导时间为12h，以及加诱导剂时菌体OD600值为1．0，其中诱导剂IPTG浓度和菌体OD600值对CotA蛋白表达影响显著。

产漆酶细菌研究方法进展

该文结合作者实验室Bacillus.subtilis WD23的研究情况,综述了产漆酶细菌的筛选方法、细菌菌种鉴定方法、细菌漆酶酶学性质研究方法及细菌漆酶应用的研究方法进展。

短小芽孢杆菌漆酶基因的克隆表达及重组漆酶降解黄曲霉毒素M_1研究

为明确短小芽孢杆菌Cot A漆酶的酶学性质,探究其在黄曲霉毒素M_1降解中的应用潜力。经分析,短小芽孢杆菌E-1-1-1中cotA基因全长1 486 bp,编码495个氨基酸,无信号肽序列,分子质量约为58 kDa。该重组漆酶最适反应温度为40℃,最适pH 4.0;K_m为3.01 mmol/L,V_(max)为0.795 mmol/(L·min);金属离子和化学试剂会对酶活力造成不同程度影响,K^+、Na^+、乙醇和十二烷基硫酸钠对该酶有明显的抑制作用,抑制率分别为31.0%、13.6%、64.5%和100%,而Mn^(2+)和Zn^(2+)则表现出明显的促进作用,酶活力分别提高了33.0%和23.9%;该酶与牛奶中的黄曲霉毒素M_1反应72 h后,黄曲霉毒素M_1降解率为54.3%,毒性降低9.1%。结果表明,短小芽孢杆菌CotA漆酶作为黄曲霉毒素M_1降解酶具有巨大的应用潜力。