内生解淀粉芽孢杆菌TB2液体发酵条件的研究

采用单因素试验和正交试验对具有广谱拮抗作用的内生解淀粉芽孢杆菌TB2菌株的摇瓶发酵培养基和发酵条件进行优化。结果表明,最佳培养基组份为:玉米淀粉1.0%、豆粉1.0%、(NH4)2SO40.5%、MgSO4·7H2O0.1%、FeSO4·7H2O0.03%、K2HPO4·3H2O0.02%、KH2PO40.01%;培养条件为:初始pH值为7.5,温度35℃,接种量3%,装液量50mL/250mL三角瓶,摇床转速200r/min,发酵周期22～26h。优化条件下发酵水平活菌数达到8.52×1010cfu/mL。

内生解淀粉芽孢杆菌TB2菌株活性物质诱导辣椒果抗疫病的生化机理

利用内生解淀粉芽孢杆菌TB2菌株的活性物质喷施辣椒果后0、24、48、72 h接种辣椒疫霉病菌进行防治辣椒疫病试验,结果表明,TB2菌株的活性物质对辣椒果疫病的发生有一定控制作用,活性物质处理间隔24 h后再接种病菌,其防病效果得到显著提高。生化机制研究表明,TB2的活性物质处理可使辣椒果的可溶性蛋白含量、丙二(MDA)含量、超氧阴离子自由基(O.-2)产生速率及过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性发生显著变化。病菌处理的辣椒果,可溶性蛋白含量、MDA含量和O.-2产生速率及POD、SOD、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸氨解酶(PAL)活性均会显著升高,且其最大值高于活性物质处理果的相应最大值。活性物质和病菌共同处理的辣椒果,POD和PAL的活性可上升到高于病菌单独处理的峰值,但MDA含量和O.-2产生速率及SOD和CAT活性均较低,与对照的接近,表现出相对稳定状态。由此推断,TB2的活性物质诱导辣椒果抗疫病与POD、PAL等酶的活性相关。

内生解淀粉芽孢杆菌TB2内切β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆和原核表达分析

以内生解淀粉芽孢杆菌TB2菌株基因组为模板,克隆了该菌的β-1,4-内切葡聚糖酶基因的ORF。测序结果表明该ORF全长1 500 bp,编码499个氨基酸,分子量为55.07 ku,等电点为7.83。Blast同源性分析结果表明,该序列与GenBank登录的1株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis M28332)纤维素酶核苷酸序列的同源性最高(98%),其氨基酸同源性也达98%,已被GenBank收录(Accession number)。用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切目的片段和表达载体pET-29a(+)后相连接,构建重组表达载体pET-glu,并导入BL21细菌中表达。酶学特性表明:SDS-PAGE电泳在59 ku左右有融合蛋白带,该酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.4,为中性纤维素酶。实验结果为进一步研究内生解淀粉芽孢杆菌TB2纤维素酶的功能和应用打下了基础。

1株植物内生菌解淀粉芽孢杆菌的安全性评价

试验旨在评价1株从杜仲中分离的解淀粉芽孢杆菌的安全性。试验从菌株溶血性、氨基酸脱羧和明胶液化试验、抗菌药物敏感性、腹腔注射、经口灌胃、抑菌活性等进行安全性综合评价。腹腔注射试验分为腹腔注射组(1.0×10^(10)CFU/0.3 mL)和生理盐水组,一次性注射,连续观察5 d。经口灌胃试验分为高剂量组(1.0×10^(10)CFU/0.2 mL)、中剂量组(1.0×10^(9)CFU/0.2 mL)、低剂量组(1.0×10^(8)CFU/0.2 mL)和生理盐水组,每天灌胃1次,连续灌胃28 d。结果显示,腹腔注射和经口灌胃小鼠均健康存活,未见临床变化,试验期间体重正常增加,各组小鼠血常规、血清生化指标和脏器指数差异均不显著(P>0.05),解淀粉芽孢杆菌DZ01未发生易位,氨基酸脱羧和明胶液化试验均为阴性。解淀粉芽孢杆菌DZ01对所测的8种抗菌药物均表现敏感。除粪肠球菌和铜绿假单胞菌外,解淀粉芽孢杆菌DZ01上清液对其余6株指示菌均具有抑菌活性。研究表明,解淀粉芽孢杆菌DZ01具有较好的安全性。

内生芽孢杆菌TB2防治辣椒疫病效果及其机理初探

内生芽孢杆菌(Bacillus sp.)TB2对辣椒疫霉(Phytophthora capsici)引起的辣椒苗和果疫病有良好的防治效果,菌液浸种处理的苗接种病菌后20 d防病效果可达70.0％;菌液浇灌后48 h的苗接种病菌后20 d防病效果可达88.1％;菌液喷雾处理的果接种病菌后14 d防病效果可达65.2％。喷雾或浇灌菌株培养液后间隔24 h以上接种病原菌的防病效果比二者同时接种时高。生防菌菌体及其胞外分泌物均有防病作用,其胞外分泌物的速效性较好,菌体的持效性较好。菌株胞外分泌物对病菌菌丝生长、孢子囊形成和游动孢子释放均有明显的抑制作用。菌液可诱导植物抗性相关酶的变化,但其与病菌共同接种于辣椒时诱导作用可相互影响。疫霉菌处理可使辣椒果的丙二醛(MDA)含量和过氧化物酶(POD)、超氧化歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性出现明显的峰值;菌液处理可诱导辣椒SOD和POD活性增强;但菌液与病菌共同处理后,辣椒果的MDA含量和SOD、POD、CAT的活性均较低,与清水对照接近,表现出一种相对稳定的状态。

内生解淀粉芽孢杆菌CC09在小麦根部定殖的电镜观察及防病效果

采用抗利福平标记菌株的平板菌落计数法,检测了内生解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens CC09在小麦根部的定殖能力及消长动态,发现菌株CC09在小麦根内、根表和根际均能定殖,接种后5 d定殖量分别稳定维持在2.7×105、2.0×105和5.5×105 cfu/g。透射电镜观察发现,菌株CC09能够在小麦根组织的皮层细胞、细胞间隙、中柱鞘及髓腔中定殖,且不影响根组织细胞结构。室内盆栽试验表明,用菌株CC09发酵液灌根处理小麦,对由禾谷镰刀菌Fusarium graminearum侵染引起的麦苗赤霉病的防效高达90.7%,表明菌株CC09是潜在的防治小麦赤霉病的生防菌,具有良好的开发和应用价值。

复合肥和解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2对云南松苗木生长的影响

采用L9(34)正交试验设计进行云南松苗木培育的施复合肥和解淀粉芽孢杆菌菌株B9601-Y2(Y2菌株)浸种2因素3水平的试验,分别在苗龄60、130和200 d时测定苗木生长量及生物量,探究施复合肥和Y2菌株对此阶段云南松苗木生长的影响。结果表明,3个苗龄阶段苗高最高的是施复合肥44 g·m-2与Y2菌株6.4×105CFU·mL-1浸种的组合,分别达4.66、6.90和9.48 cm。影响地径和苗高的关键因子是施肥,实际综合的因素水平最优组合为44 g·m-2复合肥和6.4×105CFU·mL-1Y2菌株浸种的组合。方差分析结果表明,施复合肥和Y2菌株浸种的交互作用显著地影响苗木地径的生长(P=0.015-0.020<0.05),施肥对130和200 d的苗高具有极显著的差异影响(P≈0.000<0.01)。

解淀粉芽孢杆菌BI_2抗真菌活性物质的分离纯化及特性分析

从秸秆饲料中分离得到一株解淀粉芽孢杆菌BI2,它对黄曲霉具有较强的拮抗作用。发酵液经过离心、膜过滤和离子交换法得到粗提物。粗提物对温度不敏感,100℃加热30min,活性损失25.8%;在弱酸性、中性及碱性条件下都具有较好的稳定性,并且对木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感。粗提物经过中低压制备色谱得到单一化合物,经质谱分析测定分子量为436.2052u。采用微孔法测得该抗真菌物质的最小抑菌浓度为7.8μg/mL。

解淀粉芽孢杆菌BI_2产抑菌物质的新型种衣剂的研制

将解淀粉芽孢杆菌BI2发酵所产抑菌物质作为新型种衣剂的有效成分与研制的复合型成膜剂溶液混合,制成可抑制黄曲霉孢子萌发的花生种子包衣.结果表明,选用4%,聚乙烯醇(PVA)与1.5%,羧甲基纤维素钠(CMC-Na)以体积比5∶1混合作为种子包衣最佳成膜剂配方,经过包衣后对花生种子的发芽势和发芽率没有显著影响.含有抑菌物质的发酵液冻干粉的p H稳定性和热稳定性均较好.发酵液冻干粉抑制黄曲霉孢子萌发的最小质量浓度为1.92,mg/m L.在与花生种子混合时,发酵液冻干粉在成膜剂中的含量达到4,mg/m L时,黄曲霉完全被抑制.

紫花苜蓿内生解淀粉芽孢杆菌Ba09的分离及防效研究

从紫花苜蓿内分离得到一株内生菌Ba09,通过菌株形态观察和16SrRNA序列分析,确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。对峙培养显示Ba09菌株对炭疽菌、链格孢菌和镰刀菌均有较好的拮抗作用,抑制率分别达到77.19%、73.62%和43.11%。显微观察显示,对峙培养过程中,供试病原菌的菌丝生长受抑制并出现扭曲、顶端呈球状膨大现象。结果表明,Ba09菌株对多种病原菌具有良好的拮抗效果,在紫花苜蓿病害防治方面具有一定的应用潜力。

绿色荧光蛋白基因转化内生解淀粉芽孢杆菌的研究

通过重叠延申法将枯草芽孢杆菌的启动子PSJ2与绿色荧光蛋白基因(gfp)的ORF连接起来,构建绿色荧光蛋白表达盒,再通过RcoR I和PstI双酶切将表达盒连接到pUS186载体上,转化解淀粉芽孢杆菌TB2菌株,得到可发出绿色荧光工程菌,工程菌对黄瓜枯萎病菌的拮抗作用与野生菌株相当。

渔源解淀粉芽孢杆菌CQN-2菌株培养基及发酵条件优化

CQN-2是一株具有抗病、促生长等多种功能的肠道内源性解淀粉芽孢杆菌。为研究其最佳培养条件,从而为规模化生产发酵提供依据,本文以菌体生物量为指标,采用单因素试验和正交试验对CQN-2菌株的最适培养基及发酵条件进行优化。结果表明,CQN-2菌株的最适碳源为可溶性淀粉,最适氮源为细菌学蛋白胨,经优化后的最佳培养基配方为可溶性淀粉20 g/L、细菌学蛋白胨30 g/L、糖蜜50 g/L、KH 2 PO 40.5 g/L、MgSO 40.5 g/L、NaCl 0.3 g/L、Mn^2+5 mmol/L、Al 3+1 mmol/L;最佳发酵培养条件为初始pH值7.0,接种量为3%、装液接种量25 mL/250 mL;使用优化后的培养基将CQN-2接种于5 L发酵罐进行高密度发酵培养36 h后的活菌数为3.03×10^12 CFU/mL。

解淀粉芽孢杆菌ES-2对肉鸡屠宰性能和肉品质及肌肉抗氧化能力的影响

[目的]研究日粮中添加解淀粉芽孢杆菌ES-2(BAP)对肉鸡屠宰性能、肉品质及肌肉抗氧化能力的影响。[方法]选用1日龄AA(Arbor Acres)肉鸡600只,随机分成5组:对照组、抗生素组、试验Ⅰ、试验Ⅱ和试验Ⅲ组。对照组饲喂基础日粮;抗生素组添加45 mg·kg^(-1)金霉素;试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组分别添加200、500和1 000 mg·kg^(-1)的BAP,每组6个重复,试验期42 d。[结果]与对照组相比,500和1 000 mg·kg^(-1)的BAP可显著提高肉鸡胸肌率,且500 mg·kg^(-1)的BAP可显著降低腹脂率(P<0.05)。BAP主要影响胸肌的肉品质,500和1 000 mg·kg^(-1)剂量组宰后24 h胸肌的p H值较对照组显著提高(P<0.05);日粮中添加抗生素及500 mg·kg^(-1)的BAP均能显著降低胸肌压力损失(P<0.05)。500和1 000 mg·kg^(-1)剂量组及抗生素组胸肌总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性较对照组显著提高(P<0.05)。另外,日粮中添加500和1 000 mg·kg^(-1)的BAP可显著提高胸肌总抗氧化能力(T-AOC)水平,其中500 mg·kg^(-1)剂量组胸肌T-AOC水平要显著高于200 mg·kg^(-1)剂量组;500mg·kg^(-1)剂量组及抗生素组肉鸡腿肌T-AOC水平较对照组显著提高(P<0.05)。[结论]日粮中添加500和1 000 mg·kg^(-1)的解淀粉芽孢杆菌ES-2均可在一定程度提高肉鸡屠宰性能,增强胸肌宰后24 h的p H值,提高肌肉T-AOC水平和T-SOD活力,增强宰后肌肉的抗氧化能力,且以添加500 mg·kg^(-1)的解淀粉芽孢杆菌ES-2剂量效果较好。解淀粉芽孢杆菌ES-2替代抗生素在肉鸡饲粮中应用具有可行性。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)D2WM发酵培养基优化及对蔬菜种子萌发的影响

为提高一株抗蔬菜软腐病菌菊迪基氏菌(Dickeya chrysanthemi)的生防菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) D2WM的抑菌效果,首先对解淀粉芽孢杆菌D2WM发酵培养基进行单因素试验,确定最适碳源、氮源和无机盐,再通过Box-Behnken法设计3因素3水平试验确定最优发酵条件,在此基础上以种子萌发率、根长、芽长、鲜质量为指标,分析解淀粉芽孢杆菌D2WM发酵液对8种蔬菜种子萌发的影响。结果表明,解淀粉芽孢杆菌D2WM最优培养基配方为蔗糖28.25 g·L^(-1)、黄豆粉6.46 g·L^(-1)、七水硫酸镁0.04 g·L^(-1),优化后对菊迪基氏菌的抑菌率平均达到99.98%,比优化前提高了25.51%;该菌株可使娃娃菜、紫菜薹、榨菜、快菜、白菜、油麦菜、萝卜、莴苣的发芽率分别提高了21.7、16.7、1.7、6.7、10、10、1.7、13.3个百分点;除快菜和莴苣外,其他6种蔬菜的鲜质量都有所增加,但对莴苣的根系有促进作用;该菌株对娃娃菜的根长,以及对快菜、白菜和莴苣的芽长有抑制作用。

菊迪基氏菌生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM抑菌物质防治效果评价及药剂筛选

采用单因素试验方法优化生防菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)D2WM抑菌物质的提取效率,并对抑菌物质粗提取的储藏特性展开研究,同时利用市售药剂对菊迪基氏菌(Dickeya chrysanthemi)进行室内药剂筛选,对比生防菌剂与市售药剂的防治效果。结果表明,通过单因素优化提取生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM中的抑菌物质,发现最佳提取溶剂为正丁醇,有机溶剂与发酵液体积比为1∶7、提取时间为0.5 h;抑菌物质具有良好的热稳定性和紫外光照稳定性,在处理温度达100℃,紫外光照射12 h时,抑菌效果均没有显著性下降,抑菌圈仍有23 mm;当抑菌物质储存180 d后,抑菌圈大小仍有16.33 mm。生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM粗提物对黑腐果胶杆菌、胡萝卜软腐果胶杆菌、菊迪基氏菌、丁香假单胞菌和黄单胞菌等植物病原菌均有良好的抑菌效果。测定的19种药剂中对菊迪基氏菌有良好抑制作用的仅有新田秀才6号、中生菌素、噻霉酮和氯溴异氰尿酸4种;其中,以生防菌解淀粉芽孢杆菌D2WM粗提物作为对照药剂,发现其抑菌效果高于噻霉酮和氯溴异氰尿酸。

解淀粉芽孢杆菌HZ-6-3的筛选鉴定及其防治番茄灰霉病效果的评价

采用平板对峙法,从银杏组织分离的内生细菌菌株中筛选对灰葡萄孢菌抑菌活性较好的菌株,其中菌株HZ-6-3的抑制作用最强,抑制率为79.06%。通过菌落形态观察、生理生化特征、16S rRNA基因序列和gyrA基因分析将菌株HZ-6-3鉴定为解淀粉芽孢杆菌。抑菌谱测定结果显示,该菌株对其他8种植物病原真菌均具有不同程度的拮抗作用。该菌株可产生蛋白酶、果胶酶、β-1,3-葡聚糖酶和淀粉酶;能够显著抑制病原菌的菌丝生长,使菌丝生长扭曲,细胞膨大、形成串状泡囊结构等畸变。利用盆栽试验测定了该菌株对番茄灰霉病的防控效果,结果显示1×108 CFU·mL^-1的预防效果和治疗效果最高,可达81.12%和70.45%。上述结果显示菌株HZ-6-3具有作为生物制剂的潜能。

内生解淀粉芽孢杆菌L-4-3发酵条件的优化

为了获得内生解淀粉芽孢杆菌L-4-3最大发酵生物量,通过单因素试验和正交试验对内生解淀粉芽孢杆菌L-4-3的培养基和培养条件进行了优化。结果表明:内生解淀粉芽孢杆菌L-4-3的最佳培养基配方为甘露醇10.0 g/L、淀粉20.0 g/L、酵母粉2.0 g/L、黄豆粉1.0 g/L、KHPO4.0 g/L、NaCl 4.0 g/L、MgSO·7HO 3.0 g/L;发酵培养的最佳条件为初始pH值7.2,装液量8%(500 mL三角瓶装液40 mL),接种量2.0 %,温度32℃,转速180 r/min,时间68 h。经50 L发酵罐验证,优化后的发酵活菌数达到20.8×10^(8) CFU/mL。

解淀粉芽孢杆菌菌剂对雪菜生长和土壤氧化亚氮排放的影响

由于化肥的过度使用对环境的不利影响,微生物肥料的研究得到了广泛关注。实验利用甘薯淀粉废水培养解淀粉芽孢杆菌并将其作为微生物肥料用于雪菜种植。通过盆栽实验考察了尿素（CN）、解淀粉芽孢杆菌菌液（BF）、解淀粉芽孢杆菌灭活菌液（BI）、甘薯淀粉废水（SW）、尿素结合微生物肥料（BC）对蔬菜产量、NO3-、NO2-含量,以及土壤性状,N2O排放的影响。实验表明：BC和CN在蔬菜产量方面比CK提高了5倍。BF和SW对蔬菜产量影响不显著。半量氮肥配合菌肥处理（BCL）表现出与CN相近的增产效果,而蔬菜NO3-含量同CN处理相比下降了16.4%-73.6%,土壤NO3-含量降低了22%-29%,降低了土壤中氮淋溶风险;土壤N2O平均排放通量（FLUX30）较CN处理降低了58.3%-73.1%。综上,利用淀粉废水培养解淀粉芽孢杆菌不仅可以资源化利用废水,并且其产物可作为一种绿色肥料应用于蔬菜种植,为淀粉废水资源化利用和农田温室气体减排提供了一个新思路。

解淀粉芽孢杆菌菌剂对雪菜生长和土壤氧化亚氮排放的影响（英文）

由于化肥的过度使用对环境的不利影响，微生物肥料的研究得到了广泛关注。实验利用甘薯淀粉废水培养解淀粉芽孢杆菌并将其作为微生物肥料用于雪菜种植。通过盆栽实验考察了尿素（CN）、解淀粉芽孢杆菌菌液（BF）、解淀粉芽孢杆菌灭活菌液（BI）、甘薯淀粉废水（SW）、尿素结合微生物肥料（BC）对蔬菜产量、NO3-、NO2-含量，以及土壤性状， N2O排放的影响。试验表明：BC和 CN在蔬菜产量方面比CK提高了5倍。BF和 SW对蔬菜产量影响不显著。半量氮肥配合菌肥处理（BCL）表现出与 CN相近的增产效果，而蔬菜 NO3-含量同 CN处理相比下降了16.4%~73.6%，土壤NO3-含量降低了22%~29%，降低了土壤中氮淋溶风险；土壤 N2O（FPV30）平均排放量较 CN处理降低了58.3%~73.1%。综上，利用淀粉废水培养解淀粉芽孢杆菌不仅可以资源化利用废水，并且其产物可作为一种绿色肥料应用于蔬菜种植，为淀粉废水资源化利用和农田温室气体减排提供了一个新思路。

解淀粉芽孢杆菌G9R-3脂肽类化合物抑制香蕉枯萎病菌机理及防效评价

[目的]G9R-3是从抗病香蕉品种“桂蕉9号”健康植株根部中分离得到的一株具有较强抑制香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4,Foc4)活性的内生解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。开展其脂肽类化合物抑制香蕉枯萎病菌活性机理及防效评价研究,为利用该菌株大田防控香蕉枯萎病提供参考。[方法]结合基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析脂肽类化合物类型,采用Landy培养基发酵并使用大孔树脂抽提法提取菌株脂肽类物质,结合室内平板、台盼蓝染色、盆栽灌根接种进行活性检测与防效评价。[结果]该菌株产生的脂肽类化合物种类包括表面活性素Surfactin、泛革素Fengycin和伊枯草菌素iturins 3个种类。活性检测表明,当粗提物浓度为300μg/mL时对香蕉枯萎病菌Foc4菌丝生长抑制率达58.91%,孢子萌发抑制率达69.80%。室内盆栽防效评价试验表明,浓度为1 mg·mL-1 G9R-3脂肽类粗提物香蕉枯萎病防效可达76.53%。[结论]G9R-3产生的脂肽类化合物具有防控香蕉枯萎病的潜力,其生防基质为破坏Foc4细胞膜并引起菌丝肿大和畸形,并抑制其孢子萌发。