水泡性口炎病毒对体外血管内皮屏障功能的损伤作用及其机制

目的:探讨水泡性口炎病毒(VSV)对血管内皮(VE)屏障的损伤作用,并阐明其作用机制。方法:采用犬肾细胞对VSV进行扩增,采用小鼠脑血管内皮瘤bEnd. 3细胞检测VSV的半数组织培养感染剂量(TCID_(50)),采用300倍TCID_(50)进行后续实验。将bEnd. 3细胞分为感染0 h组、感染4 h组、感染8 h组和感染12 h组,进行VSV感染损伤VE屏障实验;将bEnd. 3细胞分为对照组、感染组和纠正组,进行抑制VSV复制与VE屏障恢复实验。将bEnd. 3细胞接种于Transwell小室,构建体外VE屏障模型,采用细胞电压电阻仪检测感染VSV不同时间后各组bEnd. 3细胞中跨上皮电阻(TER),采用异硫氰酸荧光素-葡聚糖渗漏实验检测各组渗透系数,采用免疫荧光染色法观察VSV感染后各组bEnd. 3细胞骨架及黏附连接(AJs)中VE-钙黏蛋白、β-连环蛋白(β-catenin)和磷酸化β-连环蛋白(p-β-catenin)定位变化,采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组细胞中Wnt和β-catenin mRNA表达水平,采用Western blotting法检测各组细胞中Wnt、β-catenin和p-β-catenin表达水平。结果:VSV的TCID_(50)为10^(-4.5)·100μL^(-1)。Transwell小室实验检测,与感染0 h比较,其他各组细胞中TER明显降低(P<0.05),渗透系数明显升高(P<0.05)。免疫荧光染色,与对照组比较,感染组bEnd. 3细胞骨架紊乱,细胞间隙增大,AJs线性指数明显降低(P<0.05),β-catenin和p-β-catenin从细胞膜转移至细胞核周围。RT-qPCR法检测,与感染0 h比较,其他各组细胞中Wnt mRNA表达水平明显降低(P<0.05),β-catenin mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。Western blotting法检测,与感染0 h比较,其他各组细胞中Wnt蛋白表达水平明显降低(P<0.05),β-catenin表达水平差异无统计学意义(P>0.05),p-β-catenin表达水平明显升高(P<0.05)。在抑制VSV复制并纠正低密度脂蛋白受体(LDLR)异常后,Transwell小室实验检测,与感染组比较,纠正组bEnd. 3细胞中TER明显升高(P<0.05),渗透系数明显降低(P<0.05)。免疫荧光染色,与感染组比较,纠正组细胞间隙减小,细胞中β-catenin和p-β-catenin核周聚集现象有所改善。RT-qPCR法检测,与感染组比较,纠正组细胞中Wnt mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。Western blotting法检测,与感染组比较,纠正组细胞中Wnt蛋白表达水平明显升高(P<0.05),β-catenin表达水平差异无统计学意义(P>0.05),p-β-catenin表达水平明显降低(P<0.05)。结论:VSV感染后可引起LDLR失活,降低Wnt蛋白表达水平,造成β-catenin磷酸化水平升高并发生内化,破坏AJs稳定性,最终导致VE屏障损伤。

过劳诱导小鼠血管内皮屏障功能障碍

目的研究过劳对小鼠血管内皮屏障功能的影响。方法将30只KM小鼠随机分为3组(n=10):对照(CON)组、过劳2周(W2)组、过劳4周(W4)组。W2组和W4组采用水中站立+束缚实验分别连续造模2周和4周,观察小鼠一般情况。造模结束后,每组选取4只小鼠腹腔注射Evans蓝染料,检测血管通透性。另6只小鼠采取ELISA法检测血清IL-1β含量,获取动脉组织行切片观察,RT-qPCR法检测内皮细胞间紧密连接中occludin、claudin-5、ZO-1、JAM-A和黏附连接中VE-cadherin的mRNA表达水平;免疫荧光法检测内皮细胞间连接复合物中claudin-5、ZO-1、VE-cadherin和血管内皮糖萼中Syndecan-1的蛋白表达情况。结果与CON组相比,W2和W4组小鼠体质量增长缓慢,毛发脱落,活动减少。与CON组相比,W4组血管通透性明显增加。与CON组相比,W2和W4组血清IL-1β含量增加(P<0.05)。与CON组相比,W2组内皮细胞肿胀、脱落,内膜粗糙不规则,W4组出现内膜断裂现象。与CON组相比,W2组动脉组织中occludin、claudin-5、ZO-1、JAM-A的mRNA表达量增加,W4表达均降低(P<0.05);W2和W4组VE-cadherin的mRNA表达量下降(P<0.05)。与CON组相比,W4组claudin-5、ZO-1、VEcadherin和Syndecan-1蛋白表达减少(P<0.05)。结论过劳随时间的延长可对动脉内皮细胞间连接复合物以及内皮糖萼造成损伤,破坏其屏障功能,导致血管通透性增加。

血管内皮屏障功能损伤在疾病中的研究进展

许多疾病都具有血管渗漏的共同特征,内皮屏障功能损伤通常是其根本原因。内皮屏障是内皮细胞在血管腔和血管壁之间形成的独特屏障,具有选择性透过作用,对维持血管、组织和器官间的稳态至关重要。血管渗漏是由内皮细胞之间的间隙以及跨细胞转运途径的改变引起的。改善内皮屏障功能的具体机制取决于受影响的组织和引起高通透性的原因。本文综述了以内皮屏障破坏为特征的疾病,重点讨论了内皮屏障功能在急性肺损伤、缺血性脑卒中以及糖尿病并发症中的作用机制及其药物干预进展。

牙龈卟啉单胞菌在体外可破坏脐静脉内皮屏障功能:基于下调ZO-1、occludin和VE-cadherin的表达

目的 通过体外实验探讨牙龈卟啉单胞菌(P. gingivalis)破坏内皮屏障功能的分子机制。方法 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)体外培养形成屏障后,使用感染复数(MOI)100的P. gingivals感染细胞,对照组为未感染P. gingivals的HUVECs;通过跨膜电阻值(TEER),异硫氰酸荧光素(FITC)-右旋糖酐通透性实验和细菌易位实验来评估内皮屏障功能;并使用实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)和Western blot实验检测P. gingivals对构成内皮屏障结构的主要蛋白紧密连接蛋白1(ZO-1),occludin和VE-cadherin表达的影响。结果 HUVECs在接种培养后第5天,其跨膜电阻值趋于稳定,体外内皮屏障形成。与对照组相比,感染P. gingivals后0.5 h,内皮屏障功能即会发生改变,并且随着感染时间的延长,屏障功能障碍更加显著,主要表现为:跨膜电阻值下降、40 000/70 000 FITC-Dextran通透性上升以及易位细菌的数量增加;MTT结果显示P. gingivals对HUVECs的增殖能力没有影响(P>0.05);除此之外,与对照组相比,HUVECs感染P. gingivals后24和48 h后,qRT-PCR和Western blot结果显示被感染的HUVECs中ZO-1,occludin和VE-cadherin的mRNA和蛋白水平出现明显的下调表达(P<0.05)。结论 P.gingivalis可以通过下调细胞间连接蛋白ZO-1、occludin和VE-cadherin的表达破坏内皮屏障,导致内皮屏障功能障碍。

乙醛脱氢酶2改善急性肺损伤小鼠的肺内皮屏障及维持线粒体动力学平衡

目的探讨乙醛脱氢酶2(ALDH2)在脂多糖(LPS)致小鼠急性肺损伤(ALI)中的作用及潜在机制。方法60只C57BL/6J小鼠随机分为Sham组、LPS组、LPS+ALDH2激动剂Alda-1组(LPS+Alda-1)、LPS+ALDH2抑制剂Daidzin组(LPS+Daidzin),15只/组。实验结束后检测肺湿干重比,伊文思蓝(EB)检测渗透量;HE染色和透射电镜观察肺组织病理变化及超微结构改变;ELISA检测血清中4-羟基壬烯醛(4-HNE)的水平,氧化应激试剂盒测定丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)水平;Westernblot检测ALDH2、紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、线粒体融合蛋白Mfn2、OPA1和分裂蛋白Drp1、Fis1以及Nrf2核蛋白和HO-1蛋白的表达。结果与Sham组相比较,LPS组小鼠肺组织湿干重比,EB渗透均增高(P<0.01);肺组织结构、内皮细胞间紧密连接及线粒体损伤严重;4-HNE、MDA含量升高,CAT及SOD活性下降(P<0.01);ALDH2、紧密连接蛋白ZO-1和Occludin、线粒体融合蛋白Mfn2和OPA1表达降低,而线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1表达升高(P<0.05,P<0.01);此外,Nrf2核蛋白和HO-1蛋白表达均增高(P<0.01)。应用Alda-1干预后,小鼠肺组织结构、内皮细胞间紧密连接及线粒体损伤明显改善(P<0.01);ALDH2、ZO-1、Occludin、OPA1和Mfn2蛋白表达增高,Drp1和Fis1蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01);Nrf2核蛋白和HO-1蛋白表达均上调(P<0.05,P<0.01)。相比LPS+Alda-1组,LPS+Daidzin组肺部通透性增加,线粒体损伤明显;并伴有ALDH2、ZO-1、Occludin、Mfn2、OPA1、Nrf2核蛋白和HO-1蛋白表达降低,Drp1和Fis1蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01)。结论ALDH2可通过维持线粒体动力学平衡,抑制氧化应激,改善LPS诱导的ALI小鼠肺内皮屏障损伤,其机制可能与Nrf2/HO-1通路有关。

通心络对猪急性心肌缺血再灌注晚期微血管内皮屏障损伤的治疗作用

目的探讨通心络灌胃对猪急性心肌梗死(AMI)再灌注晚期(第7天)微血管内皮屏障损伤的治疗作用。方法将40只中华小型猪,随机分为假手术组、模型组及低、中、高剂量组,每组8只。除假手术组外其他各组经冠脉前降支阻断90 min,再灌注120 min建立AMI再灌注模型,假手术组只穿管不阻断冠脉。低、中、高剂量组于冠脉阻断前90 min分别给予0.2、0.4、0.8 g/kg通心络灌胃1次,自第2天开始,分别给予0.1、0.2、0.4 g/kg通心络,每天喂食给药,共治疗7 d。分别于冠脉阻断前、阻断90 min、再灌注120 min及再灌注1、3、7 d采用ELISA法检测血清内皮素1(ET-1)、血管性血友病因子(vWF)。缺血再灌注后第7天,麻醉猪,取梗死区、边缘区和正常区心肌组织,用原位杂交技术检测各心肌组织中内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)、血管内皮细胞钙黏蛋白(VE-cadherin)mRNA表达,用Western blotting法检测各心肌组织中eNOS、VE-cadherin蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组在冠脉阻断后血清ET-1、vWF水平高(P均<0.05),至再灌注7 d,血清ET-1水平回落,但仍高于假手术组(P<0.05)。与模型组比较,高剂量组在冠脉阻断90 min、再灌注120 min及再灌注1、3 d血清ET-1水平低(P均<0.05),而血清vWF水平则在以上各时间点及再灌注7 d均低(P均<0.05)。与假手术组比较,再灌注7 d模型组梗死区eNOS mRNA阳性表达率低(P<0.05),梗死区及梗死边缘区Ve-cadherin mRNA阳性表达率低(P均<0.05);与模型组比较,低、中、高剂量组各区心肌组织中eNOS、VE-cadherin mRNA阳性表达率随剂量增加逐渐升高,但组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。与模型组比较,低、中、高剂量组各区心肌组织中eNOS、VE-cadherin蛋白表达随剂量增加逐渐升高,其中各通心络组梗死区及中、高剂量组边缘区eNOS蛋白表达、高剂量组梗死区VE-cadherin蛋白表达均高(P均<0.05)。结论通心络灌胃可减轻猪AMI再灌注第7天微血管内皮屏障损伤,且具有剂量依赖性,对梗死区心肌的作用更显著。

脑缺血再灌注损伤对大鼠血脑屏障内皮屏障抗原及通透性的影响

目的探讨大鼠脑缺血再灌注损伤对血脑屏障内皮屏障抗原(EBA)及通透性的影响。方法 20只雄性SD大鼠随机分成为缺血再灌注组和假手术组,采用阻断大鼠一侧大脑中动脉(MCA)血流2h、再灌注24h制成局灶性脑缺血模型。24h后断头取脑,制作冰冻切片,免疫组化染色检测血脑屏障EBA和Fibrinogen的表达。结果缺血再灌注组EBA免疫反应阳性血管数5.30±1.24,假手术组EBA免疫反应阳性血管数15.20±1.02,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。缺血再灌注组Fibrinogen免疫反应阳性血管数8.60±3.12,假手术组Fibrinogen免疫反应阳性血管数1.30±0.46,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论脑缺血再灌注损伤能显著减少血脑屏障EBA表达,增加血脑屏障通透性。

动态观察糖尿病对大鼠内皮屏障抗原和血脑屏障通透性的影响

目的动态研究糖尿病对内皮屏障抗原表达和血脑屏障通透性的影响,揭示内皮屏障抗原表达与血脑屏障通透性变化之间可能的联系。方法雄性SD大鼠100只,随机分为2组,糖尿病组和正常对照组。每组50只。糖尿病模型用链脲霉素(streptozotocin,50mg/kg)腹腔内1次性注射制备。分别于糖尿病模型复制成功后1个月、2个月、3个月、4个月和5个月取大脑皮层,每次各取10只。用免疫组织化学的方法检测微血管内皮细胞EBA及微血管周围fibrinogen表达。结果免疫组织化学染色显示1个月、2个月糖尿病组EBA阳性微血管数与正常对照组相比无统计学意义(P>0.05);3个月时开始减少,与正常对照组比较有统计学意义(P<0.05);4个月、5个月时逐渐减少,但与3个月时比较无统计学意义(P>0.05);正常对照组4个月、5个月时开始逐渐减少,但与糖尿病组比较仍有统计学意义(P<0.05)。1个月、2个月糖尿病组微血管周围fibrinogen阴性表达,正常对照组也阴性表达;3个月时与正常对照组比较显著增多(P<0.05);4个月、5个月时逐渐增多,但与3个月时比较无统计学意义(P>0.05);正常对照组5个月时也开始逐渐增多,但与糖尿病组比较仍有统计学意义(P<0.05)。结论糖尿病可引起内皮屏障抗原表达减少,血脑屏障通透性增加;内皮屏障抗原表达减少可能是糖尿病引起血脑屏障通透性增加的一个重要因素。也可作为糖尿病对微血管损伤的一个敏感性指标。

大鼠实验性脑创伤挫伤灶内皮屏障抗原和Ⅳ型水通道蛋白免疫反应性的动态改变

目的研究实验性脑创伤中内皮细胞屏障的损伤修复以及与位于星形细胞足突的Ⅳ型水通道的关系。方法成年雄性SD大鼠32只,随机分入对照组,伤后1h组,4h组,1d组,3d组,6d组和11d组。在大鼠重度冲击加速性伤模型中,应用免疫组化法观察脑创伤灶中内皮屏障抗原(EBA)和Ⅳ型水通道蛋白(AQP4)免疫反应性在不同时点的动态改变。采用图像分析技术对挫伤病灶免疫反应性进行定量分析。结果在血脑屏障损伤的皮质挫伤灶,伤后1dAQP4和EBA免疫反应性明显消失,AQP4阴性反应区面积明显大于EBA阴性反应区(P<0.05)。伤后3d,EBA表达重新出现。伤后6d,EBA表达延伸至挫伤中心区,AQP4表达始见于边缘。伤后11d,二者免疫反应性基本恢复。结论挫伤灶血管源性水肿形成同时伴有内皮屏障功能和星形细胞足突水通道的改变。同一创伤强度下,星形细胞足突AQP4损伤范围较内皮EBA大,恢复较慢。

血管内皮屏障功能及其调节的信号传导机制

论述了血管内皮屏障功能及其决定因素和影响因素；阐述了血管内皮屏障功能调节的信号传导机制。炎性介质可能通过Ｇ蛋白激活磷脂酶，介导第二信使的产生，进而激活蛋白激酶，引起肌球蛋白轻链磷酸化，导致内皮细胞内Ｆ－肌动蛋白骨架重排，中心张力增加，细胞间裂隙形成，内皮细胞通透性发生改变。

β-AR激活对脂多糖导致的肺微血管内皮屏障功能障碍的保护作用

目的研究β-AR在脂多糖导致的肺微血管内皮屏障功能障碍中的调控作用。方法LPS(10μg/ml)处理细胞2~8 h;分别激活β1-AR和β2-AR后再利用LPS处理6 h。采用Transwell小室法检测内皮屏障通透性,共聚焦显微镜观察细胞肌动蛋白(F-actin)的形态,蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测细胞连接蛋白VE-cadherin和occludin的表达;质粒转染方法转染β2-AR-GFP,免疫荧光技术标记Rab5a,共聚焦显微镜观察Rab5a和β2-AR-GFP在细胞内的定位。结果LPS对肺微血管内皮屏障通透性的作用呈时间依赖性,随时间延长通透性增加,在6~8 h达到最高峰;LPS导致骨架蛋白F-actin形态学发生改变、应力纤维形成,下调VE-cadherin和occludin的蛋白表达水平;选择性激活β2-AR可部分逆转LPS对内皮屏障的损伤作用;Rab5a与β2-AR-GFP共定位于细胞膜,受体激活后主要共定位于细胞核周。结论β2-AR在肺微血管内皮细胞的激活可调控细胞骨架蛋白重构以及细胞间连接蛋白表达水平,对LPS导致的内皮屏障损伤有一定的保护作用。

烧伤早期血管内皮屏障损伤机制与保护药物的研究进展

严重烧伤患者常发生休克、组织水肿和器官功能障碍,威胁患者生命.烧伤后微血管通透性增高、微循环障碍、组织水肿、发生低血容量性休克的病理基础是血管内皮屏障的结构破坏和功能损害.烧伤患者发生休克后,为了维持组织和重要脏器的血流灌注,需要早期及时地实行液体复苏,但特殊事故现场（如战场、自然灾害、火灾等现场）时,医疗资源常在短时间内耗竭,而使静脉补液治疗无法实施.

rhEPO对糖尿病大鼠内皮屏障抗原EBA及血脑屏障通透性的影响

目的研究重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)对糖尿病大鼠血脑屏障(BBB)通透性和内皮屏障抗原(endothelial barrier antigen,EBA)表达的影响。方法 30只雄性SD大鼠分成rhEPO治疗组、糖尿病组和正常对照组。rhEPO治疗组、糖尿病组用链脲霉素(streptozotocin,50 mg/kg)静脉一次性注射制备糖尿病模型。rhEPO治疗组于模型制备同时rhEPO(3 000 U/kg),皮下注射,3次/周,疗程4个月。糖尿病组和正常对照组皮下注射等量生理盐水。4个月后均取额叶皮层。用免疫组织化学(IHC)的方法检测微血管内皮细胞EBA及微血管周围纤维蛋白原(fibrinogen)表达。结果 IHC染色显示rhEPO治疗组、糖尿病组和正常对照组EBA阳性微血管数分别为(10.30±1.17)、(7.30±1.14)和(13.20±1.33),rhEPO治疗组EBA阳性微血管数与正常对照组比较明显减少(P<0.01),而rhEPO治疗组与糖尿病组比较EBA阳性微血管数显著增加(P<0.01);rhEPO治疗组、糖尿病组和正常对照组fibrinogen阳性微血管数分别为(5.52±2.54)、(7.60±3.11)和(1.30±0.46),rhEPO治疗组与糖尿病组比较fibrinogen阳性微血管数显著减少(P<0.01)。结论 rhEPO治疗可明显增加糖尿病大鼠血脑屏障EBA表达,减少fibrinogen外渗,减少BBB通透性,对糖尿病大鼠血脑屏障具有保护作用。

内皮细胞和细胞外基质的粘附对内皮屏障功能的影响

内皮细胞和细胞外基质（ＥＣＭ）的粘附对于内皮屏障的结构完整是非常重要的，构成这一结构的有细胞外粘附蛋白和细胞内骨架蛋白，参与其调控的有整合素、粘着斑激酶（ＦＡＫ）及胞浆内的多种信号转导蛋白（如ＭＡＰＫ等）。本文从内皮胞和细胞外基质的粘附以及参与其调控的信号转导蛋白等方面进行综述。

右美托咪定对脓毒症大鼠血管内皮屏障功能的保护作用

目的探讨右美托咪定对脓毒症大鼠血管内皮屏障功能的保护作用。方法采用盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)诱导大鼠脓毒症模型,将SD大鼠分成4组:假手术(Sham)组、脓毒症(sepsis,Sep)组、常规治疗(conventional treatment,CT)组、右美托咪定(Dex)组,观察肠系膜微血管静脉通透性、肺血管通透性的变化及存活率、存活时间的变化;离体取原代肺静脉内皮细胞,观察右美托咪定对内毒素刺激血管内皮细胞后的闭锁小带蛋白1(zonula occludes-1,ZO-1)表达和细胞跨膜电阻(transmembrane electrical resistance,TER)的影响。结果与假手术组比较,脓毒症后大鼠肠系膜微血管和肺血管的通透性明显增加,存活率与存活时间明显降低(P<0.01);常规治疗能够轻微降低脓毒症大鼠的血管通透性;右美托咪定可显著降低脓毒症大鼠肠系膜微血管和肺血管通透性(P<0.01),提高脓毒症大鼠的存活率与存活时间(P<0.05)。LPS孵育可导致肺静脉内皮细胞间连接断裂、消失,ZO-1表达明显降低,TER明显降低(P<0.01)。结论右美托咪定可明显改善脓毒症大鼠的血管内皮屏障功能,并进一步发挥对脓毒症大鼠的保护作用。

内皮屏障抗原在实验性大鼠脑出血后的表达及其与血脑屏障通透性改变的关系

目的探讨内皮屏障抗原(EBA)在脑出血(ICH)后血肿周围脑组织中的表达及其在ICH后血脑屏障(BBB)通透性改变中的作用。方法利用立体定向技术向大鼠尾状核内注入50μl自体股动脉血建立ICH模型,用免疫组化法检测ICH后血肿周围EBA、纤维蛋白原的蛋白表达、Belayev法测定BBB通透性及干湿重法测定脑水含量的动态变化。结果 ICH后6hEBA表达开始减少,3d时最少,7d略有回升;纤维蛋白原表达、BBB通透性、脑水含量均于ICH后6h开始升高,3d达高峰,7d逐渐下降,ICH后EBA蛋白表达与脑水含量呈负相关(r=-0.840,P<0.01),与EB含量负相关(r=-0.827,P<0.01),与纤维蛋白原表达呈负相关(r=-0.851,P<0.01)。结论大鼠实验性ICH后EBA的表达减少,且与纤维蛋白原、BBB通透性及脑水含量增高具有明显的相关性。

搜风祛痰中药对大鼠心肌缺血再灌注冠脉微循环内皮屏障的保护作用

目的观察搜风祛痰中药对大鼠心肌缺血再灌注模型冠脉微循环内皮障碍的影响。方法健康SPF级SD大鼠140只,随机分成假手术组、模型组、培哚普利组、搜风祛痰中药组,每组35只。假手术组只穿线不结扎,其余3组建立缺血再灌注模型。预先给予相应药物干预后造模,心电图评价造模情况。RT-PCR法测定各组大鼠血栓调节蛋白(TM)、内皮细胞蛋白C受体(EPCR) mRNA表达水平,ELISA法检测各组大鼠血清前列环素(PGI2)、血栓素A2(TXA2)含量。结果心电图显示造模成功。与模型组相比,搜风祛痰中药组PGI2含量升高、TXA2含量降低,TM、EPCR mRNA表达水平降低(P <0.05)。结论搜风祛痰中药可保护缺血再灌注大鼠冠脉微循环内皮屏障功能,其机制可能与降低EPCR、TM mRNA表达水平,调节PGI2和TXA2含量相关。

脂多糖致急性肺血管内皮屏障功能失调小鼠FLI-1蛋白表达的变化及其意义

目的:观察感染性急性肺损伤(ALI)肺血管内皮屏障功能失调小鼠肺组织中弗里德白血病病毒插入位点1(FLI-1)蛋白表达的变化,以探讨FLI-1在感染性ALI肺血管内皮屏障功能失调发生发展中的意义。方法:SPF级雄性ICR小鼠60只,腹腔注射脂多糖(LPS,7.5 mg/kg)复制ALI模型,在给予LPS 0 h、12 h、24 h、48 h后,检测小鼠肺血管内皮屏障通透性和肺湿干重比,ELISA法检测肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6含量,Western blot法检测肺组织FLI-1和Src酪氨酸激酶(SRC)蛋白的表达。结果:与0 h组比较,12 h组、24 h组肺血管内皮屏障通透性分别升高74.3%和162.4%,而48 h组较24 h组降低27.0%(P均<0.05);与0 h组比较,12 h组、24 h组肺湿干重比分别升高50.1%和122.9%,而48 h组较24 h组降低10.7%(P均<0.05);与0 h组比较,12 h、24 h肺泡灌洗液IL-6和TNF-α含量均显著升高,而48 h肺泡灌洗液IL-6和TNF-α含量较24 h分别下降28.3%和21.6%(P均<0.05);与0 h组比较,12 h组、24 h组肺组织FLI-1蛋白表达水平分别下调20.4%和56.9%,而48 h组较24 h组上调18.2%(P均<0.05);与0 h组比较,12 h组、24 h组肺组织SRC蛋白表达水平分别上调76.8%和176.7%,而48 h组较24 h组下调33.4%(P均<0.05);肺血管内皮屏障通透性与FLI-1蛋白表达水平呈显著负相关(r=-0.8992,P<0.01),而与SRC蛋白表达水平呈显著正相关(r=0.8918,P<0.01),肺组织FLI-1与SRC蛋白表达呈显著负相关(r=-0.8087,P=0.0014)。结论:FLI-1可能参与LPS诱导的急性肺损伤肺血管内皮屏障功能失常过程。

肿瘤坏死因子-α通过激活Wnt/β-catenin通路增加肺微血管内皮屏障通透性

目的 探讨炎症环境下Wnt/β-catenin通路对肺微血管内皮屏障通透性的影响。方法 分别用浓度为0、25、50、100、200 ng·mL^(-1)的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)处理人肺微血管内皮细胞(human pulmonary microvascular endothelial cells,HPMVECs)24 h,采用CCK-8检测细胞存活率,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测闭合蛋白-5(claudin-5)、闭锁小带蛋白1(zonula occludens 1,ZO-1)的表达,选取TNF-α最佳干预浓度。将细胞分为control组、TNF-α 100 ng·mL^(-1)组、Wnt通路抑制对照组(XAV-NC组)、Wnt通路抑制组(XAV组),应用Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV-939(10μmol·L^(-1),24 h)后,采用CCK-8法检测细胞存活率,细胞划痕实验检测细胞迁移,FITC-葡聚糖检测微血管内皮屏障通透性,RT-qPCR和蛋白免疫印迹(Western blot)测定各实验组β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、claudin-5、ZO-1的表达。结果 随TNF-α浓度增加,HPMVECs存活率逐渐降低,claudin-5、ZO-1 mRNA表达逐渐减少(P均<0.05),筛选出TNF-α作用的最适剂量为100 ng·mL^(-1)。应用XAV-939后,与control组相比,TNF-α 100 ng·mL^(-1)组细胞存活率及迁移率降低,Transwell小室通过FITC-葡聚糖增多,屏障相对通透性系数增大,β-catenin及Cyclin D1表达增加,claudin-5、ZO-1的表达减少(P均<0.05);与XAV-NC组比,XAV组细胞存活率及迁移率增加,Transwell小室通过FITC-葡聚糖减少,屏障相对通透性系数减小,β-catenin及Cyclin D1表达减少,claudin-5、ZO-1的表达增加(P均<0.05)。结论 TNF-α可通过激活Wnt/β-catenin通路,使紧密连接蛋白claudin-5、ZO-1的表达减少,增加肺微血管内皮屏障通透性。