人脐静脉内皮细胞的分离培养和鉴定及酪氨酸激酶受体-2在其中的表达

目的分离和培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),对其进行鉴定,并探讨酪氨酸激酶受体-2(Tie-2)基因在HUVECs中的表达情况。方法用胰蛋白酶消化、分离HUVECs并对其进行培养,根据细胞生长特点、形态特征和Ⅷ因子免疫荧光组化技术对细胞进行鉴定。分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和SABC免疫细胞化学染色对HUVECs中Tie-2mRNA和蛋白表达情况进行检测。结果原代培养的HUVECs约于24h完全贴壁,4～5d后融合成单层铺路石样结构。Ⅷ因子免疫荧光组化法证实细胞是HUVECs。RT-PCR检测到HUVECs中Tie-2mRNA条带明显,SABC免疫细胞组化法检测到Tie-2蛋白在HUVECs胞浆、核膜中呈强阳性表达,阳性率为85%以上。结论胰蛋白酶灌流消化法可获得高纯度的HUVECs,Tie-2在HUVECs中呈强阳性表达。

乙酰胆碱受体抗体及肌肉特异性受体酪氨酸激酶抗体均阳性的重症肌无力1例报告

重症肌无力（MG）是一种累及神经-肌肉接头处乙酰胆碱受体（AchR）的自身免疫性疾病。约80%的MG患者血清AchR-Ab（＋）,但约20%的患者为阴性,称为血清阴性MG（SNMG）[1]。目前国内将肌肉特异性受体酪氨酸激酶抗体（Mu SK-Ab）阳性的MG归类于SNMG,乙酰胆碱受体抗体（AchR-Ab）及Mu SK-Ab同时阳性的重症肌无力尚无报道。

吲哚衍生物类VEGFR-2酪氨酸激酶抑制剂的从头设计

以血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)酪氨酸激酶的晶体结构为基础,采用从头药物设计方法,设计了一系列吲哚类化合物,并用类药性和分子对接进行了筛选,最后得到10个对接能量较低的化合物分子,对具有最低结合能的化合物与VEGFR-2酪氨酸激酶的复合物进行了10 ns的分子动力学模拟,并对其结合模式进行了分析.这些化合物结构新颖,可能作为抗肿瘤的先导化合物或候选药物.本文结果为VEGFR-2酪氨酸激酶抑制剂的进一步改造、设计及合成提供了理论基础,并有助于开发高活性和高选择性的抗肿瘤药物.

卵巢上皮性癌中血管内皮生长因子-C和酪氨酸激酶受体B表达与微淋巴管密度的关系

目的探讨血管内皮生长因子-C(VEGFC)、失巢凋亡抑制因子酪氨酸激酶受体B(Trk B)在卵巢上皮性癌淋巴管形成和淋巴结转移中的作用、与临床病理生物学行为间的关系及两蛋白表达的相关性。方法采用免疫组织化学检测106例原发性卵巢上皮性癌、40例交界性上皮性肿瘤及40例良性上皮性肿瘤组织中VEGF-C和Trk B蛋白的表达,并测定肿瘤组织中微淋巴管密度。结果 VEGF-C在卵巢癌中的表达率为82.1%(87/106),明显高于良性肿瘤组35.0%(14/40)和交界性肿瘤组52.5%(21/40),差异有统计学意义(P<0.05);Trk B在卵巢癌中的表达率为74.5%(79/106),明显高于良性肿瘤组7.5%(3/40)和交界性肿瘤组27.5%(11/40),差异有统计学意义(P<0.05);D2-40标记的瘤内淋巴管密度(MLVD)在卵巢癌组为(14.25±3.57),明显高于良性肿瘤组(8.87±4.46)和交界性肿瘤组(11.74±5.32)(P<0.05)。在卵巢癌组中,VEGF-C和Trk B蛋白的表达呈正相关(r=0.574,P<0.05),VEGF-C、Trk B的表达与瘤组织内MLVD数呈正相关(r分别为0.488,0.510,P<0.05)。在肿瘤分化越低、临床分期越高、脉管内有癌栓及有淋巴结转移的卵巢癌组织中,Trk B和VEGF-C蛋白的阳性率越高,MLVD数越多(P<0.05)。结论 VEGF-C可能与Trk B在卵巢癌的发生发展过程中发挥着协调作用,促进卵巢癌中淋巴管形成及淋巴结的转移,联合检测VEGF-C、Trk B及MLVD可作为判断卵巢癌恶性程度、侵袭、预后的重要指标。

VEGFR-2酪氨酸激酶抑制剂3-取代吲哚-2-酮的合成及抑制活性

目的:合成一系列结构新颖的3-取代吲哚-2-酮类化合物,并测试其对血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)的抑制活性。方法:以2-(羟甲基)-5-氰基-1H-吲哚为起始原料,经水解、氧化、缩合和胺化反应得到目标产物(6-14);以舒尼替尼为阳性对照,用MTT法测试目标产物对VEGFR-2高表达的人乳腺上皮细胞(HMEC)的抑制活性。结果:合成9个未见报道的目标产物,其结构均经1H NMS,ESI-MS确证;样品浓度为10μmol/L时,化合物14对VEGFR-2的抑制率为68.56%,舒尼替尼为62.53%。结论:化合物14对VEGFR-2的抑制活性优于阳性对照舒尼替尼。

2-吲哚酮类血管内皮细胞生长因子受体抑制剂的三维定量构效关系

目的:建立血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体酪氨酸激酶抑制剂的三维定量构效关系。十站:从报道的2一叫咪酮类＊＊＊F受体酪氨酸激酶抑制剂中选取35个化合物,采用分子全局最低能量构象以最小二乘匹配法叠合分子建立比较分子力场分析(CoMFA)模型。结果:模型的交叉验证系数 Q’一0.625,传统相关系数 r’一0.968,F;。。一175.475,标准误 S。一0.124。结论:利用COMFA方法建立的化合物三维定量构效关系模型有较好的预测能力,可以指导新的活性更优的抑制剂的合成。

Tie-2在人脐静脉内皮细胞中的表达及意义

目的探讨酪氨酸激酶受体-2(tyrosine kinase with immunoglobulin-like and epidermal growth factor homology domains,Tie-2)基因在人脐静脉内皮细胞株ECV304中的表达,为进一步研究Tie-2在肿瘤血管生成中的作用提供实验基础。方法传代人脐静脉内皮细胞进行培养和形态学观察,采用免疫组化(SABC法、DAB显色)对人脐静脉内皮细胞株ECV304中的Tie-2基因的蛋白表达情况进行检测。结果相差显微镜下,培养的活细胞具有单层"卵石样"排列的典型特征,SABC法检测到Tie-2蛋白在人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞膜、细胞浆和核膜中均呈深棕色颗粒。结论Tie-2在ECV304细胞株中呈强阳性表达。

内皮素-2促进体外培养的绵羊皮肤黑色素细胞增殖及黑色素生成

内皮素(endothelin,ET)及其受体在黑色素细胞成熟分化时起着有效的促进作用.然而,内皮素-2(ET-2)在黑色素生成的作用方面,还处于争论中或报道不一致.在此,我们研究ET-2对体外培养的绵羊皮肤黑色素细胞增殖和黑色素生成的影响.比较实验组ET-2(1,10,100 nmol/L)与空白对照组,通过MTT法和Ando等的方法检测出黑色素细胞的增殖率和黑色素含量显著增加.荧光定量PCR和Western印迹分别检测出内皮素受体B(Bdnrb);酪氨酸激酶受体(Kit);酪氨酸酶(Tyr);酪氨酸相关蛋白-1(Tyrp-1)基因的mRNA水平及蛋白水平的相对表达量显著增加.这些数据表明,ET-2可能促进绵羊的皮肤黑色素细胞增殖和黑色素生成.

促血管生成素-2和血管内皮生长因子在结直肠癌组织中的表达

目的探讨促血管生成素-2(Ang-2)及血管内皮生长因子(VEGF)在结直肠癌组织及血液中的表达,研究其与肿瘤疾病分期的关系。方法采用实时荧光定量PCR检测结直肠癌患者正常组织、癌旁组织及腺癌中Ang-2、Tie-2mRNA的表达,采用酶联免疫竞争法检测Ang-2及VEGF在正常组织、癌旁组织及腺癌和外周血中的表达。结果癌组织Ang-2mRNA和Tie-2mRNA表达与正常组织有明显差异(P<0.05),相关分析表明,2者表达存在着明显的相关(r=0.879,P=0.000)。癌组织Ang-2和VEGF含量与正常组织有明显差异(P<0.05),与癌旁组织有明显差异(P<0.05)。癌外周血液Ang-2含量与正常对照外周血有明显差异(P<0.05),与癌肠系膜血无明显差异(P>0.05)。肿瘤组织中Ang-2和VEGF含量与疾病分期明显相关,肿瘤患者显著高于正常对照组(P<0.05),Dukes'C期和D期显著高于A期和B期(P<0.05)。结论在大肠腺癌组织中,Ang-2、Tie-2及VEGF的过度表达对肿瘤的血管生成和发展过程起着重要作用。

下肢缺血大鼠模型肌组织中Tie-2和VEGF蛋白表达初步研究

目的观察SD大鼠下肢缺血模型造模后不同时间点缺血组织相关蛋白表达量的变化。方法将42只SD大鼠随机分为6组,每组7只。第1组为对照组;第2～6组为模型组,将模型组大鼠左侧股总动脉结扎离断造模,分别于造模后4h、3d、1周、2周及4周5个不同时间点分离大鼠左小腿腓肠肌组织,利用Western blotting检测法检测缺血组织酪氨酸蛋白激酶受体-2(Tie-2)及血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表达量。结果缺血组织Tie-2表达量在组织缺血后迅速减少,至3d时Tie-2表达量持续于较低水平,然后缓慢增加,缺血后2周时表达有较大幅度增加,但仍低于正常组织,之后有小幅度减少。缺血组织VEGF表达在缺血后4h即开始增多,至3d时达到高峰,以后逐渐减少,至缺血后2周时表达最少,然后又缓慢回升,到缺血后4周基本接近正常组织VEGF表达量。结论在缺血组织VEGF表达上调的过程中,缺血组织完成了修复,肌组织中Tie-2表达量增多,内皮细胞数量得到增加,从而改善缺血组织供血。

基于Btk-PLCγ2-NFATc1通路分析调控miR-17-5p表达对根尖周炎大鼠骨破坏的修复作用

目的 分析基于布鲁顿酪氨酸激酶(Btk)-磷脂酰肌醇特异性磷酯酶(PLCγ2)-活化T-细胞核因子(NFATc)1通路调控微小RNA-17-5p(miR-17-5p)表达对根尖周炎大鼠骨破坏的修复作用。方法 将60只大鼠随机分为正常(A)组、模型(B)组、上调(C)组、下调(D)组各15只,除A组外,其余大鼠均建立根尖周炎模型,C组、D组分别转染miR-17-5p模拟物(mimics)、miR-17-5p抑制剂(inhibitor)行上调、下调转染,A组、B组给予等体积生理盐水干预。观察各组病理组织学、miR-17-5p表达量、骨细胞阳性细胞数、炎性浸润指标水平及Btk-PLCγ2-NFATc1通路蛋白表达量。结果 与C组相比,D组miR-17-5p表达量,炎性浸润指标水平,Btk、PLCγ2、NFATc1蛋白表达量显著较低(P<0.05)。与C组相比,D组骨细胞阳性细胞数显著较少(P<0.05)。结论 下调miR-17-5p可能通过下调Btk、PLCγ2、NFATc1蛋白表达量、抑制Btk-PLCγ2-NFATc1通路,减少骨细胞阳性细胞数,对骨破坏起一定的修复作用。

通络救脑注射液及其有效成分对拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞的保护作用

目的通过观察通络救脑注射液及其有效成分对拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞活性的影响,以及对血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)及其受体内皮特异性酪氨酸激酶受体-2(endothelial-specific tyrosine kinasereceptor 2,Tie-2)表达的影响,以评价其对拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞的保护作用。方法利用氧糖剥夺方法复制人脑微血管内皮细胞拟缺血损伤模型,通络救脑注射液及其有效成分分别作用不同时间后,采用四甲基偶氮唑盐染色法测定细胞活性,采用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出率检测细胞损伤程度,采用蛋白印迹法检测内皮细胞Ang-1和Tie-2表达水平。结果通络救脑注射液可显著提高拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞活性,降低LDH漏出率,增加内皮细胞Ang-1和Tie-2的表达,两个有效成分发挥疗效的时间有所不同,复方注射液作用明显优于两个有效成分。结论通络救脑注射液对拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞具有保护作用,其机制与增加Ang-1及其受体Tie-2表达有关,显示中药组方可发挥整合调节的治疗优势。

脾源性酪氨酸激酶基因的再表达对乳腺癌细胞生长、转移的影响

目的探讨脾源性酪氨酸激酶(Syk)基因的再表达对裸鼠乳腺癌肿瘤生长和转移的影响。方法5氮2′脱氧胞苷处理人乳腺癌细胞株MDAMB435s,甲基化特异性PCR(MSP)检测Syk基因的甲基化,用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测Syk基因的再表达,并用此处理过的细胞株和未经处理的细胞株分别接种于10裸鼠皮下,观察裸鼠成瘤率及肿瘤转移情况。结果MSP检测用5氮2′脱氧胞苷处理过的人乳腺癌MDAMB435s细胞株,Syk基因启动子没有甲基化,RTPCR可检测到Syk基因,用有Syk基因再表达的MDAMB435s细胞株接种于10只裸鼠皮下,8周后有2只形成肿瘤,无1例肺部转移,而无Syk基因表达细胞株10只都形成肿瘤,并在肺部形成转移灶。对照组的成瘤率及肺转移率显著高于治疗组。结论5氮2′脱氧胞苷通过去甲基化使MDAMB435细胞株中Syk基因再表达,Syk基因的再表达可抑制荷瘤裸鼠乳腺癌的生长和转移。

链霉菌I06A-03304产生的二酮哌嗪类化合物的纯化及结构鉴定

目的分离鉴定链霉菌I06A-03304发酵液中具血管内皮细胞生长因子受体-2胞内酪氨酸激酶(VEGFR2-CD)抑制活性的次生代谢产物。方法采用大孔吸附树脂、羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)、C-18反相色谱(ODS)、高压液相色谱(HPLC)等分离手段对次生代谢产物进行分离纯化;通过二级质谱(ESI+-MS2)、紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、核磁共振波谱(NMR)对其结构进行鉴定,以酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测其次生代谢产物对VEGFR2-CD的抑制活性。结果分离得到两个二酮哌嗪类化合物:3304A和3304C;化合物3304A的化学结构与环(脯氨酸-亮氨酸)一致,化合物3304C的化学结构与环(脯氨酸-苯丙氨酸)一致,均对VEGFR2-CD表现出一定的抑制活性。结论化合物3304A和3304C是具有VEGFR2-CD抑制活性的二酮哌嗪类次生代谢产物,并为本研究首次报道。

人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1的三维培养及血管生成拟态机制的研究

目的通过体外三维培养人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1,观察其生成血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)时,PI3K、Eph A2蛋白的表达,探讨VM发生的可能机制。方法体外三维培养OCM-1细胞,于三维培养7 d进行过碘酸-雪夫反应(periodic acid schiff reaction,PAS)染色,观察PAS阳性的环状结构的形成(即其形成VM的能力),于1 d、4 d、7 d进行PI3 K和Eph A2免疫组织化学染色并观察其结果。结果OCM-1细胞三维培养4 d,细胞大部分呈多角形,胞浆较丰富,核圆形,可见核仁,少部分肿瘤细胞长梭形,可见3~5个长梭形细胞彼此连接围成半环状结构。7 d后,肿瘤细胞几乎均变成长梭形,沿着胶原支架生长,细胞伸出长的突起,彼此之间相互接触围成环状结构。PAS染色可见瘤细胞大多呈弥散排列,肿瘤细胞模仿机体血管生成而形成瘤细胞条索并围成管道,一层细胞外基质(PAS阳性物质)围成环状结构。与培养1 d的细胞相比,培养4 d和7 d的PI3K和Eph A2蛋白表达量均明显增加(均为P<0.05),并随着时间的推移增加(7 d>4 d>1 d,P<0.05)。结论Eph A2和PI3 K可能在三维培养人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1的VM形成过程中具有重要作用。

苦参对特应性皮炎模型小鼠皮损组织PAR-2、TrK-A蛋白表达的影响

目的探讨苦参治疗特应性皮炎的可能作用机制。方法60只BALB/c雄性小鼠随机分为正常组、模型组、西替利嗪组和苦参高、中、低剂量组,每组10只。除正常组外,其余各组小鼠用卵清蛋白(OVA)诱导特应性皮炎模型,造模成功后,苦参高、中、低剂量组小鼠分别给予苦参3.75、2.50、1.25 g/(kg·d)灌胃,西替利嗪组给予西替利嗪片10 mg/(kg·d)灌胃,正常组和模型组给予10 ml/(kg·d)生理盐水灌胃。各组均每天灌胃2次,连续3周。分别于干预1、2、3周时观察小鼠每30min内搔抓次数;干预3周后采用HE染色观察皮损组织病理形态学变化,测定血清中P物质(SP)、降钙素基因相关肽(CGRP)、前列腺素E2(PGE2)、白三烯B4(LTB4)浓度,分别采用免疫印记和免疫组化法检测皮损组织中蛋白酶激活受体2(PAR-2)和酪氨酸激酶A(TrK-A)蛋白表达。结果与正常组同时间相比,模型组小鼠干预1、2、3周时搔抓次数显著增加(P<0.01);HE染色显示小鼠的表皮过度角化、真皮层增厚、炎细胞浸润;血清中PGE2、CGRP、LTB4和SP浓度明显升高;皮损组织中PAR-2和TrK-A蛋白表达增多(P<0.05或P<0.01)。与模型组同时间比较,除苦参低剂量组干预1周时外,西替利嗪组和苦参各剂量组各时间点小鼠搔抓次数显著降低(P<0.01);西替利嗪组和苦参各剂量组小鼠的表皮和真皮比模型组明显变薄,炎症细胞浸润明显减轻,且以西替利嗪组和苦参高剂量组改善明显;西替利嗪组和苦参各剂量组小鼠血清中PGE2、CGRP、LTB4和SP浓度均降低,皮损组织中PAR-2和TrK-A蛋白表达降低(P<0.05或P<0.01)。与苦参高剂量组同时间比较,苦参低剂量组小鼠搔抓次数明显升高(P<0.05)。西替利嗪组及苦参各剂量组组间两两比较,小鼠血清中PGE2、CGRP、LTB4和SP浓度,皮损组织中PAR-2和TrK-A蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。结论苦参可以改善特应性皮炎瘙痒程度,其机制可能与抑制皮损组织中PAR-2和TRK-A蛋白表达有关。

大豆异黄酮对阿尔茨海默病大鼠海马RAGE介导的信号转导通路的影响

目的观察大豆异黄酮(soybean isoflavones)对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)大鼠高级糖化终产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)介导的信号转导系统的影响。方法采用β淀粉样蛋白25-35片段(amyloidβ25-35,Aβ25-35)双侧海马注射建立AD大鼠模型,60只大鼠随机分为模型组、大豆异黄酮高剂量组[30mg/(kg·d)]、大豆异黄酮低剂量组[10mg/(kg·d)]、雌激素组[0.4mg/(kg·d)]及假手术组,每组12只。大豆异黄酮高、低剂量组和雌激素组造模后3天灌胃给药(2mL/只),模型组与假手术组给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)灌胃,连续21天。酶联免疫吸附法观察各组大鼠海马组织RAGE、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的含量。分光光度法检测大鼠海马组织天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine-containing aspartate-specific protease-3,Caspase-3)活性。免疫组织化学法观察大鼠海马组织磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(phosphorylation extracellular signal-regulatedkinase1/2,P-ERK1/2)的表达。结果与模型组比较,大豆异黄酮可显著降低AD大鼠海马RAGE蛋白、IL-6含量、Caspase-3活性及ERK1/2蛋白磷酸化水平(P<0.01)。结论大豆异黄酮对AD大鼠海马组织RAGE介导的炎症信号通路具有下调作用,减弱炎症反应,降低Aβ的神经毒性,抵抗海马神经元凋亡。

miR-132表达上调对局灶性脑缺血大鼠皮层Ang-1／Tie2表达的影响

目的探讨miR-132表达上调对局灶性脑缺血大鼠皮层血管生成素1（Ang^-1）及其内皮特异性酪氨酸激酶受体（Tie2）表达的影响。方法40只成年健康雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、脑缺血组、miR-132模拟物组和阴性对照组，每组10只。后3组按照改良Longa线栓法制备成大脑中动脉闭塞模型，其中miR-132模拟物组和阴性对照组于脑缺血5min时分别将miR-132模拟物15μg和阴性对照物15μg经侧脑室注入。缺血后24h取脑组织，采用2，3，5．氯化三苯基四氮唑（TTC）染色计算各组大鼠脑梗死体积，采用实时荧光定量PCR检测缺血侧皮层组织miR-132、Ang^-1、Tie2 mRNA表达，采用Western blotting检测缺血侧皮层组织Ang^-1、Tie2、CD31、血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达。结果miR-132模拟物组脑梗死体积[（27．92±3．05）mm^3]显著低于脑缺血组和阴性对照组[（51．34±2．86）mm^3和（50．46±2．571mm^3]，差异均有统计学意义（P〈0．05）。miR-132模拟物组缺血侧皮层组织miR-132、Ang—1、Tie2mRNA相对表达量及Ang^-1、Tie2、CD31、VEGF蛋白相对表达量均明显高于阴性对照组、脑缺血组和假手术组，且阴性对照组和脑缺血组均明显高于假手术组，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论上调miR-132表达可改善脑缺血大鼠脑组织缺血性损伤，其机制可能与促进Ang^-1／Tie2表达进而促进缺血脑组织血管再生有关．

血管内皮生长因子及其受体在尖锐湿疣组织中的表达

血管内皮生长因子(VEGF)有两种特异性受体,分别为含激酶插入区受体(KDR)和fms样酪氨酸激酶-1(Flt-1),主要分布在血管内皮细胞表面[1].研究表明在人类实体肿瘤中VEGF表达升高[2].本实验用RT-PCR方法检测VEGF、Flt-1、KDR的mRNA在尖锐湿疣组织的表达,探讨在尖锐湿疣发病机制的作用.