内皮祖细胞CD34^+水平与高血压患者并发冠心病的相关性研究

目的研究内皮祖细胞(EPCs)CD34+水平与高血压患者并发冠心病(CHD)的相关性。方法将EH患者81例按照是否并发CHD,分为EH并发CHD组50例和EH未并CHD组31例,选取22例一切生理指标正常者为正常组。检测3组EPCs CD34+水平及颈动脉内膜中层厚度(IMT)。结果 EH并发CHD组患者的EPCs CD34+显著低于EH未并CHD组和正常组,而EH未并CHD组亦明显低于正常组;EH并发CHD组患者的动脉IMT水平显著高于EH未并CHD组和正常组,EH未并CHD组明显高于正常组,差异均有统计学意义(P<0.05)。随着病变程度加重,EPCs CD34+显著下降,动脉IMT显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 EH并发CHD患者的EPCs CD34+水平明显下降,二者呈相关性,且随着动脉狭窄程度的加重而呈显著下降,因此,将EPCs CD34+水平作为高血压患者并发冠心病的预测因子具有较大的意义。

探究高血压患者血糖异常与内皮祖细胞CD34^+水平相关性及对IMT的影响

目的:探究高血压患者血糖异常与内皮祖细胞CD34+水平相关性及对IMT(动脉内膜中层厚度)的影响。方法:收治原发性高血压(EH)患者80例,经血糖检测,分为EH并发血糖调节异常组(n=54例)和EH并血糖正常(NBG)组(n=26例),健康组选择21例健康人,经全自动流式细胞仪监测各组EPCs CD34+水平,采用统计SPSS20.0分析组间EPCs CD34+水平差异。结果:高血压血糖异常组CD34+显著低于高血压血糖正常组和健康组(P<0.05);高血压血糖正常组显著低于健康组(P<0.05)。内皮祖细胞CD34+与冠状动脉IMT具有明显负相关(P<0.05);血糖异常程度与冠状动脉IMT正相关,但差异无统计学意义(P>0.05);年龄与冠状动脉IMT呈正相关(P<0.05)。结论:高血压患者血糖水平异常时,PCs CD34+水平会明显下降,血糖异常与IMT异常无显著关联,而内皮祖细胞CD34+水平与IMT变化呈负相关性。因此,内皮祖细胞CD34+水平可作为动脉内膜中层厚度变化的评定指标,可能能够作为冠心病的预测因子。

血管内皮生长因子体外诱导CD34^+造血干/祖细胞信号传导与转录活化因子的活化

目的通过对血管内皮生长因子(VEGF)诱导CD34+造血干/祖细胞内信号传导与转录活化因子(STAT)活化的研究,探索VEGF作用于CD34+造血干/祖细胞的分子机制及其信号传导途径。方法利用磁活化细胞分选系统(MACS)分离并纯化脐血CD34+造血干/祖细胞,体外以重组人细胞因子VEGF(50ng/ml)持续刺激不同时间(0,15,30,45,60,90min)后,提取细胞总蛋白,用Westernblot检测CD34+造血干/祖细胞内STAT-3和STAT-5磷酸化;免疫细胞化学鉴定CD34+造血干/祖细胞表面VEGF受体-2(VEGFR2)的表达,以及VEGF刺激不同时间后CD34+造血干/祖细胞内磷酸化STAT-3和STAT-5有无发生转核;采用能与VEGFR2特异性结合的七肽ATWLPPR封闭VEGF与VEGFR2的结合,Westernblot观察STAT-3和STAT-5的磷酸化是否被相应阻断。结果Westernblot检测结果显示,CD34+细胞在VEGF刺激下,STAT-3和STAT-5均发生了磷酸化,50ng/mlVEGF作用15min后,即可检测到磷酸化的STAT-3和STAT-5的表达,并分别在30和45min时达到峰值;之后开始下降,到90min时均已检测不到,不同刺激时间组间有显著性差异(P=0.0001)。免疫细胞化学显示VEGF能诱导磷酸化STAT-3发生转核并且在作用30min时最为显著,不同刺激时间组间有显著性差异(P=0.0001),而磷酸化STAT-5在VEGF刺激的各时间组均未出现明显的转?

基于Gensini评分探究高血压患者内皮祖细胞CD_(34)^+与冠心病相关性

目的基于Gensini评分探究高血压患者内皮祖细胞CD+34与冠心病相关性,为高血压患者并发冠心病的预防提供依据。方法选取2012年8月-2013年11月于我院就诊的80例原发性高血压患者(EH),按是否患有冠心病分为高血压并发冠心病组(A组)46例和高血压未并发冠心病组(B组)34例,另选取20例正常无相关疾病者作为对照组(C组)。分析3组颈动脉的管壁厚度(IMT)、Gensini评分和EPCs CD+34水平及其与EH并发冠心病的相关性。通过彩色多谱勒超声仪诊断IMT,流式细胞仪检测内皮祖细胞CD+34水平。结果动脉IMT、Gensini评分,A、B、C 3组呈显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);EPCs CD+34A、B、C 3组呈显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。以EH并发冠心病为因变量,以动脉IMT、Gensini评分及EPCs CD+34为3个自变量,通过多元方程分析相关性,其中动脉IMT、Gensini评分均与EH并发冠心病呈正相关(P<0.05);EPCs CD+34与EH并发冠心病呈负相关(P<0.05)。结论Gensini评分、内皮祖细胞CD+34、动脉IMT均与高血压患者并发冠心病有相关性,因此将Gensini评分、内皮祖细胞CD+34、动脉IMT联合作为高血压患者对冠心病发病的预测因子的临床价值较高,诊断具有较高的准确性。

促红细胞生成素动员CD34^+内皮祖细胞治疗下肢严重缺血的临床研究

目的探讨促红细胞生成素(EPO)动员CD34^+内皮祖细胞(EPC)治疗下肢严重缺血的临床疗效。方法收治2014年1月至2015年6月共20例下肢严重缺血患者。皮下注射EPO前及后7天查外周血CD34^+EPC百分含量,随访6~18个月,随访内容包括:Wong-Baker FACES疼痛评分;溃疡愈合、皮肤营养状况;运动平板2.5km·h-1、10%坡度条件下最长无痛步行时间(Peak pain-free walkingtime,PPFWT);踝肱指数(Ankle-brachial index,ABI)。结果应用EPO后外周血CD34^+EPC百分含量明显增加(P<0.001),下肢溃疡愈合,无痛行走时间明显延长(P<0.001),踝肱指数明显增加(P<0.001)。Kaplan Meier法评估14个月保肢率为86%(95%可信区间为(0.61~0.96))。结论该研究显示应用EPO动员CD34^+内皮祖细胞治疗下肢严重缺血的方法是安全、有效的。

人参总皂甙协同造血生长因子体外诱导CD34^+造血干/祖细胞扩增与分化的作用

为探讨人参总皂甙(totalsaponins of panaxginseng,TSPG)协同造血生长因子体外诱导CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC)扩增与分化的作用,收集人脐血、骨髓细胞并采用StemsepTM干细胞分选系统分离纯化CD34+HSC/HPC,用不同剂量TSPG加入不同组合的造血生长因子进行培养,检测细胞总数、CD34+细胞和CD33+细胞比例及集落形成细胞总数(CFC)、粒系祖细胞(CFU-GM)数量变化。结果显示:10-70μg/mlTSPG均可不同程度地提高脐血细胞总数、CFC数和CD34+细胞数,50μg/ml是最佳刺激浓度,可使细胞总数、CFC数和CD34+细胞数分别增至(2470.5±79.96)×103、(53.96±4.29)×100%和(21.86±3.09)×100%;20μg/ml是液体培养诱导骨髓CD34+细胞向粒系分化的最佳浓度,可使细胞总数、CFU-GM和CD33+细胞分别增至(133.2±9.03)×103、(26.78±1.91)×100%和(16.98±1.73)×100%;甲基纤维素半固体培养检测显示,TSPG(10-50μg/ml)均能提高CD34+细胞形成CFU-GM的集落产率,以TSPG20μg/ml效果最为明显。结论:合适剂量的TSPG能够促进CD34+造血干/祖细胞体外扩增与定向诱导分化。

体内外诱导CD34^+细胞生成血管内皮细胞的方法及其组织工程学运用

目的 本实验设计从骨髓中提取CD34 + 细胞作为血管内皮细胞干细胞 ,经诱导生成血管内皮细胞应用于组织工程学器官重建术。方法 利用免疫磁珠法从骨髓中提纯的CD34 + 细胞在体外经血管内皮细胞生长因子 (VEGF)、成纤维细胞生长因子 (bFGF)诱导 ;在动物实验中 ,CD34 + 细胞经Dil标记后于Matrigel混合涂于裸鼠背部皮肤缺损处 ,表面覆盖人胸膜组织。结果 细胞经诱导可转化生成血管内皮细胞 ,Ⅷ∶Ag、CD31+ 染色阳性 ,并可在重组基底膜 (Matrigel)中形成三维毛细血管网状结构。体内实验结果可见CD34 + 细胞参与并加速胸膜下毛细血管网形成 ,短时期内重建血供系统确保胸膜组织存活。对照组 (单纯覆盖Matrigel与胸膜 )胸膜缺血坏死。结论 可利用CD34 + 细胞替代毛细血管内皮细胞重建正常组织毛细血管网 ,与器官实质细胞共同组成复合组织 ,运用于组织工程化器官重建术 。

内皮祖细胞CD34抗体包被冠脉支架对猪冠状动脉再狭窄影响的研究

目的探讨生物可降解高分子载内皮祖细胞CD34抗体支架是否可降低猪冠状动脉支架置入术后再狭窄。方法以生物可降解高分子聚乙二醇-聚乳酸-聚谷氨酸共聚物为载体,应用N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯(SPDP)方法制成内皮祖细胞CD34抗体洗脱支架。18只猪随机分为三组,即紫杉醇支架组、CD34抗体支架组、裸支架组,每组6只,将紫杉醇支架、CD34抗体支架、裸支架分别植入到各组猪的冠状动脉损伤段,4w后处死,取出支架段血管行病理学观察及计算机图像分析血管管腔面积、内膜增生面积以及面积狭窄百分比。结果CD34抗体支架组内膜增生面积较裸支架组减低(P<0.05),紫杉醇支架组内膜增生面积较裸支架组也减低(P<0.05),但较CD34抗体支架组无明显差别(P>0.05)。结论生物可降解高分子载内皮祖细胞CD34抗体支架可明显加速支架置入术后血管内皮修复,降低再狭窄的发生。

增殖细胞核抗原在脐血CD34^+造血干/祖细胞中的表达及意义

目的 探讨增殖细胞核抗原 (PCNA)在脐血造血干 /祖细胞中的表达及意义。方法 采用流式细胞仪技术对不同培养时间和不同培养条件下脐血CD34+ 细胞中PCNA的表达水平和细胞周期进行了测定。结果 新鲜分离的脐血中CD34+ 细胞低表达PCNA ,阳性率为 (11 6± 5 2 ) % ,在体外短期培养 ,无细胞因子的组合PCNA表达逐渐下降 ,而在含有各细胞因子组合的培养体系中 ,PCNA表达水平明显增高 ,其中以SCF ,IL - 3,IL - 6 ,FL ,Tpo组合作用最显著 ,在培养第 7天时 ,PCNA蛋白表达率为 (78 2± 8 7) % ,且S/G2 /M期的细胞占 (5 9 8± 6 7) % ,明显高于培养前。结论 脐血CD34+ 细胞低水平表达PCNA ,造血生长因子对CD34+ 细胞的促增殖作用与上调PCNA蛋白的表达有关。

2型重组腺相关病毒对人脐血CD34^+造血干/祖细胞的转导效率研究

为探讨 2型重组腺相关病毒 (rAAV 2 )载体能否有效地转导脐血CD34+造血干 /祖细胞 ,采用rAAV 2 /GFP感染经免疫磁珠法分离的脐血CD34+造血干 /祖细胞 ,在荧光显微镜下观察GFP的表达。结果显示 ,转导 19小时后感染复数 (MOI)为 2× 10 5时 ,CD34+细胞GFP基因的表达率为 4 3%。结论 :rAAV 2能有效地转导脐血CD34+造血干 /祖细胞。

血小板生成素诱导胎肝CD34^+造血干/祖细胞增殖分化与周期蛋白表达的关系

为了解胚胎时期巨核细胞增殖分化特有的内在机制 ,本研究观察了在体外培养体系中 ,胎肝源CD3 4 +造血干 /祖细胞在血小板生成素 (thrombopoietin ,TPO)作用下增殖分化特征与相关周期蛋白B1、D1和D3表达及细胞内水平变化的关系。结果发现 :( 1)经 12d培养后 ,TPO使胎肝源CD3 4 +细胞数从 1× 0 5个细胞 /ml增加到 13 12± 4 0 6× 10 5个细胞 /ml,CD4 1+细胞增加到了 95 % ,CD3 4 +细胞下降到了 3 % ,大部分细胞的DNA倍性为 2N ,少数为 4N ,无大于 4N巨核细胞 ,TPO对MegaCultTm C胶原半固体培养体系中胎肝源CD3 4 +细胞形成CFU Mk集落产率的影响呈明显的剂量效应关系 ;( 2 )在整个培养期间 ,周期蛋白B1表达逐渐增加 ,并保持在一个高水平上 ,培养后期 ,高水平的周期蛋白B1出现在G1期细胞上 ;( 3 )周期蛋白D1和D3表达先增加 ,培养后期细胞内水平下降 ,且以G2期细胞为主。该结果提示 :( 1)TPO通过上调周期蛋白B1和在所有细胞周期时限上调周期蛋白D1和D3表达 ,促进巨核细胞祖细胞的增殖分化 ;( 2 )周期蛋白B1在G2 +M期的持续高水平和周期蛋白D1和D3在G2 +M期的水平下降 ,可能导致胎肝源巨核细胞核内有丝分裂延迟或阻滞。

雷帕霉素联合CD34抗体复合支架快速捕获外周血中内皮祖细胞

背景:临床用于治疗血管狭窄疾病的药物洗脱支架和单纯内皮修复型支架存在内皮化延迟和植入后再狭窄的问题。雷帕霉素联合CD34抗体复合支架可协同抵消抗增殖药物的内皮化延迟和内膜的过度增生,目前尚处于实验研究阶段。目的:观察雷帕霉素联合CD34抗体复合支架捕获内皮祖细胞能力及其所捕获内皮祖细胞的分化特征。方法:通过扫描电镜及间接免疫荧光观察雷帕霉素联合CD34抗体复合支架体外捕获外周血内皮祖细胞形态及其分化特征。通过荧光显微镜观察雷帕霉素联合CD34抗体复合支架植入兔耳动脉后捕获内皮祖细胞情况及支架片段的内皮化程度。结果与结论:扫描电镜观察到CD34抗体涂层支架可捕获直径6-8μm的纺锤状细胞,24 h时细胞变得充盈饱满。所捕获细胞具有内皮祖细胞的外形特征。间接免疫荧光观察CD34抗体支架表面可见大量血管内皮生长因子受体2阳性细胞黏附的红色荧光斑点。免疫荧光观察到CD34抗体涂层支架植入兔耳动脉24 h大部分被血管内皮细胞所覆盖,48 h达到完全覆盖,未见细胞异常聚集。结果表明雷帕霉素联合CD34抗体复合支架能特异性快速捕获外周血液中的血管内皮祖细胞,植入体内48 h即可完成血管内皮细胞覆盖,实现了支架快速内皮化,可促进内皮细胞修复。

脐血CD34^+造血干/祖细胞基因表达图谱的研究

目的通过脐血CD34+造血干/祖细胞的基因表达分析,理解造血干/祖细胞生物学特性。方法利用Min-iMACS免疫磁珠法从脐血细胞中分离CD34+造血干/祖细胞,提取总RNA,用SMART-PCR技术从微量RNA中扩增产生足够量的cDNA用于高密度点阵膜分析检测CD34+造血干/祖细胞表达的基因。结果在所检测的588个基因中,发现63个基因具有显著的表达水平,其中18个基因强表达。这些基因主要涉及造血干细胞增殖、分化、应激响应、凋亡、转录调节以及细胞周期等。结论对理解脐血干/祖细胞生物学性质以及指导造血干细胞体外培养提供了分子生物学基础。

CD34^+造血干/祖细胞蛋白质组双向电泳图谱的建立

目的探讨骨髓(BM)和动员后外周血(MPB)CD34+细胞的蛋白质差异表达情况。方法应用免疫磁珠法分离、纯化正常人骨髓和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员后外周血单个核细胞(MNCs)中的CD34+细胞,冻融法提取CD34+细胞的全细胞蛋白质进行双向电泳,并对电泳结果进行图像分析。结果纯化后CD34+细胞的平均纯度为(92.33±2.65)%;每次纯化获得的CD34+细胞数平均为(1.12±0.42)×106个。优化的双向电泳技术获得较为理想的蛋白质组图谱,显示出不同来源的CD34+细胞存在不同的蛋白质表达。结论免疫磁珠联合双向电泳适用于造血干/祖细胞的蛋白质组研究,骨髓和动员后外周血CD34+细胞的蛋白质表达存在差异。

脐血CD34^+细胞及红系祖细胞扩增的实验研究

脐血是造血祖细胞的丰富来源之一,选择合适的培养条件,体外诱导其定向扩增为红系祖细胞,输入体内产生成熟红细胞。本实验旨在探讨脐血单个核细胞(MNC)体外红系定向扩增的理想因子组合(Flt3配基FL联合TPO、SCF、EPO及FL、SCF、TPO)对CD34+细胞扩增的影响。将单个核细胞接种至stemspan无血清培养液中,共分3组:A组为对照组,B组为TPO+SCF+FL+EPO+IGF1组,C组为TPO+SCF+FL组,C组在第6天及以后换液加入EPO和IGF1。于培养0、6、10、14天进行细胞计数,细胞集落测定,流式细胞术测定细胞的CD34、CD34CD71、CD71GPA细胞的比例。结果表明:经10天培养后,B组总细胞数扩增6.89倍,而C组3.06倍;B组CD34+细胞增加4.83,而C组2.47倍;B组集落形成细胞数增加4.3倍,而C组增加2.5倍;B组红系祖细胞BFUE和CFUE数增加5.4倍,而C组3.1倍;B组CD34+CD71+细胞数增加8.72倍,而C组3.37倍;B组CD71+GPA+细胞数增加53.4倍,而C组30.29倍。结论:脐血MNC在无血清培养液中加入FL+SCF+TPO实现了CD34+细胞及集落形成细胞的扩增。脐血MNC在无血清培养液中加入FL+SCF+TPO+EPO+IGF1短期液体培养获得红系祖细胞的扩增,在第0天比6天加入EPO获得更多红祖细胞(P<0.05)。由于TPO+SCF+FL+EPO+IGF1组的集落形成细胞数、CFUE和BFUE数于第10天最多。

内皮祖细胞与冠心病患者CD14^++CD16^+单核细胞共培养后移植心肌梗死大鼠对血管密度及心肌梗死面积的影响

目的研究内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)与冠心病患者CD14^++CD16^+单核细胞共培养后移植心肌梗死大鼠对血管密度及心肌梗死面积的影响。方法比较冠心病患者及健康志愿者外周血中CD14^++CD16^+单核细胞水平,将冠心病患者外周血中分选出的CD14^++CD16^+单核细胞与健康志愿者的EPC体外共培养观察其对EPC的增殖、迁移、黏附的影响后,将CD14^++CD16^+单核细胞与EPC共培养的细胞移植进入心肌梗死大鼠模型,观察其对大鼠缺血心肌新生血管密度、坏死心肌面积及心功能指标的影响。结果冠心病患者外周血中CD14^++CD16^+单核细胞水平显著高于健康志愿者(P<0.05);冠心病患者外周血中CD14^++CD16^+单核细胞与健康志愿者的EPC体外共培养后增殖能力、黏附细胞数、迁移细胞数均显著降低(P<0.05);与假手术组大鼠相比,移植4周后模型组、EPC组、CD14^++CD16^+共培养组左心室梗死面积均显著升高(P<0.05),且EPC组<CD14^++CD16^+共培养组<模型组(P<0.05),新生毛细血管密度、左心室射血分数、左心室短轴缩短率均显著降低(P<0.05),且EPC组>CD14^++CD16^+共培养组>模型组(P<0.05)。结论冠心病患者外周血中CD14^++CD16^+单核细胞水平升高,并抑制EPC修复及逆转左室重塑,改善心肌功能的生理作用。

青蒿琥酯对K562细胞和脐血CD34^+造血干/祖细胞的选择性作用

目的探讨青蒿琥酯(artesunate,AST)对K562细胞和正常造血干/祖细胞是否具有选择性作用。方法选用K562细胞及脐血CD34+造血干/祖细胞,加入不同浓度AST。MTT法检测药物对上述两种细胞增殖的影响;甲基纤维素半固体培养法考察AST对其体外扩增和多向分化能力的影响;以流式细胞术Annexin V-FITC-PI双染定量检测细胞凋亡率;Western blot方法检测BCR-ABL融合蛋白的表达。结果青蒿琥酯对K562细胞有明显的抑制增殖和诱导凋亡的作用(P<0.01),并存在时效和量效关系,对集落抑制作用明显(P<0.01)。青蒿琥酯在12.5~25μg/ml作用48h对脐血CD34+造血干/祖细胞增殖抑制作用和诱导凋亡作用不明显(P>0.05),对集落生成亦无明显抑制作用(P>0.05)。经青蒿琥酯作用48h,K562细胞BCR-ABL蛋白以剂量依赖方式被降解(P<0.01)。结论青蒿琥酯在一定浓度范围内对K562细胞具有选择性抑制增殖和诱导凋亡的作用,对脐血CD34+造血干/祖细胞影响较小。

脐血CD34^+细胞向内皮细胞定向诱导分化的实验研究

目的探讨人脐血CD34+细胞体外分离、纯化、诱导扩增和分化为内皮细胞的可行性,并检测其表型。方法采集新鲜脐血经抗凝处理及无菌包装,Ficoll密度梯度离心法得单个核细胞,磁珠分选方法(MACS)分离出CD34+单个核细胞,M-199培养基中诱导分化,细胞形态学观察CD34+和CD34-细胞生长情况,流式细胞仪检测内皮细胞CD31表型,免疫组化验证蛋白水平表达。结果细胞形态学观察发现,刚分离的CD34+和CD34-单个核细胞呈圆形,形态小。CD34+细胞培养3d后有明显集落形成,7d后呈梭行细胞,出现典型线样排列结构。经诱导培养后,内皮细胞表型CD31阳性率为(70.03±10.27)%。免疫组化染色证实了内皮特异性成分ecNOS和flk-1/KDR蛋白水平的表达。而CD34-细胞单独培养,少部分细胞贴壁,呈现出不规则形态。结论MACS法分离脐血CD34+细胞,体外诱导扩增和分化后贴壁细胞具有内皮细胞形态,通过流式细胞仪和免疫组化验证了贴壁细胞中大部分细胞具有内皮系标志物表达。

体外诱导骨髓CD34^+细胞生成血管内皮细胞的方法

目的 体外分离狗骨髓CD34+ 细胞 ,建立诱导分化血管内皮细胞的方法 ,并进行生物学鉴定。方法 利用免疫磁珠法分离狗骨髓CD34+ 细胞 ,在体外经血管内皮细胞生长因子 (VEGF)、内皮细胞生长因子 (EGF)、碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)诱导后 ,观察细胞生长状况 ,以光镜、电镜进行形态学鉴定 ,应用免疫组化方法检测冯维靳布兰德因子 (VonWillebrandfactor ,vWF)表达。结果 光镜下细胞单层融合生长 ,呈铺路石样形态 ,单个核位于中央 ,细胞群体倍增时间为 35h。电镜下可见到Weibel-Palade小体 ,在细胞胞浆vWF染色阳性。结论 采用免疫磁珠法可从骨髓获得高纯度的CD34+ 细胞 ,在体外诱导分化成血管内皮细胞。