常压高浓度氧对新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤与Nrf2/HO-1信号通路的影响分析

目的探究常压高浓度氧(NBO)对新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤及核因子E2相关因子2/血红素氧合酶-1(Nrf2/HO-1)信号通路的影响。方法取新生SD大鼠45只,采用随机数字表法分为常氧组、NBO组和NBO+Nrf2激活剂组,每组各15只。常氧组大鼠置于普通空气(21%氧气)中饲养,NBO组和NBO+Nrf2激活剂组大鼠置于90%常压氧气饲养,NBO+Nrf2激活剂组每日灌胃5 mg/kg Nrf2激动剂莱菔硫烷。测定脑组织伊文思蓝(EB)含量,采用酶联免疫法检测血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)含量,干湿重法检测脑组织含水量,HE染色和TUNEL染色观察脑组织病理变化,蛋白质印迹法检测海马组织Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达,水迷宫检测大鼠认知功能。结果与常氧组比较,NBO组脑组织EB、VEGF、MMP-9含量及脑组织含水量升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组脑组织EB、VEGF、MMP-9含量及脑组织含水量降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。病理染色结果显示,常氧组大鼠神经细胞形态及结构完整,未见明显病理变化和细胞凋亡;NBO组神经细胞形态及结构不规则,出现明显的水肿和空泡,并伴有大量的凋亡细胞;NBO+Nrf2激活剂组脑组织病理损伤较NBO组明显减轻。与常氧组比较,NBO组脑组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组Nrf2、HO-1蛋白相对表达量升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与常氧组比较,NBO组第2~4天逃避潜伏期延长,穿越平台次数减少,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组第2~4天逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增多,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论NBO可诱导新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤,导致远期认知功能障碍,可能与下调Nrf2/HO-1信号通路表达有关。

肿瘤内皮标记物1通过丝裂原活化蛋白激酶途径介导内皮细胞对血管新生及对心力衰竭心肌重塑

目的 基于肿瘤内皮标记物1(TEM1)介导的丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)途径,探讨内皮细胞对血管新生及对心力衰竭心肌重塑的作用。方法 将小鼠随机分成4组,包括假手术组、MI组、MI+sh-NC组和MI+sh-TEM1组。在心肌梗死(MI)后第7天通过免疫荧光染色检测梗死边缘区EndMT的变化,第28天通过超声心动图评估小鼠的心脏功能。小鼠主动脉内皮细胞(MAECs)分为3组:对照组、Vector组和rTEM1组。此外,用MAPK抑制剂SB203580预处理MAECs,用rTEM1处理细胞48 h。通过Western blot评估内皮细胞中EndMT和MAPKs信号通路的变化。结果 在梗死边缘区的心肌中,TEM1水平在MI后第1天轻微增加,在第7天显著达到峰值,然后在第28天降低。与Vector组相比,rTEM1组MAECs中VE-Cadherin蛋白表达显著下降(P <0.05),和α-SMA、波形蛋白蛋白水平、相对迁移距离、侵袭细胞数和形成分支数量显著增加(P <0.05)。SB203580逆转了由rTEM1诱导MAECs的这些变化。与MI组相比,MI+sh-TEM1组中的CD31+Vimentin+共染色水平显著降低(P <0.01)。在第28天,MI+sh-TEM1组小鼠的LVEF和LVFS均较MI组显著增强(P <0.05)。与MI组相比,MI+sh-TEM1组小鼠的内皮细胞中p-P38/P38和p-JNK/JNK蛋白表达降低。结论 TEM1诱导的EndMT和血管生成参与了MI诱导心肌重塑的发病机制,其作用机制与MAPKs信号通路激活有关。

内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的影响:生物信息学分析和实验验证

背景:血管新生是心血管疾病的主要干预靶点,骨形态发生蛋白2具有调控血管新生作用,但内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的调控作用不清楚。目的:探讨内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的影响。方法:(1)生物信息学分析:通过Panglao DB公共基因表达数据库单细胞转录组荟萃分析观察骨形态发生蛋白2细胞群表达丰度和定位。血管新生小鼠和内皮(心内膜)过表达骨形态发生蛋白2小鼠转录组测序数据集探索内皮细胞骨形态发生蛋白2对血管新生信号通路的调控作用。(2)体内实验验证:建立小鼠后肢缺血模型,对比模型小鼠患侧与健侧缺血后肢7,14和21 d血流灌注情况,免疫荧光和免疫组织化学染色评估小鼠骨形态发生蛋白2和CD31的表达定位情况。(3)体外实验验证:体外培养人脐静脉内皮细胞,分为对照组、缺氧组和骨形态发生蛋白2抑制剂(Noggin蛋白)干预组,培养24 h,观察各组内皮细胞血管新生情况。结果与结论:(1)内皮细胞是表达骨形态发生蛋白2的重要细胞亚群,在血管新生内皮细胞和骨形态发生蛋白2过表达内皮细胞转录组再分析均发现骨形态发生蛋白2表达明显升高,血管新生通路明显激活。(2)缺血7 d小鼠新生血管周围骨形态发生蛋白2阳性血管明显增加(P<0.05),缺血2周骨形态发生蛋白2阳性血管明显减少(P<0.001)。(3)体外培养人脐静脉内皮细胞,缺氧干预后,内皮细胞迁移能力和血管出芽明显增加,血管新生因子血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子的表达明显升高,Noggin明显减少了缺氧诱导的内皮细胞血管新生(P<0.001),并下调血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子的表达(P<0.01)。(4)结果证实,内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2具有调控血管新生作用,靶向性内皮细胞骨形态发生蛋白2可望改善血管新生。

黄芪甲苷与丹参酮ⅡA配伍拮抗内皮细胞糖氧剥夺损伤促进血管新生

目的观察益气活血药对黄芪、丹参的有效活性成分黄芪甲苷(AstragalosideⅣ,AS-Ⅳ)与丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA,TanⅡA)配伍拮抗内皮细胞糖氧剥夺(Oxygen-glucose deprivation,OGD)损伤的效应,探索其促进血管新生的作用及机制。方法通过体外培养内皮细胞建立OGD损伤模型,实验设置对照组、模型组、AS-Ⅳ组、TanⅡA组和配伍组。分别采用CCK-8法、Transwell、体外血管形成实验观察AS-Ⅳ与TanⅡA配伍对内皮细胞增殖、迁移、成管能力的影响;利用AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测内皮细胞的凋亡情况;免疫印迹法检测VE-cadherin、TGF-β1、VEGFA、eNOS的蛋白表达;免疫荧光法检测CD31、eNOS的蛋白表达;同时采用酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液中一氧化氮(Nitric oxide,NO)的浓度。结果与正常对照组相比,糖氧剥夺使HUVECs增殖、迁移与成管功能受损,诱导细胞凋亡,降低VEcadherin、TGF-β1、VEGFA、CD31、eNOS的蛋白表达以及NO含量(P<0.01)。药物配伍组与模型组相比能修复损伤的内皮细胞,促进其增殖、迁移和成管,抑制糖氧剥夺诱导的细胞凋亡,提高VE-cadherin、TGF-β1、VEGFA、CD31、eNOS的蛋白表达以及NO含量(P<0.05)。结论AS-Ⅳ与TanⅡA配伍具有拮抗内皮细胞糖氧剥夺损伤、激活血管新生反应的作用,其机制可能是激活eNOS,促进内皮细胞NO的生成与释放。

抵抗素样分子α对小鼠主动脉内皮细胞形成新生血管能力的影响及机制探讨

目的探讨抵抗素样分子α(又称FIZZ1)对小鼠主动脉内皮细胞形成新生血管能力的影响及机制。方法分别使用10 nmol/L、20 nmol/L和40 nmol/L的FIZZ1刺激小鼠主动脉内皮细胞,使用内皮细胞成管实验和内皮细胞迁移实验体外验证FIZZ1在内皮细胞迁移及血管形成中的作用;采用高通量测序检测FIZZ1对小鼠主动脉内皮细胞信号通路的影响,筛选出表达有显著差异的信号通路。结果在不同浓度的FIZZ1刺激下,小鼠主动脉内皮细胞血管形成的面积逐步增加,40 nmol/L的FIZZ1促进血管生成的作用最强。随着FIZZ1浓度的增加,内皮细胞迁移数量增多,迁移能力逐步增强。高通量基因测序检测中发现共有1253个基因出现了差异性表达,包括427个上调基因和826个下调基因,其机制可能与COL1A1、FLT4、ITGA3等基因表达显著性差异有关。结论FIZZ1能在体外使小鼠主动脉内皮细胞形成新生血管,其机制可能与COL1A1、FLT4、ITGA3等基因表达显著性差异有关。

脐带血间充质干细胞对角膜新生血管形成的抑制作用

目的:研究球结膜下注射人脐带血来源的间充质干细胞悬液治疗角膜碱烧伤新生血管的有效性。方法:本研究将30只新西兰家兔制备右眼碱烧伤模型,随机分实验组和对照组各15只(15眼)。实验组球结膜下注射脐带血来源间充质干细胞悬液,对照组不给予球结膜下治疗。采用裂隙灯生物显微镜观察并拍照记录注射后第5天,14天角膜新生血管情况,计算角膜新生血管面积。取两组角膜进行HE染色,观察角膜上皮愈合情况。结果:实验结果显示,第5天实验组和对照组之间的角膜新生血管面积差异没有显著性统计意义(P > 0.05),但第14天实验组的新生血管面积显著小于对照组(P < 0.05)。结论:本研究结果证明,球结膜下注射人脐带血间充质干细胞可抑制角膜新生血管并促进碱烧伤角膜上皮的修复。

bFGF抗体对人结直肠癌相关内皮细胞增殖、迁移、血管新生的影响和机制研究

目的探究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)抗体对人结直肠癌相关内皮细胞增殖、迁移、血管新生及转录激活因子3(STAT3)通路的影响。方法以结直肠癌LOVO细胞培养上清诱导人脐静脉内皮(HUVECs)细胞形成的结直肠癌相关内皮细胞为研究对象。采用CCK-8法和成管实验测定bFGF抗体对bFGF刺激内皮细胞增殖、迁移、成管功能的影响。采用Western blotting法测定STAT3通路蛋白表达。结果与抗体组比较,不同浓度联合组的内皮细胞增殖抑制率均明显升高(t分别=13.65、25.95、55.07、32.43,P均<0.05);与对照组比较,不同浓度抗体组内皮细胞迁移距离明显缩短(t分别=3.69、7.19、7.29、14.34,P均<0.05),且各组抑制率升高和迁移距离缩短均呈剂量依赖性(t分别=19.57、18.00、5.59;3.51、3.46、4.77,P均<0.05)。与对照组比较,抗体组、雷抗组、联合组内皮细胞管腔形成数目均明显减少(t分别=2.58、13.85、17.16,P均<0.05),雷抗组和联合组数量明显少于抗体组,联合组明显少于雷抗组(t分别=3.14、6.15、6.67,P均<0.05)。与bFGF组比较,不同浓度抗体组细胞中pSTAT3蛋白相对表达量均明显下降(t分别=2.21、6.14、10.60、14.16,P均<0.05),且下降随着抗体浓度升高而降低(t分别=3.59、3.41、6.23,P均<0.05)。结论bFGF抗体对bFGF刺激的细胞增殖、迁移及血管新生等功效具有明显抑制作用,抑制作用存在剂量效应,且可能与抑制STAT3磷酸化有关。

小鼠角膜新生血管内皮细胞的分离培养及其趋化因子受体的表达

背景研究角膜新生血管生成的病理机制对角膜新生血管的治疗具有重要意义，但目前的相关研究多采用非角膜新生血管来源的血管内皮细胞，研究结果的可靠性受到一定影响。目的探索从碱烧伤诱导实验性小鼠角膜新生血管组织中分离和培养血管内皮细胞的方法，并检测新生血管内皮细胞中趋化因子受体的表达，为角膜新生血管内皮细胞的生物学特性研究奠定基础。方法7—8周龄SPF级健康雄性BALB／c小鼠10只，采用NaOH碱烧伤法构建小鼠实验性角膜新生血管模型，采用免疫荧光技术检测CD31在角膜新生血管中的表达。在碱烧伤后2周摘取眼球分离角膜组织，眼科手术剪剪碎角膜组织后应用胶原酶D消化获取单个细胞，使用包被CD31抗体的磁珠分选获取血管内皮细胞。采用免疫组织化学染色法检测CD31在细胞中的表达以鉴定培养的细胞，采用逆转录PCR法检测血管内皮细胞中趋化因子受体基因的表达。结果碱烧伤后7d裂隙灯显微镜下可见小鼠左眼角膜出现新生血管，碱烧伤后2周角膜新生血管的形成达高峰，免疫荧光检测可见角膜组织内特异性CD31染色的血管网。角膜新生血管血管内皮细胞培养后2h贴壁生长，形态呈扁平多边形，体积较大，传代培养后细胞生长速度明显加快。培养的角膜新生血管内皮细胞CD31表达阳性，细胞质中呈棕黄色染色，而角膜基质细胞中CD31表达阴性。逆转录PCR结果显示分离培养的血管内皮细胞中CCR1、CCR2、CCR3和CCR4mRNA相对表达量最高，CXCR3、CCR6、CCR10和CX3CRlmRNA呈中等强度表达，CCR5、CCR8mRNA相对表达量较低，而CCR9、CXCR4和CXCR5mRNA表达未检测到。结论CD31抗体的磁珠分选法可有效分离纯化小鼠角膜新生血管内皮细胞，并可进行体外培养且培养的细胞可表达趋化因子受体。

天麻素与薯蓣皂苷元配伍对大鼠缺氧损伤脑微血管内皮细胞的保护作用

目的探讨天麻素(Gas)、薯蓣皂苷元(Dio)及其组合物(GDC)对大鼠缺氧损伤脑微血管内皮细胞(BMECs)的保护作用和对脑微血管新生的影响及其作用机制。方法将BMECs分为5组:正常对照组,模型对照组,Gas组(1、2、4、8、16、32μmol·L^(-1)),Dio组(0.25、0.5、1、2、4、8μmol·L^(-1)),GDC组(Gas和Dio浓度分别为1和0.25、2和0.5、4和1、8和2、16和4、32和8μmol·L^(-1))。分组给药12 h后,对模型对照组、Gas组、Dio组和GDC组通过氧糖剥夺法建立BMECs缺氧模型。检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、白细胞介素1β(IL-1β)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)浓度;观察Hoechst 33258、FITC-Annexin V/PI染色,采用Transwell小室实验、细胞划痕实验和小管形成实验,考察Gas、Dio及GDC对缺氧损伤BMECs的保护作用及促进血管新生作用。进一步利用网络药理学和分子对接方法研究GDC抗脑缺血的作用机制。结果Gas、Dio以2、0.5μmol·L^(-1)组合时,可显著提高缺氧损伤BMECs细胞活力(P<0.05),促进细胞增殖;与模型对照组比较,Gas组LDH漏出率降低(P<0.05);Gas组、Dio组与GDC组IL-1β含量均显著下降(均P<0.05),Gas组、GDC组SOD活力升高(P<0.05),Gas组、Dio组以及GDC组凋亡小体减少。GDC可促进BMECs缺氧模型的增殖、侵袭、迁移以及小管形成,表明其在细胞水平上一定程度促进血管新生。网络药理学研究发现,Gas与半胱天冬酶3(CASP3)、过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARG)、凝血因子Ⅱ(F2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)1蛋白具有良好的结合活性,Dio与内皮一氧化氮合成酶(NOS3)、KDR蛋白具有良好的结合活性,Gas、Dio可能主要通过血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt信号通路以及缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路调控脑缺血后血管新生。结论Gas、Dio及GDC具有抗缺氧损伤作用并可促进缺氧损伤后血管新生,作用机制可能与其作用于Akt1、NOS3、VEGFR2等蛋白,调控VEGF/Akt/MAPK等信号通路促进血管新生有关。

脑络欣通促进氧糖剥夺/再灌注损伤大鼠的脑微血管内皮细胞血管新生:基于激活caspase-1/Gasdermin D/通路

目的探讨脑络欣通(NLXTD)含药血清对氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)焦亡及血管新生的影响和可能作用机制。方法BMECs体外培养,分别经OGD/R诱导、NLXTD含药血清处理及siRNA转染caspase-1,设置Control组:BMECs+10%空白血清;OGD/R组:BMECs+OGD/R+10%空白血清;NLXTD组:BMECs+OGD/R+10%NLXTD含药血清;siRNA-NC组:BMECs转染siRNA-NC+OGD/R+10%空白血清;si-caspase-1组:BMECs转染si-caspase-1+OGD/R+10%空白血清;si-caspase-1+NLXTD组:BMECs转染si-caspase-1+OGD/R+10%NLXTD含药血清。采用CCK-8法、Transwell小室实验、管腔形成实验分别检测细胞增殖、迁移、成管能力;试剂盒测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;ELISA法检测培养液中炎性因子IL-1β、IL-18的含量;Western blot检测细胞焦亡相关蛋白pro-caspase-1、caspase-1、NLRP3、Gasdermin D及血管生成关键蛋白VEGF,VEGFR2的表达。结果BMECs经OGD/R诱导后出现明显的损伤;与OGD/R组比较,10%的NLXTD含药血清能显著提高OGD/R损伤BMECs的存活率、迁移能力及成管能力(P<0.01),降低IL-1β、IL-18的含量以及LDH的释放(P<0.01);Western blot实验结果显示,NLXTD含药血清可上调OGD/R损伤BMECs的VEGF和VEGFR2蛋白表达(P<0.01),并降低pro-caspase-1、caspase-1、NLRP3、Gasdermin D的蛋白表达(P<0.01),加入caspase-1 siRNA后,能进一步促进VEGFR2蛋白表达(P<0.01)。结论NLXTD可以提高OGD/R损伤后的BMECs增殖、迁移、成管能力,促进血管新生,其机制可能与抑制细胞焦亡caspase-1/Gasdermin D通路,减轻BMECs损伤,上调VEGF、VEGFR2水平有关。

糖尿病氧化应激环境中α-Klotho对巨噬细胞-血管内皮细胞串扰的影响

目的:探讨糖尿病氧化应激环境中过表达α-Klotho(KL)的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增生、迁移、管腔形成以及紧密连接的影响。方法:将RAW264.7细胞分为对照组、4-羟壬二酸酯(4HNE)组、4HNE+KL组,采用免疫荧光实验检测RAW264.7细胞F4/80的表达。制备3组细胞的条件培养基用于培养HUVECs,分为M-NC组、M-4HNE组和M-4HNE+KL组。采用CCK8实验检测血管内皮细胞增生,采用划痕实验和Transwell实验检测迁移,采用管腔形成实验检测管腔形成,采用Western blot实验检测闭合蛋白5(Claudin 5)、咬合蛋白(Occludin)、带状闭合蛋白1(ZO 1)表达水平。结果:免疫荧光实验结果显示,4HNE组RAW264.7细胞F4/80荧光强度较对照组明显增强,而4HNE+KL组F4/80荧光强度较4HNE组明显减弱(均P<0.05)。CCK8实验结果显示,相比于M-NC组,M-4HNE组HUVECs增生显著增加,而M-4HNE+KL组HUVECs增生较M-4HNE组显著下降(均P<0.01)。划痕实验和Transwell实验结果显示,相比于M-NC组,M-4HNE组HUVECs迁移显著增强,而M-4HNE+KL组HUVECs迁移较M-4HNE组显著减弱(均P<0.01)。管腔形成实验结果显示,相比于M-NC组,M-4HNE组HUVECs管腔数显著增加,而M-4HNE+KL组管腔数较M-4HNE组显著下降(均P<0.01)。Western blot实验结果显示,相比于M-NC组,M-4HNE组HUVECs中Claudin 5、Occludin、ZO 1蛋白的相对表达量明显减少,而M-4HNE+KL组Claudin 5、Occludin、ZO 1蛋白的相对表达量较M-4HNE组明显增加(均P<0.01)。结论:KL通过改变糖尿病氧化应激环境中巨噬细胞激活状态抑制了HUVECs的增生、迁移、管腔形成,并增强了HUVECs的紧密连接。

miR-1-3p调控ANXA2表达对高糖诱导的视网膜微血管内皮细胞新生血管生成的影响

目的 探讨微小RNA-1-3p(miR-1-3p)/膜联蛋白A2(ANXA2)分子轴在高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(HRMECs)新生血管生成过程中的作用机制。方法 体外培养HRMECs并采用高糖(HG)处理细胞建立细胞损伤模型。HRMECs分组处理:Con组(含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养)、HG组(25 mmol·L^(-1)D-葡萄糖培养)、HG+miR-NC组(转染miR-NC)、HG+miR-1-3p组(转染miR-1-3p mimics)、HG+sh-NC组(转染sh-NC)、HG+sh-ANXA2组(转染sh-ANXA2)、HG+miR-1-3p+pcDNA组(转染miR-1-3p mimics+pcDNA)、HG+miR-1-3p+pcDNA-ANXA2组(转染miR-1-3p mimics+pcDNA-ANXA2)。转染48 h后收集细胞,采用25 mmol·L^(-1)的D-葡萄糖培养基培养HRMECs 24 h。采用MTT、Transwell小室实验分别检测细胞活力、迁移细胞数。管腔形成实验检测管腔形成数。双荧光素酶报告实验检测miR-1-3p与ANXA2的靶向关系。Western blot检测VEGF、MMP-2蛋白水平。结果 与Con组比较,HG组miR-1-3p表达水平降低,ANXA2 mRNA及蛋白水平均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与Con组比较,HG组细胞活力升高,迁移细胞数、管腔形成数增多,VEGF、MMP-2蛋白水平升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与HG+miR-NC组比较,HG+miR-1-3p组细胞活力降低,迁移细胞数、管腔形成数减少,VEGF、MMP-2蛋白水平降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与HG+sh-NC组比较,HG+sh-ANXA2组细胞活力降低,迁移细胞数、管腔形成数减少,VEGF、MMP-2蛋白水平降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与HG+miR-1-3p+pcDNA组比较,HG+miR-1-3p+pcDNA-ANXA2组细胞活力升高,迁移细胞数、管腔形成数增多,VEGF、MMP-2蛋白水平升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 miR-1-3p过表达可通过靶向调控ANXA2表达抑制HRMECs的增殖、迁移及新生血管生成。

角膜新生血管治疗的研究新进展

生理状态下角膜中的血管生成因子和抗血管生成因子存在平衡,多种外界因素破坏了对其保持平衡作用的正常保护措施,例如感染、炎症、缺氧、外伤、角膜变性和角膜移植术均能破坏角膜结构的正常保护措施,从而促进角膜新生血管(CNV)的形成。CNV的形成可能是目前世界范围内导致视力水平下降严重的主要原因之一,严重时可致盲。因此,抑制CNV的形成具有十分积极重要的医学临床诊断意义。本文将对CNV的治疗新进展作一综述。

LMO4在小鼠胚胎干细胞分化为血管内皮细胞和血管生成中的作用

目的探讨转录因子LIM结构域蛋白4(LMO4)在小鼠胚胎干细胞(mESC)分化为血管内皮细胞及新生血管中的作用。方法使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从小鼠红系白血病细胞系MEL)中克隆小鼠Lmo4的cDNA,并亚克隆到含有小鼠胎肝激酶-1(Flk-1)启动子驱动表达Gfp的载体(pFG),构建成血管细胞特异性表达的LMO4的载体pFLG。将表达载体转染mESC,通过遗传霉素(G418)筛选,获得mESC/pFG和mESC/pFLG的细胞株;将这些mESC在体外进行自我分化,以形成4 d和10 d的胚胎体(EB),并进行成血管细胞的集落细胞形成实验(BL-CFC);以10 d-EB进行新生血管出芽实验,观察和分析出芽长短、数目;运用蛋白免疫印迹(Western blot)或定量RT-PCR方法对目的基因的表达进行检测。结果PCR结果证实成功构建了成血管细胞特异性表达的LMO4的表达载体pFLG。通过G418筛选获得mESC/pFG和mESC/pFLG的细胞株。这些mESC通过自我分化形成4 d-EB和10 d-EB,荧光显微镜下观察到EB内均可见绿色荧光标记的细胞。Western blot检测显示:与mESC相比,4 d-EB和10 d-EB的LMO4的表达显著增加。过量表达LMO4的mESC/pFLG产生BL-CFC效率为(7.70%±1.27%),而mESC/pFG细胞产生BL-CFC效率为(1.15%±0.48%),二者差异有统计学意义(P=0.021)。定量RT-PCR结果显示,Flk-1、C-kit、Tie-2、Ve-cad基因在10 d-EB/pFLG中的表达,均较10 d-EB/pFG中表达增加2倍以上。新生血管出芽实验结果显示,10 d-EB/pFLG的新生血管数量和长度均较10 d-EB/pFG增加(P<0.05)。结论过量表达LMO4促进mESC形成成血管细胞,并有利于血管内皮细胞的分化和血管的新生。

腺病毒介导的肝细胞生长因子/血管内皮生长因子165对大鼠超比例随意皮瓣成活的影响及机制研究

目的:观察术前注射腺病毒介导的肝细胞生长因子/血管内皮生长因子165(Ad-HGF/VEGF165)对大鼠超比例随意皮瓣成活的影响和其机制的初步研究。方法:大鼠背部设计超比例随意皮瓣模型,将其随机分为Ad-HGF/VEGF165组、AdVEGF165组和对照组。术前7 d,Ad-HGF/VEGF165组和Ad-VEGF165组分别于大鼠皮瓣及创缘内多点注射Ad-HGF/VEGF165及AdVEGF165,对照组注射等容量0.9%氯化钠注射液。分别于术后7 d、14 d观测皮瓣成活面积,切取皮瓣组织标本HE染色、免疫组化观察微血管密度及组织间VEGF阳性率等指标,WesternBlot检测目的蛋白表达情况。结果:术后7 d、14 d,Ad-HGF/VEGF165组、Ad-VEGF165组皮瓣存活面积、组织间微血管数目、VEGF及细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)蛋白表达情况均高于对照组(P<0.001),且Ad-HGF/VEGF165组明显高于Ad-VEGF165组(P<0.05)。结论:Ad-HGF/VEGF165具有协同作用,能显著促进VEGF和ERK1/2信号因子表达,短期内促进血管网重建,改善皮瓣血液灌注,提高大鼠超比例随意皮瓣成活面积。

毒解温通方对急性缺血性脑卒中气虚血瘀证病人神经细胞凋亡及血管内皮新生的影响

目的:观察毒解温通方对急性缺血性脑卒中气虚血瘀证病人神经细胞凋亡及血管内皮新生的影响。方法:选取2018年5月—2021年9月我院收治的急性缺血性脑卒中病人116例,所有病人中医辨证分型均为气虚血瘀证。将病人随机分为两组,对照组行常规治疗,观察组在常规治疗基础上联合毒解温通方治疗。比较两组细胞凋亡因子、血管内皮新生指标、美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分、Barthel指数、中医证候积分,改良Rankin量表评定的有效率、神经功能疗效和不良反应。结果:治疗后,两组脑源性神经营养因子(BDNF)、B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)水平、Barthel指数、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板源性生长因子(PDGF)水平高于治疗前,半胱天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、可溶性细胞凋亡因子(sFas)、NIHSS评分和中医证候积分较治疗前均降低,且观察组均优于对照组(P<0.05)。观察组改良Rankin量表评定的总有效率为86.21%,高于对照组的70.69%,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组神经功能总有效率为91.38%,高于对照组的75.86%,差异有统计学意义(P=0.024)。结论:毒解温通方辅助治疗急性缺血性脑卒中气虚血瘀证可抑制神经细胞凋亡,促进血管内皮新生,改善病人预后。

Ahmed青光眼引流阀植入术治疗新生血管性青光眼对角膜内皮细胞密度及眼压的影响

目的:探究Ahmed青光眼引流阀植入术治疗新生血管性青光眼对角膜内皮细胞密度及眼压的影响。方法:选择2013-06/2016-06于我院治疗的新生血管性青光眼患者200例200眼,所有患者均采用Ahmed青光眼引流阀植入术治疗。对患者的病历资料进行回顾性分析,评价手术完成情况,记录术前、术后1wk,1mo,1a的眼压、角膜内皮细胞密度,视力、并发症发生情况。结果:所有患者中手术完全成功率为81.0%,条件成功率92.0%;手术前后视力无光感、手动~0.01、0.02~0.05、0.06~<0.10、≥0.10人数比例比较差异无统计学意义(P>0.05);术前眼压42.43±3.43mmHg,术后1wk,1mo,1a分别为13.45±2.34、15.89±2.67、16.34±2.88mmHg,差异有统计学意义(F=4570.62,P<0.001);术前角膜内皮细胞密度为2453.67±342.34个/mm^2,术后1wk,1mo,1a分别为2216.67±332.32、2087.34±326.45、1959.67±303.34个/mm^2,差异有统计学意义(F=83.42,P<0.001);术后发生前房出血20眼,低眼压13眼,引流阀阀体移位8眼,浅前房21眼。结论:Ahmed青光眼引流阀植入术治疗新生血管性青光眼能够有效控制眼压,但存在角膜内皮细胞丢失现象,能够有效保护并部分改善患者残存视力,并发症较轻且简单干预后好转,是治疗新生血管性青光眼的有效方法。

血管内皮细胞生长抑制因子VEGI_(151)重组腺病毒对角膜新生血管的抑制作用

目的研究以复制缺陷型重组腺病毒为载体的血管内皮细胞生长抑制因子VEGI151对角膜新生血管的抑制作用。方法利用腺病毒载体pCA13构建携带VEGI151基因的质粒,经293A细胞包装、扩增,WesternBlot检测病变细胞内基因的蛋白质表达,体外检测AdVEGI151对ECV304细胞的抑制作用,缝线诱导法建立炎症性兔角膜新生血管模型,给予体内基因治疗。结果VEGI151重组腺病毒在病变细胞内能成功表达相对分子质量为17300的蛋白,体外实验表明,可以强烈抑制静脉内皮细胞的生长,体内实验表明,重组腺病毒对炎症性角膜新生血管的生长具有抑制作用。结论以复制缺陷型重组腺病毒为载体的血管内皮细胞抑制因子VEGI151基因治疗角膜新生血管效果显著,为角膜新生血管的基因治疗提供了新的思路。

外周血来源内皮祖细胞三维血管新生模型的建立及其特性分析

目的观察内皮祖细胞(EPC)在血管新生中的作用及其生物学特性。方法取大鼠外周血分离出EPC,观察其在体外的培养和扩增情况,对培养的EPC进行检测,同时建立三维立体模型并分析。结果成功分离出外周血中的EPC,在平面培养时,各时间点经VEGF诱导的EPC(实验组)其增殖情况均优于无VEGF诱导的EPC(对照组),P<0.01。在由鼠尾胶原凝胶制成的三维基质中EPC向胶原基质内生长,1d内即可出现向胶原内的出芽及浸润,并逐渐形成分支样结构;实验组生长快,向胶原基质内浸润速度快、出芽快,管状结构粗大;而对照组生长慢、出芽慢,管状结构细小,向胶原内浸润的深度浅,网状结构稀疏,不完整;实验组各时相三维基质中新生血管数目均多于对照组(P<0.01)。结论鼠尾胶原凝液可以诱导EPC参与血管新生的迁移、增殖、发芽等步骤;EPC三维基质模型可用于新生血管的研究。VEGF能动员和诱导EPC促进血管新生。

重组人内皮抑素与血管内皮生长抑制因子融合基因对角膜新生血管内皮细胞的协同作用

目的:观察内源性血管抑制因子内皮抑素与血管内皮生长抑制因子融合基因对新生血管内皮细胞增殖的协同抑制作用,分析其作用特异性。方法:实验于2002-06/2003-06在解放军第二军医大学微生物实验室完成。常规分子生物学构建携带融合基因内皮抑素-血管内皮生长因子的重组腺病毒,酶切法、聚合酶链反应法鉴定重组腺病毒-内皮抑素-血管内皮生长因子的正确性,半数细胞感染剂量法测定重组腺病毒滴度。以磷酸盐缓冲液、重组腺病毒-β-半乳糖苷酶和重组腺病毒-血管内皮生长因子151为对照组,病毒滴度均为感染复数(MOI)=20,体外感染人静脉内皮细胞ECV304与小鼠成纤维细胞L9294h,72h后应用反转录-聚合酶链反应和Western印迹法分别检测融合基因细胞内的转录及表达情况;于病毒感染后第1,2,3,4,5和7天,结晶紫染色法检测活细胞数,用570/630nm吸光度(A)值表示,绘制并比较ECV304和L929转基因细胞的生长曲线,观察其作用并分析其作用特异性。结果:①聚合酶链反应法证实成功构建了融合基因重组腺病毒-内皮抑素-血管内皮生长因子,半数细胞感染剂量法测得病毒滴度为2×108pfu/mL。②各组ECV304细胞结晶紫染色检测结果比较:除感染第1天重组腺病毒-血管内皮生长因子151感染组外(P>0.05),其余感染各时相重组腺病毒-血管内皮生长因子151感染组、重组腺病毒-β-半乳糖苷酶感染组及磷酸盐缓冲液组ECV304细胞A值均显著高于重组腺病毒-内皮抑素-血管内皮生长因子感染组(P<0.01)。③各组L929细胞结晶紫染色检测结果比较:重组腺病毒-内皮抑素-血管内皮生长因子感染组、重组腺病毒-β-半乳糖苷酶感染组及磷酸盐缓冲液组L929细胞的A值两两比较,差异均无显著性意义(P>0.05)。结论:重组腺病毒-内皮抑素-血管内皮生长因子在体外能有效表达具有生物学活性的融合基因产物,对静脉内皮细胞的增殖具特异性抑制作用,且较单基因产物的抑制作用更强,可用于治疗角膜新生血管的进一步体内实验。