内皮细胞一氧化氮合成酶基因多态性和缺血性股骨头坏死的相关性研究

目的 观察内皮细胞一氧化氮合成酶（eNOS）基因的内含子4（Intron 4）和外显子7（exon7）等位基因变异和缺血性股骨头坏死（ANFH）发病风险的关系,探索ANFH的遗传易感因素和相关发病机制.方法 无髋关节外伤史的ANFH患者125例,按Ficat标准进行临床诊断和分期,健康人群126例作为对照组.静脉采血提取血细胞基因组DNA,并进行多聚酶链式反应特异性扩增和基因测序,检测eNOS基因Intron 4的27 bp重复序列多态性和exon7的G894T多态性.结果 经基因分析显示ANFH组eNOS内含子4等位基因的b/b型、b/a型、a/a型出现频率为：104/125（83.2％）、19/125（15.2％）、2/125（1.6％）;正常对照组为120/126（95.2％）、6/126（4.8％）、0例（0）.ANFH组的b/a型出现频率明显高于正常对照组（P=0.0001,OR =4.501）.经PCR-RLFP分析eNOS外显子7等位基因的894的G/G野生型、G/T杂合型、T/T纯合突变型的出现频率分别为：ANFH组92/125（73.6％）、30/125（24.0％）、3/125（2.4％）,正常对照组106/126（84.1％）、17/126（13.5％）、3/126（2.4％）;ANFH组的G/T型出现频率明显高于正常对照组（P=0.0094,OR=3.804）.在ANFH组的内含子4序列中,特发性、激素性和酒精性病因的b/a型出现频率分别为11/65（16.9％）、4/27（14.8％）、4/33（12.1％）,其中特发性ANFH患者b/a型出现频率明显高于正常对照组（P=0.0203,OR =2.975）;在ANFH组的外显子7序列中,特发性、激素性和酒精性病因的G/T型出现频率分别为15/65（23.1％）、7/27（23.6％）、8/33（24.2％）,其中特发性ANFH患者G/T型出现频率明显高于正常对照组（P =0.0357,OR =2.205）.结论 内皮细胞一氧化氮合成酶基因的内含子4序列中b/a等位基因的突变使股骨头缺血性坏死的发生率增加,外显子7序列中G894T等位变异也是股骨头缺血坏死的危险因素之一.在产生股骨头缺血性坏死的特发性、激素性、酒精性病因中,内皮细胞一氧化氮合成酶内含子4的b/a等位基因变异和外显子7的G894T变异对特发性股骨头坏死的影响更明显.

兔角膜内皮细胞Na^+-K^+-ATP酶活性检测及其意义

目的:探讨角膜内皮细胞上Na+-K+-ATP酶的活性。方法:运用接膜联合组织块法获得原代及传代培养的兔角膜内皮细胞(RCECs),使用考马斯亮蓝试剂盒及超微量ATP酶测试盒分别测定即兴揭取组、原代7 d组、传二代5 d组的Na+-K+-ATP酶活性。结果:即兴揭取组Na+-K+-ATP酶活性平均为(0.595±0.010)U/mgprot、原代7 d组及传二代5 d组分别为(0.572±0.007)U/mgprot和(0.333±0.011)U/mgprot,任意两两组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:原代RCECs更接近在体细胞。Na+-K+-ATP酶活性定量检测,可作为评价体外培养RCECs的功能指标。

高糖诱导的牛视网膜血管内皮细胞中共济失调毛细血管扩张突变基因激酶活性变化及其对细胞氧化应激状态的影响

目的 观察高糖诱导的牛视网膜血管内皮细胞（BRECs）中共济失调毛细血管扩张突变基因（ATM）激酶的活性变化及其对细胞氧化应激状态的影响.方法 体外培养BRECs,取4-8代细胞用于实验.采用含5 mmol/L葡萄糖（正常糖组）、30 mmol/L葡萄糖（高糖组）、30 mmol/L葡萄糖和10 μmol/LATM激酶特异性抑制剂KU55933（干预组）的细胞培养液培养BRECs.细胞培养48 h后,采用蛋白免疫印迹法检测细胞中磷酸化ATM（P-ATM）、磷酸化细胞分裂素活化蛋白激酶（P-P38）及磷酸化细胞外信号调节激酶（P-ERK） 1/2的蛋白表达水平;酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中血管内皮生长因子（VEGF）的含量;细胞内活性氧（ROS）水平检测试剂盒检测细胞内ROS水平;碘化丙啶和赫斯特染料双染色法检测细胞凋亡情况;异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖检测内皮细胞屏障的通透性.结果 与正常糖组比较,高糖组P-ATM、P-P38、P-ERK1/2蛋白表达均增高;与高糖组比较,干预组P-ATM蛋白表达降低,p-p38、p-ERK1/2蛋白表达明显增加.3组间P-ATM、P-P38、P-ERK1/2蛋白表达比较,差异均有统计学意义（F=436.00、14 010.00、985.10,P＜0.05）.与正常糖组比较,高糖组、干预组细胞上清液中VEGF含量均升高,干预组升高幅度更明显;3组间细胞上清液中VEGF含量比较,差异有统计学意义（F=278.00,P＜0.05）.高糖组ROS含量（t=2.98、10.91）、BRECs细胞凋亡率（t=4.31、11.14）均较正常糖组升高,而又明显低于干预组,差异均有统计学意义（P＜0.05）.与正常糖组比较,高糖组、干预组细胞旁通透率均升高,干预组升高更明显;3组间细胞旁通透率比较,差异有统计学意义（F=2 223.00,P＜0.05）.结论 高糖诱导的BRECs中P-ATM表达、ROS水平、细胞凋亡率及细胞旁通透率均增高,其机制可能与P38、ERK、VEGF有关.