小窝蛋白-1对N-甲基-D天冬氨酸诱导的脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白带状闭合蛋白1的破坏作用研究

目的:探索小窝蛋白(Cav)-1对N-甲基-D天冬氨酸(NMDA)诱导的脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白带状闭合蛋白1(ZO-1)和血脑屏障完整性的破坏作用。方法:体外培养人脑微血管内皮细胞HBEC-5i并构建血脑屏障模型。以不同浓度的NMDA孵育HBEC-5i,并观察其对细胞活力的影响。细胞分别用NMDA受体(NMDAR)拮抗剂MK-801或Cav-1抑制剂Daidzein预处理后再用NMDA孵育。蛋白免疫印记(western blotting)法检测ZO-1、Cav-1及p-Cav-1蛋白的表达;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测ZO-1 mRNA的表达;跨膜细胞电阻仪Millicell ERS Volt-Ohm meter测量血脑屏障模型跨内皮细胞膜电阻(TEER)值。结果:与对照组比较,NMDA组p-Cav-1蛋白表达升高(P<0.05),ZO-1蛋白和mRNA表达下降(P<0.01),同时TEER值下降(P<0.001)。与NMDA组比较,使用MK801拮抗NMDAR活化后ZO-1蛋白和mRNA水平上调(P<0.05),TEER值增加(P<0.001);用Daidzein抑制Cav-1活化可下调p-Cav-1蛋白表达(P<0.05),上调ZO-1蛋白和mRNA表达(P<0.05)以及增加TEER(P<0.001)。结论:NMDA可诱导HBEC-5i中紧密连接蛋白ZO-1的破坏,从而增加紧密连接屏障的通透性。抑制Cav-1的活化可阻断NMDA诱导的ZO-1表达下降和减少TEER。

六味地黄丸介导RAGE抑制MMP-2/MMP-9对Aβ_(1-40)损伤bEnd.3细胞紧密连接蛋白的影响

目的探讨六味地黄丸对β淀粉样蛋白1-40(Aβ_(1-40))损伤的小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3)的保护作用及其机制。方法采用CCK8法检测Aβ_(1-40)和六味地黄丸含药血清(MSLDP)对细胞活性的影响,筛选合适的作用浓度。将bEnd.3细胞分为对照组、Aβ_(1-40)组、MSLDP+Aβ_(1-40)组和MSLDP组,采用Western blot检测低密度脂蛋白相关蛋白1(LRP1)、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白表达,免疫荧光检测LRP1、RAGE、ZO-1表达;再将bEnd.3细胞分为对照组、Aβ_(1-40)组、FPS-ZM1(RAGE抑制剂)+Aβ_(1-40)组和FPS-ZM1+Aβ_(1-40)+MSLDP组,Western blot检测RAGE、MMP-9、MMP-2、ZO-1蛋白表达。结果Aβ_(1-40)呈剂量依赖性降低bEnd.3细胞活性(P<0.01),MSLDP对Aβ_(1-40)损伤的细胞活性具有保护作用(P<0.05,P<0.01),因此选择10μmol/L Aβ_(1-40)和10%MSLDP进行后续实验。与对照组比较,Aβ_(1-40)组RAGE、MMP-2、MMP-9蛋白表达升高(P<0.01),LRP1、ZO-1、BDNF蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),并且LRP1、ZO-1荧光强度降低(P<0.01),RAGE荧光增强(P<0.01);与Aβ_(1-40)组比较,MSLDP组RAGE、MMP-2、MMP-9蛋白表达和RAGE荧光强度降低(P<0.05,P<0.01),而LRP1、ZO-1、BDNF蛋白表达和LRP1、ZO-1荧光强度升高(P<0.05,P<0.01)。与Aβ_(1-40)组比较,Aβ_(1-40)+FPS-ZM1组MMP-2、MMP9、RAGE蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),ZO-1蛋白表达升高(P<0.05);Aβ_(1-40)+FPS-ZM1+MSLDP组MMP-2、MMP9、RAGE蛋白表达降低(P<0.01),ZO-1蛋白表达升高(P<0.01),FPS-ZM1和MSLDP联合使用的效果更佳。结论六味地黄丸能够保护Aβ_(1-40)损伤的脑微血管内皮的细胞紧密连接,减轻血脑屏障障碍,保护神经血管单元防治阿尔茨海默病,可能通过调节RAGE途径抑制MMP-2/MMP-9途径实现。

牛至香酚对LPS免疫应激小鼠血清细胞因子含量和肠道细胞因子、紧密连接蛋白表达水平的影响

【目的】旨在探究牛至香酚是否能有效改善脂多糖(LPS)免疫应激小鼠免疫功能的损伤。【方法】将80只小鼠随机分成空白对照组、模型组和牛至香酚低、中、高剂量组。牛至香酚低、中、高剂量组分别按25、50、100 mg·kg^(-1)的剂量灌胃牛至香酚,空白对照组和模型组按10 mL·kg^(-1)的剂量灌胃橄榄油,每日1次,连续14 d。第15天时,牛至香酚组和模型组小鼠腹腔注射8 mg·kg^(-1)LPS,空白对照组注射等量生理盐水,6 h后采集血液和肠道组织,检测小鼠血清细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10)含量和肠道细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10)、紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin、Claudin-1)mRNA的表达水平。【结果】(1)与空白对照组相比,模型组小鼠血清TNF-α、IL-10、IL-1β含量上升(P>0.05),IL-6含量极显著上升(P<0.01);模型组回肠和结肠组织TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达水平极显著上调(P<0.01),回肠和结肠组织ZO-1 mRNA表达水平下调(P>0.05),结肠组织Occludin、Claudin-1 mRNA表达水平极显著下调(P<0.01)。(2)与模型组相比,牛至香酚试验组小鼠血清IL-6含量极显著下降(P<0.01),IL-1β含量显著下降(P<0.05);牛至香酚高剂量组血清TNF-α含量极显著下降(P<0.01);牛至香酚中、高剂量组血清IL-10含量显著上升(P<0.05)。(3)同模型组相比,牛至香酚中、低剂量组回肠组织IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平极显著下调(P<0.01);牛至香酚中、高剂量组回肠组织ZO-1、Occludin mRNA表达水平极显著上调(P<0.01);牛至香酚高剂量组结肠组织IL-10 mRNA表达水平极显著上调(P<0.01),TNF-αmRNA表达水平极显著下调(P<0.01),Occludin、Claudin-1 mRNA表达水平极显著上调(P<0.01)。【结论】牛至香酚通过改变小鼠血清细胞因子含量和肠道细胞因子、紧密连接蛋白mRNA的表达水平,调节LPS免疫应激小鼠的免疫功能。

血管生成素样蛋白4通过调节成纤维细胞和内皮细胞功能影响糖尿病足进程

背景:研究表明,血管因素对糖尿病足的发生具有重要影响。目的:探讨血管生成素样蛋白4在糖尿病足形成中的重要作用。方法:①对糖尿病足患者的基因表达谱数据进行生物信息学分析,找到关键基因。收集糖尿病足患者以及无糖尿病健康人的皮肤标本进行苏木精-伊红染色、免疫组化染色以及qRT-PCR实验,检测血管生成素样蛋白4表达情况。②培养人永生化皮肤成纤维细胞系和原代人脐静脉内皮细胞,将2种细胞分别分为对照组和外源性补充血管生成素样蛋白4组,通过划痕实验以及CCK-8实验分别检测成纤维细胞的迁移能力和增殖能力,通过Ki67实验检测内皮细胞的增殖能力。结果与结论:①生信分析发现,血管生成素样蛋白4基因的下调可能是导致糖尿病足形成的关键基因。②苏木精-伊红染色结果显示,与正常皮肤相比,血管生成素样蛋白在糖尿病足皮肤内弱表达,且其mRNA水平相对表达量降低(P<0.01)。③划痕实验结果显示,与对照组相比,血管生成素样蛋白4组成纤维细胞迁移能力明显增强;CCK-8细胞增殖实验显示,血管生成素样蛋白4组成纤维细胞的吸光度值在24,48 h均高于对照组(P<0.01,P<0.001);提示血管生成素样蛋白4可增强高糖处理的成纤维细胞迁移及增殖能力。④Ki67实验结果显示,与对照组相比,血管生成素样蛋白4组内皮细胞Ki67阳性细胞数目明显多于对照组;CCK-8细胞增殖实验显示,血管生成素样蛋白4组内皮细胞的吸光度值在24,48 h均高于对照组(P<0.05,P<0.001)。(5)以上结果均提示血管生成素样蛋白4可增强高糖处理内皮细胞的增殖能力。

基于NOD样受体3炎性小体通路对利拉鲁肽在氧化低密度脂蛋白诱导内皮细胞损伤的作用机制研究

背景动脉粥样硬化是世界范围内引起心脑血管疾病最主要的原因,炎症是目前研究热点,其中NOD样受体3(NLRP3)是研究最为深入的炎症小体。胰高糖素样肽1(GLP-1)受体激动剂有抗动脉粥样硬化作用,具体机制尚不明确。目的研究利拉鲁肽通过拮抗氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的内皮细胞损伤的作用机制。方法2022-03-25—05-19培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),取HUVEC加空白血清作为对照组,100μg/mL的ox-LDL干预HUVEC 48 h作为模型组,100μg/mL的ox-LDL干预HUVEC 24 h后分别加入100、200、400 nmol/L利拉鲁肽处理24 h作为利拉鲁肽低浓度组、利拉鲁肽中浓度组、利拉鲁肽高浓度组。CCK-8法计算细胞增殖率。通过扫描电镜观察焦亡细胞形态。检测乳酸脱氢酶(LDH)活力。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白介素(IL)-1β、IL-18表达水平。蛋白质免疫印迹试验(Western blot)检测NLRP3、接头蛋白凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)、焦亡执行蛋白(GSDMD)、N端结构域的焦亡执行蛋白(N-GSDMD)表达水平。结果模型组、利拉鲁肽低浓度组和利拉鲁肽中浓度组细胞增殖率低于对照组,利拉鲁肽低浓度组、利拉鲁肽中浓度组、利拉鲁肽高浓度组细胞增殖率高于模型组(P<0.05)。细胞扫描电镜结果示模型组细胞焦亡明显,利拉鲁肽低浓度组、利拉鲁肽中浓度组、利拉鲁肽高浓度组细胞焦亡情况明显改善。模型组、利拉鲁肽低浓度组LDH活力高于对照组,利拉鲁肽低浓度组、利拉鲁肽中浓度组、利拉鲁肽高浓度组低于模型组(P<0.05)。模型组、利拉鲁肽低浓度组IL-1β表达水平高于对照组,利拉鲁肽中浓度组、利拉鲁肽高浓度组IL-1β表达水平低于模型组(P<0.05);模型组IL-18表达水平高于对照组,利拉鲁肽低浓度组、利拉鲁肽中浓度组、利拉鲁肽高浓度组IL-18表达水平低于模型组(P<0.05)。模型组NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、N-GSDMD表达水平高于对照组,利拉鲁肽低浓度组ASC、Caspase-1表达水平高于对照组,利拉鲁肽中浓度组NLRP3、ASC表达水平低于模型组,利拉鲁肽高浓度组NLRP3、ASC、Caspase-1表达水平低于模型组(P<0.05)。结论利拉鲁肽显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞NLRP3炎性小体活化,并且能够抑制内皮细胞的焦亡,具有抗动脉粥样硬化作用。

内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的影响:生物信息学分析和实验验证

背景:血管新生是心血管疾病的主要干预靶点,骨形态发生蛋白2具有调控血管新生作用,但内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的调控作用不清楚。目的:探讨内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2对血管新生的影响。方法:(1)生物信息学分析:通过Panglao DB公共基因表达数据库单细胞转录组荟萃分析观察骨形态发生蛋白2细胞群表达丰度和定位。血管新生小鼠和内皮(心内膜)过表达骨形态发生蛋白2小鼠转录组测序数据集探索内皮细胞骨形态发生蛋白2对血管新生信号通路的调控作用。(2)体内实验验证:建立小鼠后肢缺血模型,对比模型小鼠患侧与健侧缺血后肢7,14和21 d血流灌注情况,免疫荧光和免疫组织化学染色评估小鼠骨形态发生蛋白2和CD31的表达定位情况。(3)体外实验验证:体外培养人脐静脉内皮细胞,分为对照组、缺氧组和骨形态发生蛋白2抑制剂(Noggin蛋白)干预组,培养24 h,观察各组内皮细胞血管新生情况。结果与结论:(1)内皮细胞是表达骨形态发生蛋白2的重要细胞亚群,在血管新生内皮细胞和骨形态发生蛋白2过表达内皮细胞转录组再分析均发现骨形态发生蛋白2表达明显升高,血管新生通路明显激活。(2)缺血7 d小鼠新生血管周围骨形态发生蛋白2阳性血管明显增加(P<0.05),缺血2周骨形态发生蛋白2阳性血管明显减少(P<0.001)。(3)体外培养人脐静脉内皮细胞,缺氧干预后,内皮细胞迁移能力和血管出芽明显增加,血管新生因子血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子的表达明显升高,Noggin明显减少了缺氧诱导的内皮细胞血管新生(P<0.001),并下调血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子的表达(P<0.01)。(4)结果证实,内皮细胞特异性骨形态发生蛋白2具有调控血管新生作用,靶向性内皮细胞骨形态发生蛋白2可望改善血管新生。

普通肝素对高迁移率族B1介导的内皮细胞紧密连接蛋白Claudin-5下调的保护作用

目的 研究高迁移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein, HMGB1） 对人脐静脉内皮细胞屏障通透性的影响，以及普通肝素对HMGB1 介导的内皮细胞紧密连接蛋白Claudin-5 下调的保护作用。方法 将经胰酶消化后的人脐静脉内皮细胞于培养瓶中传代培养，并分成4 组：空白对照组（加入等量PBS）、rhHMGB1 处理组（100 ng/mL）、普通肝素对照组（UFH10 U/mL）、rhHMGB1＋ 普通肝素处理组（100 ng/mL rhHMGB1 ＋ UFH 10 U/mL）。传代培养后的人脐静脉内皮细胞，通过MTT 法测定内皮细胞的存活率。Transwell 法测定内皮细胞通透性；免疫荧光法对Claudin-5 表达及分布进行测定；通过蛋白免疫印迹（Western blot） 法检测Claudin-5 蛋白表达。结果 用rhHMGB1（100 ng/mL） 处理内皮细胞后，与空白对照组比较细胞活力无明显变化（P〉0.05）；用rhHMGB1（100 ng/mL） 分别处理内皮细胞3 h、6 h 后，内皮细胞屏障通透性较空白对照组无明显变化（P〉0.05）；而经rhHMGB1 处理12 h、24 h 后，与空白对照组相比，内皮细胞屏障通透性显著升高，差异有统计学意义（P〈0.05）。而普通肝素和rhHMGB1 共同孵育内皮细胞12 h、24 h 后，其内皮细胞屏障通透性均低于rhHMGB1 处理组（P〈0.05）。免疫荧光和Westernblot研究表明，rhHMGB1 处理内皮细胞24 h 后，细胞紧密连接相关蛋白Claudin-5 分布和表达降低；而经普通肝素和rhHMGB1 共同孵育后，细胞紧密连接相关蛋白Claudin-5 的表达提高，Claudin-5的荧光强度增强。结论 HMGB1 可介导内皮细胞紧密连接相关蛋白Claudin-5 的分布异常和表达下降，以及增加内皮细胞屏障的通透性；普通肝素可改善HMGB 1 介导的内皮细胞紧密连接相关蛋白Claudin-5 的表达和分布及内皮细胞屏障通透性。

黄芪提取物对脑微血管内皮细胞咬合蛋白和紧密连接蛋白1的影响

目的观察β-淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)对脑微血管内皮细胞活力、咬合蛋白及紧密连接蛋白1表达的影响。方法将细胞分为对照组、Aβ诱导组及不同剂量黄芪提取物组。采用噻唑蓝法测定细胞活力;蛋白印迹法检测咬合蛋白和紧密连接蛋白1表达;逆转录-集合酶链式反应(RT-PCR)分析咬合蛋白和紧密连接蛋白1 mRNA的表达。结果与对照组比较,Aβ诱导组细胞活力随着孵育天数增加逐渐下降(P<0.05),咬合蛋白和紧密连接蛋白1表达降低(P<0.05),咬合蛋白mRNA和紧密连接蛋白1 mRNA表达降低(P<0.05);与Aβ诱导组比较,黄芪提取物组细胞活力随着孵育天数增加逐渐升高(P<0.05),咬合蛋白和紧密连接蛋白1蛋白表达增加(P<0.05),咬合蛋白mRNA和紧密连接蛋白1 mRNA表达升高(P<0.05)。结论黄芪提取物能改善Aβ1-40损伤的脑部微血管壁内皮细胞活力,升高咬合蛋白和紧密连接蛋白1蛋白及mRNA表达,达到保护血脑屏障的目的。

高氟暴露降低人血管内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1表达及其机制的初步研究

目的观察高氟暴露对人血管内皮细胞紧密连接胞质带状闭合蛋白1(ZO-1)表达的影响,并初步探讨其机制。方法体外培养人脐静脉血管内皮细胞,采用成组设计,分别设置0.0(对照组)和0.4、0.8、1.2mg/L氟处理组(低、中、高剂量组),以及胰岛素样生长因子-1(IGF-1)组[加入1.2mg/L的氟离子(F-)前,预先加入100nmol/L的IGF-1处理2h],各组细胞培养24h,提取细胞蛋白,应用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测各组细胞中ZO-1、磷脂酰肌醇激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)和磷酸化AKT(p-AKT)的表达并进行分析。结果对照,低、中、高剂量组间内皮细胞中ZO-1的表达(0.063±0.002、0.043±0.007、0.039±0.004、0.028±0.007)比较差异有统计学意义(F=21.36,P<0.01);各加氟处理组ZO-1的表达均显著低于对照组(P均<0.05);高剂量组ZO-1的表达显著低于低、中剂量组(P均<0.05)。对照,低、中、高剂量组间内皮细胞中PI3K表达(0.032±0.004、0.031±0.002、0.017±0.001、0.017±0.005)和p-AKT与AKT表达比(p-AKT/AKT:0.745±0.046、0.806±0.007、0.666±0.058、0.641±0.040)比较差异有统计学意义(F=20.38、9.57,P<0.01或<0.05);其中高剂量组PI3K表达和p-AKT/AKT均显著低于对照组和低剂量组(P均<0.05);中剂量组p-AKT/AKT显著低于低剂量组(P<0.05)。加入PI3K/AKT通路的激动剂IGF-1后,IGF-1组内皮细胞中ZO-1的表达(0.055±0.015)高于高剂量组(P<0.05)。结论高氟暴露可通过PI3K/AKT信号途径引起血管内皮细胞ZO-1的表达降低。

麝香配伍乳香对大鼠前列腺上皮细胞紧密连接结构相关蛋白表达的影响

目的:探讨麝香-乳香配伍处理对正常及慢性前列腺炎模型大鼠前列腺上皮细胞紧密连接结构相关蛋白表达的影响。方法:80只雄性SD大鼠随机分为8组:正常空白对照组、正常麝香-乳香组、正常麝香组、正常乳香组、模型空白组、模型麝香-乳香组、模型麝香组、模型乳香组。制备慢性前列腺炎大鼠模型,造模60 d时根据组别分别给予麝香0.021 g/(kg·d)、乳香1.05 g/(kg·d)剂量灌胃,麝香-乳香组给予联合剂量,空白组给予生理盐水灌胃。各组别连续灌胃3 d,处死大鼠,取前列腺组织,固定后以免疫组化法检测大鼠前列腺上皮屏障紧密连接功能相关蛋白紧密连接蛋白1、紧密连接蛋白3、闭锁蛋白、胞质附着蛋白1(ZO-1)的表达情况。结果:在病理状态下,仅紧密连接蛋白1的表达增高有统计学意义。麝香、乳香处理后,在生理/病理状态下对4种蛋白的调节作用不同:生理状态下,单用麝香(824.6±393.3)、乳香(982.0±334.0)或配伍处理(1 088.1±640.2)均可大幅度增高紧密连接蛋白1的表达(P<0.05,P<0.01);对于紧密连接蛋白3,单用乳香表达上调(1 009.5±243.6,P<0.05),单用麝香(597.5±80.7)差异无统计学意义,配伍麝香(678.4±255.1)可降低乳香上调表达作用;单用麝香(693.0±424.8)、乳香(732.1±302.0)或配伍处理(560.2±202.3)对闭锁蛋白表达影响差异无统计学意义;单用麝香(290.0±166.8)、乳香(419.7±108.1)对ZO-1表达影响差异无统计学意义,配伍处理后表达明显下调(197.7±98.2,P<0.05)。慢性前列腺炎病理状态下,大鼠前列腺组织紧密连接蛋白1(823.0±100.1)、闭锁蛋白(1 160.0±32.2)表达显著增高(P<0.01,P<0.05);单用麝香(764.9±179.0)、乳香(468.4±220.4)或配伍(335.1±204.0)使用可下调紧密连接蛋白1表达(P<0.05);单用麝香(700.1±223.7)或乳香(744.6±94.5)可上调紧密连接蛋白3表达(P<0.05);单用麝香(749.6±321.7)、乳香(615.0±221.0)或配伍处理(505.8±523.7)均可下调闭锁蛋白表达;单用乳香可上调ZO-1表达(443.2±144.9),与麝香配伍处理后表达下调(213.5±24.9),与单用乳香组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:麝香、乳香对生理/病理状态下前列腺上皮屏障结构紧密连接相关蛋白的调节作用具有选择性和双向性,主要通过ZO-1蛋白的下调实现促通透性作用,而通过调节紧密连接蛋白1、紧密连接蛋白3、闭锁蛋白表达以维持结构稳定性。

TNF-α影响肠黏膜上皮细胞间紧密连接蛋白的表达

目的:探讨肿瘤坏死因子(TNF-α)对肠黏膜上皮细胞间紧密连接的影响. 方法:应用免疫荧光方法检测在肿瘤坏死因子(TNF-α)0, 50,100和200μg/L作用下,与结肠癌上皮细胞株(CaCo- 2细胞株)共同培养24 h,以及用TNF-α100 μg/L与CaCo- 2细胞共同培养0,4,8和24 h,观察TNF一-α对紧密连接蛋白(zonula occluden 1,ZO-1)表达的影响.并应用半定量RT-PCR方法检测TNF-α用上述相应的时间和浓度作用后对肠黏膜上皮细胞ZO-1 mRNA表达的影响. 结果:用TNF-α100和200 μg/L作用24 h后ZO-1的免疫荧光明显减少,并呈剂量依赖性;用TNF-α100 μg/L作用24 h时ZO-1免疫荧光明显减少,并呈时间依赖性.应用半定量RT-PCR的方法检测结果:TNF-α作用24 h时, ZO-1 mRNA从TNF-α0μg/L的1.1926降至100μg/L的0.7834和200 μg/L的0.7081;TNF-α100μg/L作用4 h, ZO-1mRNA为(95.5±5.5%);8 h为(82.0±5.4%);24 h 降至最低为(67.7±5.7%),与对照组相比P<0.01. 结论:TNF-α是通过抑制肠上皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1 表达引起肠黏膜上皮细胞间紧密连接破坏.并且是通过抑制ZO-1 mRNA引起肠上皮细胞ZO-1蛋白表达降低.

血管紧张素Ⅱ通过下调血管内皮钙粘连蛋白抑制血管内皮细胞中紧密连接蛋白1的表达

目的:探索血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)引发微血管内皮通透性增加的具体机制。方法:大鼠主动脉内皮细胞原代培养鉴定,取4-7代细胞用于实验,将细胞分为对照组、Ang Ⅱ组、Ang Ⅱ+缬沙坦组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、蛋白质印迹(Western blot)法检测细胞中紧密连接(ZO-1)、血管内皮钙粘连蛋白(VE-cadherin)的表达,免疫荧光染色检测细胞中ZO-1蛋白的分布。通过向内皮细胞转染过表达VE-cadherin质粒,检测过表达VE-cadherin对Ang Ⅱ诱导的ZO-1蛋白表达和蛋白分布改变的影响。结果:相比于对照组,Ang II组内皮细胞ZO-1和VE-cadherin在mRNA和蛋白水平的表达均显著减少(P<0.01),且ZO-1蛋白在细胞周边分布的趋势显著降低。在Ang Ⅱ干预的内皮细胞中过表达VE-cadherin后,内皮细胞ZO-1蛋白表达增加(P<0.01),细胞周边分布趋势显著增强。结论:Ang Ⅱ通过下调VE-cadherin抑制血管内皮细胞中ZO-1蛋白的表达,从而破坏内皮细胞间的紧密连接,这可能是Ang II引发微血管通透性增加的具体机制。

高温对血脑屏障内皮细胞紧密连接的影响

目的探讨高温对血脑屏障内皮细胞间紧密连接的影响及其分子机制。方法利用内皮细胞与胶质细胞共培养建立体外血脑屏障模型。采用Millicell-ERS系统检测血脑屏障模型的跨内皮阻抗(transendothelial resistance, TER)。对内皮细胞间紧密连接采用银染的方法研究其结构的完整性。运用半定量RT-PCR的方法分析高温作用后血脑屏障内皮细胞紧密连接蛋白zonula occluden 1(ZO-1)的表达变化。结果43 ℃作用2 h后,体外血脑屏障模型TER均值由(321.30±58.59)Ω·cm2下降至(65.67±6.02)Ω·cm2。同时,内皮细胞紧密连接的银染显示,内皮细胞紧密连接完整性明显破坏。RT-PCR分析结果显示,高温条件下体外血脑屏障模型中内皮细胞ZO-1的表达水平明显降低。结论高温可以明显破坏血脑屏障内皮细胞间紧密连接的完整性,高温条件下内皮细胞ZO-1表达水平的降低是血脑屏障热损伤的重要分子机制。

苏氨酸对大鼠小肠上皮细胞系IEC-6细胞活性和紧密连接蛋白表达的影响

本研究旨在探讨苏氨酸对大鼠小肠上皮细胞活性和增殖的影响,并研究苏氨酸是否对大鼠小肠上皮细胞紧密连接蛋白表达具有调控作用。试验采用不同浓度的苏氨酸(0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mmol/L)处理大鼠小肠上皮细胞系IEC-6细胞24 h,用噻唑兰(MTT)法测定IEC-6细胞活性,苏木精-伊红(HE)染色观察IEC-6细胞增殖情况,Western-blot法检测IEC-6细胞紧密连接蛋白表达情况。结果表明:各浓度的苏氨酸均能不同程度地提高IEC-6细胞的活性,0.5 mmol/L苏氨酸处理24 h时IEC-6细胞的活性最高,且与未经苏氨酸处理的对照组差异显著(P<0.05)。不同浓度的苏氨酸均能促进IEC-6细胞的增殖,且在苏氨酸浓度为0.5 mmol/L时促增殖作用最明显。与未经苏氨酸处理的对照组相比,0.1 mmol/L的苏氨酸对紧密连接蛋白claudin-3的表达未产生显著影响(P>0.05),但显著促进了occludin的表达(P <0.05);苏氨酸浓度为0.5、1.0、5.0、10.0 mmol/L时均显著促进上述2种紧密连接蛋白的表达(P <0.05),使claudin-3的相对表达量分别增加了1.84、7.08、8.71、3.83倍,occludin的相对表达量分别增加了2.65、2.71、2.82、3.88倍。综上,适宜浓度的苏氨酸对大鼠小肠上皮细胞系IEC-6细胞的活性和增殖具有促进作用,且在浓度为0.5 mmol/L时作用最显著,同时促进了紧密连接蛋白claudin-3和occludin的表达。

高、低剪切力对内皮细胞紧密连接的影响

目的 :研究高、低剪切力对动脉内皮通透性和紧密连接的影响。方法 :饲以普通和高脂肪食的两组日本大耳白兔的腹主动脉狭窄至原横断面积的 6 0 7%± 7 0 % ,7d后处死。动脉用艾万斯蓝和苏丹Ⅳ染色。紧密连接用冷冻蚀刻法检测。结果 :未狭窄腹主动脉染色阴性 ,紧邻狭窄近、远侧 1mm有恒定环行阳性区和距狭窄 8mm远侧内有散在点、片状阳性区。冷冻蚀刻显示在通透性增高区 ,狭窄远侧小带状型紧密连接的百分率明显低于近侧(P <0 0 1) ,远侧小带状和斑状型紧密连接的条数明显低于近侧 (P <0 0 1)。结论 :高、低剪切力导致内皮通透性增高及紧密连接变化 。

脂多糖刺激小胶质细胞产生的微囊泡加重氧糖剥夺条件下大鼠脑血管内皮细胞紧密连接的损伤

目的研究在氧糖剥夺(OGD)条件下,向脑血管内皮细胞(RBEC)中加入提取自脂多糖(LPS)刺激的大鼠小胶质细胞上清液的循环微囊泡(MV),考察其对RBEC紧密连接功能的损伤及作用机制。方法分离提取1 mg/L LPS刺激24 h的小胶质细胞培养上清液中的MV并进行鉴定,实时荧光定量PCR检测MV中微小RNA-27a(miR-27a)水平。RBEC分为正常对照组、正常对照组-MV组、OGD 6 h组、OGD-MV孵育组。免疫荧光细胞化学染色检测RBEC中紧密连接蛋白闭合蛋白(occludin)和密封蛋白5(claudin-5)的表达,Western blot法检测RBEC中occludin、claudin-5、Toll样受体4(TLR4)、核因子κBp65(NF-κBp65)和p38的蛋白磷酸化水平,ELISA测定RBEC中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。结果 MV形状为近似圆形双层膜结构,平均直径为150 nm,符合MV的形态学特征。与正常小胶质细胞相比,LPS刺激的小胶质细胞培养上清液的MV中miR-27a水平异常升高。与正常对照组相比,加入MV不会对正常细胞产生影响,当在OGD条件下,RBEC中紧密连接受到损害,occludin和claudin-5表达降低,而加入MV后,RBEC紧密连接破坏加重,occludin和claudin-5表达进一步降低,OGD组小胶质细胞occludin和claudin-5蛋白水平降低。与正常对照组相比,OGD组小胶质细胞TLR4及NF-κBp65、p38磷酸化水平增加,而OGD-MV孵育组中,TLR4和NF-κBp65、p38的磷酸化水平进一步升高,且IL-1β和TNF-α水平也明显增加。结论 LPS刺激小胶质细胞上清液MV中miR-27a水平升高,可致OGD条件下RBEC紧密连接损害进一步加重,可能与其上调TLR4表达及NF-κBp65、p38的磷酸化相关。

TNF-α对肠上皮细胞紧密连接蛋白表达的作用

目的:研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)对肠上皮细胞紧密连接蛋白claudin-1定位和表达的影响,探讨TNF-α增加肠上皮细胞屏障通透性的作用机制.方法:Caco-2细胞(20-30代)应用含有2 mmol/ L谷氨酰胺、20%胎牛血清的DMEM培养液培养7d,细胞生长达到融合后加入不同浓度的TNF-α(0,10,100μg/L)继续培养24h,提取细胞蛋白制备NP-40可溶性及不溶性蛋白框架,Western blot检测磷酸化和非磷酸化的claudin-1蛋白含量,并应用间接免疫荧光法检测claudin-1的定位,实时定量PCR技术检测claudin-1 mRNA的表达.结果:免疫荧光染色可见对照组claudin-1沿细胞膜分布,呈蜂巢状线性荧光,10μg/L TNF-α引起claudin-1荧光信号减弱,并呈锯齿状异常分布;Western blot分析显示claudin-1蛋白有两种表达形式,一种为20 kDa(非磷酸化claudin-1),主要存在于NP-40可溶性蛋白样品中;另一种为25 kDa(磷酸化claudin-1),只存在于NP-40不溶性蛋白样品中.TNF-α不影响20 kDa claudin-1蛋白的表达,但可使25 kDa claudin-1蛋白表达下降且具有浓度依赖性(10,100μg/L:0.31±0.02.0.24±0.05 vs 0.43±0.09 P>0.05,P<0.05);实时定量PCR结果显示不同浓度的TNF-α(10,100μg/L)作用24h或100μg/L TNF-α作用不同时间(4,8和24h)与正常对照组相比均不能引起claudin-1 mRNA的改变.结论:TNF-α对Caco-2细胞紧密连接蛋白claudin-1 mRNA的表达没有影响,但可以引起有功能的磷酸化claudin-1蛋白表达减少.

短链脂肪酸对奶牛瘤胃上皮细胞促炎因子、趋化因子和紧密连接蛋白表达量的影响

【目的】探究不同时间点短链脂肪酸(SCFAs)对奶牛瘤胃上皮细胞促炎因子、趋化因子和紧密连接蛋白表达量的影响.【方法】试验分4组,每组设3个重复,分别在各组瘤胃上皮细胞中添加20 mmol/L的短链脂肪酸,在添加短链脂肪酸0、2、5、8 h后收集细胞提取细胞总RNA.【结果】在添加SCFAs 8 h时,G-蛋白偶联受体41(GPR41)的表达量显著高于其它各组(P<0.05).添加SCFAs 2 h后IL-1β的表达量显著高于0 h组(P<0.05),8 h时IL-1β的表达量最高.添加SCFAs 5、8 h时,CXCL2的表达量显著高于0 h组(P<0.05);在培养2 h后CXCL8的表达量显著高于0 h组(P<0.05).添加SCFAs 2 h后,Claudin-1和Occludin的表达量显著高于0 h组,并且在2 h时表达量最高(P<0.05).【结论】短链脂肪酸能够提高瘤胃上皮细胞促炎因子、免疫趋化因子、紧密连接蛋白以及GPR41的表达量,从而证明短链脂肪酸可以增强瘤胃上皮的免疫机能.

小细胞肺癌细胞诱发人脑微血管内皮细胞紧密连接的开放

目的小细胞肺癌易发生脑转移,但其机制尚不完全清楚,本文探讨小细胞肺癌细胞对人脑微血管内皮细胞单层细胞间紧密连接开放的作用。方法应用免疫荧光技术观察人脑微血管内皮细胞间紧密连接结构改变;应用Western blot技术分析小细胞肺癌细胞与微血管内皮细胞单层共培养时紧密连接蛋白occludin的可溶性片段和不可溶性片段在内皮细胞紧密连接处的分布情况;应用跨内皮迁移实验及辣根过氧化物酶渗漏实验分析小细胞肺癌细胞与内皮细胞单层共培养后其跨内皮细胞单层的迁移能力和内皮单层渗透性的改变;利用ROCK特异性抑制剂Y27632,分析Rho/ROCK信号通路是否参与小细胞肺癌细胞跨内皮单层迁移。结果小细胞肺癌细胞能够通过人脑微血管内皮细胞单层迁移,在0h到12h之间随培养时间的延长小细胞肺癌细胞的迁移率逐渐增加;共培养8h时人脑微血管内皮细胞紧密连接处紧密连接结构蛋白(ZO-1和occludin)表达减少,通透性明显增加;ROCK特异性抑制剂Y27632能够阻断小细胞肺癌细胞引起的内皮细胞间紧密连接处紧密连接结构蛋白ZO-1和occludin表达减少、内皮单层通透性的增加及小细胞肺癌细胞跨内皮单层迁移。结论小细胞肺癌细胞与人脑微血管内皮细胞单层共培养诱发人脑微血管内皮细胞间紧密连接的开放,利于小细胞肺癌细胞的跨内皮单层迁移。

注射用丹参多酚酸联合血栓通对缺氧复氧损伤血脑屏障紧密连接蛋白表达的影响

血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)通过精密控制血液与脑实质之间的物质交换维持脑内微环境,保证神经系统功能。脑微血管内皮细胞作为组成BBB的核心,通过细胞间紧密连接蛋白(tight junction protei,TJs)来维持BBB的屏障完整[1-2]。研究表明[3-4],BBB的破坏是造成缺血性卒中出血转化及加重脑损伤的重要因素。因此,维持BBB的完整可能是缺血性卒中的重要治疗策略。