硬度可控的温敏水凝胶基底对兔角膜内皮体外扩增内皮间质化的影响

目的探究可调节硬度的温敏聚乙二醇二丙烯酸酯-异丙基丙烯酰胺(PEG-NIPAM)水凝胶体系对兔角膜内皮体外培养时发生内皮间质化(endothelium mesenchymal transition,EnMT)程度的影响。方法采用4~5周龄的新西兰兔6只,麻醉处死后取双侧眼球,妥布霉素盐水浸泡后剪下角膜,取下后弹力层,采用两步消化法提取兔原代角膜内皮并进行体外扩增。将P0代兔原代内皮细胞(corneal endothelium cells,CECs)置于6孔板培养,当细胞密度90%时分别传代于10组经不同预铺板涂层PEG硬度可控的温敏性水凝胶和细胞培养板(TCP)上。具体分组为三种预铺板条件(硫酸软骨素、层粘连蛋白混合物;纤维连接蛋白、胶原蛋白和白蛋白混合物;明胶)与不同浓度(1%、10%和20%)PEG分别组合以及对照组(TCP)。材料详细硬度由AFM法测定。经过三代培养,观察EnMT指标平滑肌肌动蛋白α(α-smooth muscle actin,α-SMA)染色结果。结果AFM法测得水凝胶硬度在浓度为1%PEG时制备的PEG-NIPAM为(346.4±26.53)Pa,浓度为10%PEG时为(8782±444.4)Pa,浓度为20%PEG为(11518±791.1)Pa,两两比较差异均有统计学意义(P<0.001)。兔角膜内皮细胞在体外培养形态变化和α-SMA表达均证明发生EnMT。P1~P3代的兔角膜内皮细胞中α-SMA阳性细胞逐渐增加,细胞骨架转变为纤维化形态;20%PEG-NIPAM相比于TCP对照组α-SMA阳性细胞比例和强度明显减少;层粘连蛋白和硫酸软骨素的混合涂层相比于FNC涂层α-SMA阳性细胞比例和强度更低。结论在与天然硬度和结构成分接近的PEG-NIPAM水凝胶仿生材料上扩增兔角膜内皮细胞可减轻EnMT程度。

黄芪葛根汤与远志汤合方抑制糖尿病动脉粥样硬化大鼠主动脉内皮细胞间质化的作用机制

目的基于转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)/Smad信号通路探究黄芪葛根汤与远志汤合方抑制糖尿病动脉粥样硬化大鼠血管内皮细胞间质化的作用机制。方法将70只SPF级SD雄性大鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组(糖脉康颗粒)、黄芪葛根汤与远志汤合方1组(简称“合方1组”)、黄芪葛根汤与远志汤合方2组(简称“合方2组”)。空白对照组喂食普通饲料,第29天给予大鼠一次性腹腔注射柠檬酸缓冲液;其他组喂食高脂饲料,第29天给予大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素诱导2型糖尿病动脉粥样硬化模型,连续灌胃49 d。苏木精—伊红染色法观察主动脉的组织形态。检测各组大鼠血糖和血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin A1c,HbA1c)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)水平;采用酶联免疫吸附试验检测血清波形蛋白(Vimentin)、Twist1、TGF-β、锌指转录因子1(Snail1)水平;采用Western blot法检测肝脏固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c,SREBP-1c)和主动脉Smad-2、Smad-3蛋白表达水平;采用qRT-PCR法检测葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter-4,Glut-4)、Vimentin、腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、SREBP-1c mRNA表达水平。结果与空白对照组比较,模型组大鼠血糖、HbA1c、TG、LDL-C、Vimentin、Twist1、TGF-β、Snail1、SREBP-1c、Smad-2、Smad-3表达水平显著升高(P<0.05),HDL-C、Glut-4、AMPK表达水平显著降低(P<0.05)。与模型组比较,合方1组、合方2组大鼠血糖、HbA1c、TG、TC、LDL-C、Vimentin、SREBP-1c、Twist1、TGF-β、Snail1、Smad-2、Smad-3水平显著降低(P<0.05),HDL-C、Glut-4、AMPK水平显著升高(P<0.05)。结论黄芪葛根汤与远志汤合方抑制主动脉内皮细胞间质化的作用与其参与主动脉TGF-β/Smad信号通路有关。

姜黄素通过激活NRF2-DDAH-ADMA-NO途径抑制内皮间质化改善心脏纤维化

该研究以心脏纤维化SD大鼠为对象,分析姜黄素(curcumin,Cur)、核因子NF-E2相关因子(nuclear factor-E2-related factor 2,NRF2)-二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethyl arginine dimethylamino hydrolase,DDAH)-非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethyl arginine,ADMA)-一氧化氮(nitric oxide,NO)途径、内皮细胞-间质化(endothelial-mesenchymaltransition,EndMT)三者之间的关系,探讨Cur抗心脏纤维化的作用和机制,为其在心衰治疗上的临床应用提供更深入的理论依据。通过以异丙肾上腺素(isoprenaline,Iso)皮下注射构建大鼠心脏纤维化模型。实验过程中使用32只SD大鼠,按每组8只随机分为4组,即对照组、模型组(Iso)、低剂量Cur组(100 mg·kg^(-1)·d^(-1)Cur灌胃)、高剂量Cur组(200 mg·kg^(-1)·d^(-1)Cur灌胃)。给药21 d后心超检查心功能情况,Masson染色检查心肌纤维化程度,病理染色测定CD31和α-SMA表达,Western blot检测VE-cadherin、vimentin、NRF2、DDAH表达,HPLC检测ADMA水平等。与模型组相比,经Cur干预后大鼠心脏纤维化程度明显下降,并伴随着内皮细胞标志物CD31、VE-cadherin表达上调,间质细胞标志物α-SMA、vimentin下调,提示EndMT减轻。另外,与模型组相比,Cur组的DDAH和NRF2表达升高,ADMA、NO水平明显下降。综上所述,Cur有通过抑制EndMT起到抗心脏纤维化的作用,其作用机制可能为通过干预NRF2-DDAH-ADMA-NO途径来完成。

SMAD7调控内皮间质转化可预防跟腱损伤后的异位骨化

背景:现有的研究结果证明,内皮细胞向间质细胞转化(End MT)在异位骨化病程中起主要作用。目的:基于SMAD7基因在阻止肌成纤维细胞转化等内皮-间质转化进展中的潜能,验证其是否是异位骨化潜在的治疗靶点。方法:构建了过表达SMAD7的慢病毒颗粒,并在大鼠主动脉内皮细胞中测定了其最佳滴度和转染效率。随后,将该病毒颗粒注入构建的大鼠跟腱损伤模型中,对照组注射生理盐水。使用qPCR和蛋白印迹实验分析了损伤处内皮和间质标志物的表达,采用X射线和组织染色观察异位骨化病程转化。结果与结论:(1)局部注射转染SMAD7基因的病毒载体可引起内皮细胞标志物(CD31,VE-cadherin)发生上调,同时间质细胞标志物(N-cadherin,vimentin)发生下调,提示SMAD7的局部高表达阻断了内皮-间质转化改变。这种表达差异在造模后10周时比在造模后6周时更明显;(2)X射线片和组织染色显示,相比对照组,注入表达SMAD7的慢病毒后,肌腱组织中骨化结构缺失;(3)因此认为,促进局部SMAD7的高表达可用来预防术后异位骨化形成,而不影响正常的伤口愈合过程。

松弛素对TGF-β诱导的内皮细胞间质化的抑制作用

目的 :探讨松弛素(RLX)对TGF-β诱导的内皮细胞间质化现象的影响。方法:采用体外分离的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为体外细胞模型,通过TGF-β10 ng/mL诱导内皮细胞间质化,100 ng/mL和200 ng/mL RLX分别预处理,再与TGF-β联合培养48 h。光镜下观察细胞形态学改变,CCK-8实验和transwell实验检测细胞增殖和迁移能力,免疫荧光单双染技术观察vimentin和CD31的表达变化,蛋白免疫印迹技术观察各实验组vimentin、CD31、ve-cadherin和α-SMA的蛋白表达。结果:阴性对照组内皮细胞呈铺路石样生长,TGF-β诱导组细胞形态向梭形转化,呈扩散迁移趋势。与阴性对照组相比,TGF-β诱导组细胞增殖、迁移能力明显增强;而RLX可抑制TGF-β诱导的增殖和迁移。免疫荧光单染结果显示,与阴性对照组相比,TGF-β诱导组内皮细胞特异性蛋白CD31表达下调而间质细胞标志性蛋白vimentin明显上升;与TGF-β组相比,RLX联合TGF-β处理组CD31表达上调而vimentin表达下调。免疫荧光双染结果显示,阴性对照组以内皮性质的细胞为主,仅存在少量的CD31和vimentin双阳性细胞;TGF-β诱导组双阳性细胞明显增多;与TGF-β组相比,RLX联合TGF-β处理组间质效应的双阳性细胞下调,而内皮效应的双阳性细胞增多。蛋白免疫印迹结果显示,与阴性对照组相比,TGF-β诱导组内皮细胞特异性蛋白CD31(0.36±0.076 vs 0.88±0.086)和ve-cadherin(0.54±0.046 vs 1.09±0.13)表达下调而间质细胞标志性蛋白vimentin(0.72±0.102 vs 0.21±0.081)和α-SMA(0.88±0.084 vs 0.24±0.046)明显上升(P<0.05);与TGF-β组相比,RLX联合TGF-β处理组CD31(0.67±0.09、0.59±0.12 vs 0.36±0.076)和ve-cadherin(0.85±0.09、0.72±0.064 vs 0.54±0.046)表达上调,而vimentin(0.56±0.011、0.48±0.06 vs 0.72±0.102)和α-SMA(0.65±0.081、0.54±0.032 vs 0.88±0.084)表达下降(P<0.05),且呈剂量依赖性。结论:RLX可抑制TGF-β诱导的内皮细胞向间质化细胞转化。

替米沙坦对高浓度葡萄糖引起的内皮细胞间质化的影响

目的探讨替米沙坦对高浓度葡萄糖引起的内皮细胞间质化的影响。方法采用体外分离培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为细胞模型,通过高浓度葡萄糖(30 mmol/L)诱导内皮细胞间质化,TGF-β抑制剂SB-431542或替米沙坦预处理内皮细胞6 h,然后用高浓度葡萄糖(30 mmol/L)孵育脐静脉内皮细胞48 h。RT-PCR和Western blot观察CD31、VE-cadherin、α-SMA和Vimentin表达变化。应用糖尿病小鼠模型验证上述指标的变化。结果高浓度葡萄糖可以促进内皮细胞TGF-β的表达,而替米沙坦可抑制高浓度葡萄糖引起的TGF-β表达增加;高浓度葡萄糖可以降低内皮细胞CD31、VE-cadherin的表达,增加α-SMA及Vimentin的表达。TGF-β抑制剂SB-431542及替米沙坦可以显著逆转高浓度葡萄糖对内皮细胞间质化的影响。结论替米沙坦可以降低TGF-β的表达,抑制高浓度葡萄糖诱导的内皮细胞间质化。

肺纤方提取物对肺间质纤维化大鼠肺微血管VEGF、VEGFR2、PAI-1、VCAM-1 mRNA表达的影响

目的通过观察肺纤方提取物干预体外培养肺微血管的血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR 2)、纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)、血管细胞黏附因子1(VCAM-1)基因表达的影响,探讨肺纤方干预肺纤维化微血管生成的机制。方法从肺纤维化模型大鼠分离培养肺微血管内皮细胞,将其等量分为模型组,氯沙坦组,泼尼松组,肺纤方大、中、小剂量组。模型组加入含20%胎牛血清的DMEM培养基,氯沙坦组加入含20%胎牛血清及10 mg/L氯沙坦的DMEM培养基,泼尼松组加入含20%胎牛血清及5 mg/L泼尼松的DMEM培养基,肺纤方大、中、小剂量组分别加入含20%胎牛血清及100、60、20 mg/L肺纤方提取物的DMEM培养基,分别作用24 h。双链嵌合荧光染料SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法检测VEGF、VEGFR 2、PAI-1与VCAM-1的mRNA转录水平。结果与模型组比较,肺纤方大、中、小剂量组VEGF基因表达水平均显著降低,而VEGFR2无显著差异;肺纤方大剂量组PAI-1 mRNA表达显著降低;肺纤方大、中剂量组VCAM-1 mRNA表达显著降低(P<0.05)。结论肺纤方可通过抑制肺微血管VEGF、PAI-1及VCAM-1的表达改善血凝及纤溶,抑制血管形成而发挥抗肺纤维化作用。

舒洛地特失活YAP减轻大鼠动静脉瘘新生内膜增生

目的研究舒洛地特(sulodexide,SDX)对慢性肾脏疾病(chronic kidney disease,CKD)大鼠动静脉瘘(arteriovenous fistula,AVF)新生内膜增生的作用及调节机制。方法选取体质量(300±50)g雄性大鼠18只,随机分为3组(n=6):AVF组,对正常大鼠进行AVF手术;慢性肾病组(CKD+AVF),大鼠经诱导慢性肾病后进行AVF手术+生理盐水灌胃2月;舒洛地特组(CKD+AVF+SDX),大鼠经诱导慢性肾病后进行AVF手术+8 mg/(kg·d)SDX灌胃2月。HE染色检测血管内膜增生程度,免疫荧光检测Hippo信号通路相关分子YAP、pYAP、YAP下游靶蛋白间充质细胞标志分子(connective tissue growth factor,CTGF)表达情况。以不同浓度SDX(0、2.5、5、10、20、40μg/mL)处理人脐静脉细胞融合细胞(EAHy926),并以2.5μg/mL SDX分别处理细胞24、48、72 h,用CCK-8法检测细胞存活率。进一步利用CKD大鼠血清处理细胞,并在此基础上用SDX及YAP阻断剂维替泊芬处理,通过Western blot实验检测YAP、pYAP、CTGF及内皮细胞标志分子CD31表达。结果HE染色及免疫荧光结果表明,与AVF组大鼠相比,慢性肾病组大鼠瘘口处内膜严重增生(P<0.05),pYAP表达微弱而CTGF表达增强,舒洛地特组经SDX灌胃处理后内膜增生减轻,pYAP表达增强,CTGF表达水平降低(P<0.05)。CCK-8结果表明,随SDX浓度及处理时间的增加,细胞存活率降低(P<0.05)。Western blot结果发现,SDX促进EAHy926细胞pYAP及CD31的表达,抑制了CTGF的表达(P<0.05),与维替泊芬处理效果一致。结论舒洛地特通过阻止CKD引起的YAP激活,减轻了AVF血管内膜增生。

髂静脉受压综合征与下肢深静脉血栓形成相关性的研究进展

髂静脉受压综合征(IVCS)是临床常见的静脉系统疾病,约占下肢深静脉血栓形成(DVT)的2%~5%,被认为是DVT最重要的继发性危险因素。本文将介绍IVCS的病因,从流行病学角度分析IVCS与DVT的相关性,并从内皮间质化、miRNAs促血栓机化、氧化应激和炎症与血流动力学的角度探讨两者相关性可能的内在机制,旨在为临床干预IVCS,预防DVT提供理论依据。