内质网分子伴侣GRP78在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的表达变化

目的观察在大鼠脊髓缺血再灌注损伤(SCII)过程中内质网分子伴侣GRP78的表达变化,并探讨其意义。方法健康成年Wistar大鼠55只,随机分为两组:(1)脊髓压迫缺血再灌注组50只,每个时间点10只,采用自制压迫装置制备脊髓压迫缺血再灌注模型;(2)假手术对照组5只,只做全椎板切除不做脊髓压迫。用免疫组化、West-ernblot和TUNEL等方法,分别于缺血再灌注后30min、3、7、11和23h,检测压迫段脊髓组织中GRP78的表达变化及细胞凋亡情况。结果再灌注30min后,GRP78在压迫段脊髓开始表达上调,7h达峰值,11h表达回落,23h显著减少。TUNEL染色显示,神经细胞的凋亡指数随着再灌注时间的延长而升高。结论GRP78在脊髓缺血再灌注损伤中呈现时序性的表达变化,这可能是脊髓内源性保护机制之一。

人内质网分子伴侣BiP的克隆、表达及其在RA患者血清抗体检测中的作用

以类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者滑膜组织文库cDNA为模板，用PCR方法扩增得到1965bp人内质网分子伴侣BiP的全长cDNA，将其克隆入OmiesLink^TM表达载体pReceiver—B01a，构建重组表达质粒pReceiver—B01a—BiP。重组表达质粒导人大肠杆菌BL-21（DE3）菌株中诱导表达目的蛋白，表达产物以Ni^＋-NTA agarose层析柱纯化。SDS-PAGE和免疫印迹法（Western blot）分析发现，表达产物以可溶性蛋白和包涵体形式共同存在，表达量约占菌体蛋白总量的20％～30％。相对分子质量约为80000，纯度达到电泳级。经免疫印迹法鉴定，获得的BiP重组蛋白可以与RA患者血清反应，检测的抗BiP抗体在RA患者血清中的阳性率为75．4％（49／65），明显高于系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）患者14．6％（7／48）、原发性干燥综合征（primary Sjoegren’s syndrome，pSS）患者7．3％（4／55）及正常人0％（0／71）（P〈0．01）。表明，经原核表达获得的BiP全长蛋白，RA患者血清抗体可以很好结合，有望应用于临床血清学诊断。

内质网分子伴侣糖调节蛋白94在大鼠酒精性肝损伤中的高表达和意义

目的检测酒精性肝损伤大鼠肝组织内质网分子伴侣糖调节蛋白94的表达情况,探讨酒精性肝损伤的发病机制。方法24只SD雌性大鼠分成对照组和模型组。模型组大鼠给予乙醇加鱼油灌胃配合高脂饮食8周,建立酒精性肝损伤模型,应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和免疫组化法检测大鼠肝组织内质网分子伴侣糖调节蛋白94mRNA和蛋白水平。结果与正常组比较,模型组大鼠肝组织糖调节蛋白94mRNA和蛋白表达明显增强(P<0.01)。结论酒精性肝损伤大鼠存在糖调节蛋白94高表达,这可能是该病的发病机制之一。

内质网分子伴侣家族成员在幽门螺杆菌感染者胃黏膜中的表达和意义(英文)

目的探讨内质网分子伴侣家族成员Grp94、Grp78和PDI在幽门螺杆菌感染者胃黏膜组织中的表达及意义。方法应用半定量RT-PCR方法及Westernblot方法分别检测感染与未感染幽门螺杆菌的人胃黏膜组织中Grp94、Grp78和PDI的mRNA及蛋白的表达情况。结果未感染组28例,Grp94、Grp78和PDI的mRNA表达量分别为(0.427±0.0360)、(0.8038±0.500)和(0.5198±0.0379),感染组32例,Grp94、Grp78和PDImRNA表达量为(0.882±0.082)、(1.1586±0.0839)和(1.0642±0.1533)。两组相比,感染组的Grp94、Grp78和PDImRNA的表达量明显高于未感染组(P<0.01);未感染组Grp94、Grp78和PDI蛋白表达量分别为(0.427±0.0360)、(0.4345±0.0545)和(0.5198±0.0379),感染组Grp94、Grp78和PDI蛋白表达量为(0.671±0.072)、(0.6204±0.0412)和(0.8252±0.032)。两组相比,感染组Grp94蛋白的表达量明显高于未感染组(P<0.01)。结论幽门螺杆菌感染可使人胃黏膜增加Grp94、Grp78和PDImRNA的表达及蛋白的合成,这可能有利于胃黏膜的自身保护作用。

内质网分子蛋白在小鼠腹水型肝癌高、低淋巴道转移株中的表达及意义

背景与目的:内质网分子伴侣29(endoplasmic reticulum molecular chaperons 29,ERp29)是一种内质网应激蛋白,其高表达与肿瘤转移相关。本研究旨在探讨ERp29在小鼠腹水型肝癌高、低淋巴道转移株中的表达及与肝癌淋巴道转移的关系。方法:构建小鼠腹水型肝癌细胞株(高转移株Hca-F、低转移株Hca-P)淋巴道转移动物模型,通过免疫组织化学、蛋白质印迹法(Western blot)和流式细胞仪等方法检测ERp29在Hca-F、Hca-P细胞株中的表达情况。结果:免疫组织化学检测结果显示,ERp29在Hca-F、Hca-P中均呈阳性表达,定位于细胞质,部分细胞核也有表达。Western blot检测结果显示,ERp29在Hca-F、Hca-P中的表达吸光度值分别为0.97±0.03和1.17±0.03,ERp29在Hca-F细胞株中的表达(吸光度值)明显低于Hca-P,差异有统计学意义(P<0.01)。流式细胞仪检测结果显示,ERp29在Hca-F细胞株中的相对荧光强度值(375.27±47.33)显著低于Hca-P(623.91±46.80),差异有统计学意义(P<0.01)。结论:ERp29在小鼠腹水型肝癌细胞株Hca-F和Hca-P均有表达,且在Hca-F中表达较低,而在Hca-P中表达较高。ERp29可能与肝癌淋巴道转移密切相关。

HLA-Ⅰ类抗原及内质网分子伴侣表达下调与新疆哈萨克族食管鳞癌的关系

目的:探讨人类白细胞抗原Ⅰ类分子(human leukocyte antigen classⅠ,HLA-Ⅰ)类抗原及内质网分子伴侣在新疆哈萨克族食管癌中的表达水平及其与临床病理特征之间的关系.方法:用免疫组织化学法检测50例新疆哈萨克族食管鳞癌、癌旁石蜡包埋组织中HLA-Ⅰ类分子和内质网分子伴侣中的表达水平,同时分析其蛋白表达下调和缺失与临床病理特征的关系.结果:在食管癌组织中,HLA-Ⅰ类抗原和内质网分子伴侣钙连接蛋白(CNX)、TAP相关蛋白(Tapasin)、蛋白质二硫异构体(Erp57)的表达下调和缺失率分别为24%/68%、20%/48%、20%/52%、16%/32%,在癌旁组织中的表达下调和缺失率为4%/0%、10%/2%、8%/2%、16%/2%.食管癌组织中HLA-Ⅰ分子及内质网分子伴侣较癌旁组织中有明显的表达下调或缺失,其差异均有统计学意义(P<0.05).在临床病理特征中,HLA-Ⅰ与肿瘤分化、淋巴结转移、肿瘤浸润深度密切相关;CNX与肿瘤分化、血管侵袭、淋巴结转移、肿瘤浸润深度密切相关;Erp57与淋巴结转移、血管侵袭、肿瘤浸润深度密切相关;Tapasin与肿瘤分化、肿瘤浸润深度密切相关,表达差异均有统计学意义(P<0.05).结论:新疆哈萨克族食管癌中有明显的HLA-I类抗原及内质网分子伴侣的表达下调或缺失,这与哈萨克族食管癌的发生及肿瘤的临床病理特征密切相关.

维吾尔族患者宫颈病变中内质网分子伴侣和HLA-Ⅰ类分子表达与HPV16感染的关系研究

目的:探讨宫颈病变中内质网分子伴侣与HLA-Ⅰ和HPV16表达的关系。方法:通过免疫组化SP法检测内质网分子伴侣和HLA-Ⅰ类分子在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌患者石蜡包埋组织中的表达水平;以PCR技术检测相应标本中HPV16感染的情况。结果:CIN中分子伴侣钙连接蛋白(CNX)、钙网蛋白(CRT)、TAP相关蛋白(Tapasin)、蛋白质二硫异构体Erp57和HLA-Ⅰ抗原的表达下调和缺失率分别为15.6%/21.9%、21.9%/15.6%、28.1%/15.6%、20.3%/21.9%和31.2%/29.7%。在宫颈癌组织中表达下调和缺失率分别为22.2%/30.0%、20.6%/34.9%、23.8%/28.6%、30.0%/28.6%和31.7%/47.6%,并且随着宫颈病变的加重,其表达下调和缺失率增加(P<0.05)。CRT和ERp57与宫颈癌分化程度密切相关,Tapasin、CNX、ERp57与淋巴结转移密切相关,Tapasin与FIGO临床分期密切相关,表达差异均有统计学意义(P<0.05)。在CIN中HLA-Ⅰ与CNX、CRT、ERp57表达下调呈正相关,HPV16感染与CRT、ERp57表达呈负相关。宫颈癌中HLA-Ⅰ与CRT、ERp57和Tapasin表达下调呈正相关,HPV16感染与Tapasin、CNX、CRT、ERp57表达呈负相关。结论:在CIN和宫颈癌组织中内质网分子伴侣表达下调,可能是影响HLA-Ⅰ类分子在细胞表面正常表达的重要原因之一。而HPV16也可能利用此途径逃避免疫监视,促进宫颈癌的发生和发展。

大鼠内耳老化模型与内质网分子伴侣水平变化

老年性聋的发生是基因及环境因素共同作用的结果,是整个听觉通路的退行性病变。本实验用D-半乳糖建立了大鼠内耳老化模型,并应用此模型研究讨内质网应激与老年性聋的关系,为进一步揭示老年性聋发病机制及其防治策略奠定基础。

人内质网分子伴侣BiP抗原表位筛选及其在RA血清学诊断中的作用研究

目的:筛选鉴定人内质网分子伴侣BiP抗原表位多肽,探讨其在类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)血清学诊断中的价值。方法:运用计算机软件分析BiP蛋白的结构特点及抗原决定簇分布,根据结果设计合成系列多肽。比较合成多肽与RA患者血清(BiP抗体阳性)IgG的反应强弱,鉴定抗原抗体反应最强的抗原表位多肽。进一步以获得的BiP抗原表位多肽作为包被抗原,检测79例RA患者、34例系统性红斑狼疮(SLE)患者、66例干燥综合征(SS)患者和173例正常人血清中抗BiP抗原表位多肽IgG抗体水平。结果:筛选到一条与RA患者血清反应最强的多肽(N403),抗N403多肽IgG抗体在RA患者中的阳性率(67%),明显高于SS患者(29%)、SLE患者(0%)、和正常人(0%)(P<0.01)。抗N403多肽IgG抗体在RA血清学诊断中的敏感性为67%,特异性为93%。而且该抗体的检测对于RF、CCP、HRF、RA33、AKA、APF等抗体阴性的RA患者的诊断具有重要意义。结论:筛选获得的BiP抗原表位多肽N403,其检测抗体在RA临床血清诊断中具有很好的应用价值。

内质网分子伴侣Grp94在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的 探讨胃癌组织中Grp94的表达及其与胃癌病理类型、临床分期及分化程度等的关系。方法 胃癌切除手术标本 3 0例 ,用半定量逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR )检测Grp94mRNA相对表达量 ;免疫组织化学方法检测Grp94蛋白表达情况。结果 半定量RT PCR显示癌组织与癌旁组织中都有Grp94mRNA表达 ,癌组织为 0 .5 2± 0 .12 ,癌旁组织为 0 .14± 0 .0 4。前者的表达水平显著高于后者 ,其表达程度与肿瘤大小成正比 ,并随着细胞分化的降低而增高 ,Ⅲ、Ⅳ期病人显著高于Ⅰ、Ⅱ期 ;与患者性别、年龄、转移无关。免疫组织化学结果为 :癌组织大多数表达在 ～ ,癌旁组织大多表达在 -～ ,癌组织表达程度显著高于癌旁正常组织。Grp94蛋白表达程度与肿瘤大小、细胞分化、临床分期有关。结论 胃癌组织的Grp94表达呈增高趋势 ;应用Grp抑制剂或应用反义抑制战略可能抑制中晚期胃癌的生长 。

中药清毒栓对HeLa细胞MHC-Ⅰ抗原呈递通路相关内质网分子伴侣表达的影响

目的探讨中药清毒栓治疗宫颈高危型HPV感染的分子机制。方法以HPV18阳性的宫颈癌细胞系HeLa为细胞模型,清毒栓水提醇沉液、β-榄香烯、干扰素α-2b进行干预;分别采用Western blot及Real-time PCR检测MHC-Ⅰ抗原呈递通路相关内质网分子伴侣CNX、CRT、BIP的蛋白及基因表达差异。结果与对照组相比,3种药物均可不同程度的上调内质网分子伴侣CRT与CNX的蛋白表达,但对CRT与CNX的基因表达无影响(P>0.05);干扰素α-2b可上调BIP的蛋白表达(P<0.05),对BIP的基因表达无影响(P>0.05);清毒栓及β-榄香烯可上调BIP的基因表达,但对其蛋白表达无影响(P>0.05)。结论中药清毒栓及其有效成分之一β-榄香烯可通过上调内质网分子伴侣CNX及CRT的蛋白表达,促进宫颈癌细胞系HeLa的抗原呈递。

过量表达内质网小分子热激蛋白增强转基因番茄果实的耐冷藏性

利用番茄内质网小分子热激蛋白(ERsHSP)特异性抗体,对番茄果实蛋白进行Western分析,以测定低温冷藏下番茄果实中ERsHSP的表达量,并测定果实硬度、腐烂度和失重率等指标,以比较中蔬4号转ERsHSP基因番茄和未转基因番茄果实在4℃低温下的耐冷藏性.结果表明:在4℃冷藏30 d期间,转基因番茄果实具有较高的ERsHSP表达水平,而未转基因番茄果实中没有ERsHSP的表达;相对于未转基因番茄果实,转基因番茄果实冷害症状轻,并具有较高的果实硬度(平均值为2.84 kg/cm2)、较低的果实腐烂度(平均值为21.03%)和失重率(平均值为6.33%).

葛根素基于内质网蛋白核心/信号分子/C/EBP同源蛋白通路对脂多糖诱导成骨细胞骨保护素及核因子-κB受体mRNA表达的影响

目的探讨基于内质网蛋白核心/信号分子/C/EBP同源蛋白(GRP78/PERK/CHOP)通路研究葛根素对脂多糖(LPS)诱导成骨细胞骨保护素(OPG)和核因子-κB受体(RANKL)mRNA表达的影响。方法体外培养小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1,采用随机数字表法分为对照组、模型组、4-苯基丁酸钠盐(内质网应激抑制剂,4-PBA)组、葛根素组、葛根素+4-PBA组,除对照组,其余各组以LPS处理MC3T3-E1细胞建立成骨细胞炎症模型,以茜素红染色、碱性磷酸酶(ALP)试剂盒分别检测各组细胞矿化结节相对比例、ALP活性,判定细胞成骨分化情况;以酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒检测各组细胞培养基上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)水平;以实时荧光定量(qRT-PCR)检测各组细胞成骨相关基因(Runx2)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)mRNA水平及OPG、RANKL mRNA水平;以免疫印迹检测细胞GRP78、PERK、CHOP蛋白表达。结果与对照组相比,模型组MC3T3-E1细胞矿化结节相对比例[(8.23±1.18)%比(100.00±0.00)%]、ALP活性[(0.49±0.12)U/mgprot比(1.57±0.35)U/mgprot]、细胞Runx2[(0.41±0.05)比(1.01±0.13)]、OPN[(0.39±0.04)比(1.02±0.15)]、OCN[(0.40±0.03)比(0.99±0.14)]及OPG mRNA[(0.41±0.11)比(1.03±0.17)]水平明显降低(P<0.05),细胞培养基上清液中TNF-α[(602.43±20.01)pg/mL比(381.86±18.16)pg/mL]及IL-6水平[(483.63±16.61)pg/mL比(280.15±11.18)pg/mL]、细胞RANKL mRNA[(3.03±0.62)比(0.99±0.13)]水平及GRP78[(1.31±0.24)比(0.19±0.05)]、PERK[(1.23±0.27)比(0.33±0.08)]、CHOP蛋白[(1.21±0.28)比(0.31±0.07)]表达明显升高(P<0.05)。与模型组相比,4-PBA组、葛根素组、葛根素+4-PBA组MC3T3-E1细胞矿化结节相对比例、ALP活性、细胞Runx2、OPN、OCN及OPG mRNA水平均升高(P<0.05),细胞培养基上清液中TNF-α及IL-6水平、细胞RANKL mRNA水平及GRP78、PERK、CHOP蛋白表达均降低(P<0.05)。与4-PBA组、葛根素组分别相比,葛根素+4-PBA组MC3T3-E1细胞矿化结节相对比例、ALP活性、细胞Runx2、OPN、OCN及OPG mRNA水平均升高(P<0.05),细胞培养基上清液中TNF-α及IL-6水平、细胞RANKL mRNA水平及GRP78、PERK、CHOP蛋白表达均降低(P<0.05),4-PBA组与葛根素组上述各项指标比较均差异无统计学意义(P>0.05)。结论葛根素可上调OPG mRNA水平,下调RANKL mRNA水平,降低LPS诱导的成骨细胞炎症反应,拮抗LPS对成骨细胞成骨分化的抑制作用,可能是通过下调GRP78/PERK/CHOP通路实现的。

胎盘内质网应激相关分子伴侣ERdj1与子痫前期发病的关系

目的:探讨胎盘组织中内质网应激相关分子伴侣ERdj1的mRNA及蛋白的表达,及其与子痫前期发病的关系。方法:收集剖宫产分娩36例孕妇的胎盘,其中正常足月妊娠妇女12例(正常对照组),轻度子痫前期患者12例(轻度子痫前期组),重度子痫前期患者12例(重度子痫前期组)。应用透射电镜扫描观察子痫前期胎盘组织中滋养细胞内质网超微结构改变,通过RT-PCR技术检测胎盘组织中ERdj1 mRNA的表达,蛋白印迹法检测胎盘组织中ERdj1蛋白的表达。结果:①正常对照组胎盘滋养细胞中内质网体积无明显增大,内质网无肿胀;子痫前期组胎盘滋养细胞中内质网体积增大、扩张及液泡化。②轻、重度子痫前期组ERdj1 mRNA的表达水平(2.1327±0.4855,2.3064±0.1004)显著高于正常对照组(0.2809±0.0064),差异有高度统计学意义(P<0.01);重度子痫前期组与轻度子痫前期组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。③轻、重度子痫前期组ERdj1蛋白表达水平(3.8412±0.8423,4.9421±0.9810)显著高于正常对照组(1.5678±0.2315),差异有高度统计学意义(P<0.01);重度子痫前期组与轻度子痫前期组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:子痫前期胎盘滋养细胞内质网有明显扩张及肿胀性改变;内质网应激相关分子伴侣ERdj1参与了子痫前期的病理生理过程,可能是子痫前期发病的重要机制之一。

植物内质网小分子量热激蛋白的生物学功能

介绍了植物ERs HSP的结构特点、分子伴侣活性及逆境抗性等生物学功能,并展望了该领域今后的研究方向,为深入研究植物的逆境胁迫机制以及分子水平的作物育种提供了新思路。

甜椒内质网小分子热激蛋白基因(CaHSP22.5)克隆及其在转基因烟草中的表达分析

【目的】克隆甜椒内质网小分子热激蛋白基因(CaHSP22.5),并检测其表达特性,为探究其在植物抗逆中的调控机制提供理论依据。【方法】克隆CaHSP22.5基因并构建其表达载体pBI121-CaHSP22.5,转化农杆菌LBA4404后通过叶盘法转化野生型烟草,即获得CaHSP22.5转基因株系;以转pBI121空载体的野生型烟草为对照组。对转基因株系和野生型烟草进行4℃6 h低温处理,根据幼苗成活率测定CaHSP22.5基因表达对植株耐寒性的影响。采用脉冲振幅调制叶室荧光仪Li-6400测量4℃处理10 h后野生型植株与CaHSP22.5转基因株系叶绿素荧光,根据非光化学淬灭系数(NPQ)值测定CaHSP22.5基因表达对在低温下植株光合作用的影响;使用过氧化氢(H2O2)钛络合物法对烟草叶片中H2O2进行定量分析,通过测定活性氧(ROS)积累程度分析CaHSP22.5对植物光合系统的影响;采用检测柠檬酸合成酶(CS)活性的方法,在体外通过对变性CS复性的影响测定CaHSP22.5的分子伴侣活性。【结果】经低温处理后发现CaHSP22.5转基因株系13号、24号和32号幼苗的平均存活率分别为84%、75%和52%,而野生型烟草的平均存活率为30%,CaHSP22.5转基因株系烟草幼苗成活率菌高于野生型幼苗。低温处理10 h后发现CaHSP22.5转基因植株NPQ较野生型植株显著升高(P<0.05),说明转基因烟草中CaHSP22.5的积累有利于保护光合系统,在低温胁迫下清除ROS。同时发现低温胁迫导致植株ROS产量增加,CaHSP22.5转基因植系与野生型相比ROS积累水平较低。不同浓度的CaHSP22.5均可使变性的CS复性,且其CS活性均高于未添加CaHSP22.5的CS活性。【结论】CaHSP22.5蛋白可增强植株的耐寒性及光合作用,在植物体内可降低ROS积累,减轻脂质过氧化,同时具有分子伴侣活性。

PI3K/Akt/GSK3β信号通路及内质网应激蛋白在大鼠难免性压疮形成中表达变化

目的:探讨磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/糖原合成激酶3β(GSK3β)信号通路及内质网(ER)分子伴侣在大鼠难免性压疮中的表达变化。方法:54只雄性SD大鼠按照随机数字表法分为正常对照组(Con组),1个周期受压组(1c组)、3个周期受压组(3c组)、6个周期受压组(6c组)、9个周期受压组(9c组)和恢复期1 d组、3 d组、5 d组、7 d组,每组各6只。取各时间点受压部位肌肉组织,行HE染色观察组织的形态变化,SABC免疫组织化学法检测受压组织caspase-3的表达;蛋白质印迹(Western blotting)法检测受压组织中ER分子伴侣及Akt、GSK3β的变化。结果:HE染色结果显示,与Con组比较,各受压组局部肌肉组织呈现逐步退化的病理改变,在恢复组病理现象仍然存在;受压组和恢复组caspase-3蛋白表达均高于Con组,棕黄色颗粒表达主要在胞浆;Western blotting法检测受压组织中ER分子伴侣发现,其蛋白表达总体上呈上升趋势;与Con组比,受压组和恢复组p-Akt蛋白表达呈先上升后下降的趋势;与Con组比,受压组p-GSK3β蛋白表达首先表现为先上升后下降的趋势,在恢复组表达呈先下降后上升趋势。结论:难免性压疮难以愈合的原因可能与受压肌肉细胞凋亡有关;ER应激及PI3K/Akt/GSK3β信号通路可能参与了难免性压疮损伤过程。