自噬降低激活β1-AA诱导的心肌细胞内质网应激相关凋亡途径

目的β1-肾上腺素受体自身抗体(β1-AA)诱导的心肌细胞自噬降低是否参与内质网应激(ERS)相关凋亡途径的激活。方法β1-肾上腺素受体细胞外第二环(β1-AR-ECII)抗原肽段主动免疫大鼠;亲和层析法纯化血清中的β1-AA; SDS-PAGE检测抗体纯度; Western blot检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3和p62的表达; Western blot及免疫组化法检测内质网应激(ERS)诱导的细胞凋亡途径相关蛋白GRP78、CHOP和caspase-12的表达。结果与对照组相比,β1-AA处理H9c2心肌细胞12和24 h后,Beclin1和LC3蛋白表达明显降低,p62蛋白表达明显增加;β1-AA作用12和24 h后,GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表达均显著增加; 3MA抑制心肌细胞自噬后β1-AA诱导的ERS相关凋亡途径进一步激活; Rapa上调心肌细胞自噬水平后可明显逆转β1-AA诱导的ERS相关凋亡途径的激活。结论 1)β1-AA可以引起心肌细胞自噬降低,并诱导ERS相关凋亡途径激活; 2)自噬降低参与β1-AA诱导的心肌细胞ERS相关凋亡途径的激活。

心肌梗死后心力衰竭小鼠心肌组织内质网应激相关凋亡途径的研究

目的:探讨心肌梗死后心力衰竭小鼠心肌组织内质网应激介导的凋亡途径。方法:结扎小鼠左冠状动脉前降支建立心肌梗死后心力衰竭(心衰)模型,32只小鼠利用随机数字法分4组:假手术组、心肌梗死后2周组、4周组和6周组,采用超声心动图检查观察心室扩张及心功能变化情况,Western blotting检测内质网分子伴侣GRP78蛋白以及内质网应激相关凋亡蛋白CCAAT/增强子结合蛋白ε(CCAAT/enhancer-binding proteinε,CHOP)、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)及其磷酸化水平、caspase-12及其活性剪切片段的表达。采用TUNEL法观察心肌细胞的凋亡情况。结果:与假手术组相比较,心肌梗死后心力衰竭的小鼠左心室扩大,心功能下降。小鼠心肌组织GRP78、CHOP蛋白表达增高(P<0.05)。JNK、caspase-12蛋白表达没有明显变化,但其活化形式磷酸化JNK及剪切后的caspase-12表达增高(P<0.05)。TUNEL染色显示心肌梗死后心力衰竭的小鼠心肌组织凋亡明显增多(P<0.05)。结论:心肌梗死后心力衰竭诱导内质网应激反应,并伴随着其相关的CHOP、JNK、caspase-12三条通路的激活,提示内质网应激可能参与了心梗后心衰中心肌细胞的凋亡。

低硒对大鼠心肌细胞内质网应激相关凋亡途径的研究

目的观察低硒对大鼠心肌细胞内质网应激及细胞凋亡的影响。方法建立低硒仔三代大鼠(SDf3)、低硒仔三代补硒(SSf3)及对照组模型。采用颈动脉插管法测其心功能;Western blotting检测心肌组织中内质网应激标志蛋白GRP78、CHOP的表达变化。采用免疫组织化学SP法染色观察心肌细胞的凋亡情况。结果 SDf3组大鼠血硒及GPx活性明显低于对照组,而心肌组织GRP78、CHOP蛋白表达显著增高。SP法染色观察发现SDf3组大鼠心肌细胞凋亡明显增加(P<0.05)。结论低硒可以诱导大鼠心肌组织内内质网应激反应,内质网应激可能参与了心肌细胞的凋亡。

黄蒲通窍胶囊改善Wilson病铜负荷大鼠的认知损害:基于抑制内质网应激介导的凋亡途径

目的探究黄蒲通窍胶囊(HPTQ)对Wilson病(WD)铜负荷大鼠模型的神经保护作用及其可能的作用机制。方法SD大鼠随机分为6组:对照组、模型组、黄蒲通窍胶囊低剂量组(HPTQ-L,0.47 g/kg)、黄蒲通窍胶囊中剂量组(HPTQ-M,1.41 g/kg)、黄蒲通窍胶囊高剂量组(HPTQ-H,4.23 g/kg)、青霉胺组(PCA,0.09 g/kg),10只/组。通过含铜(1 g/kg)饲料、含铜(0.185%)水喂养12周构建WD铜负荷大鼠模型,铜离子(Cu)测定试剂盒检测肝铜、24 h尿铜水平;Morris水迷宫实验评估大鼠学习记忆能力;HE染色法观察海马组织CA1区神经元形态学改变;TUNEL染色观察海马组织CA1区神经元凋亡水平;免疫荧光法检测内质网应激(ERS)标志蛋白GRP78的表达情况;RT-qPCR和Western blot法检测GRP78、CHOP、caspase-12、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3基因和蛋白表达水平。结果与对照组比较,模型组肝铜及24 h尿铜水平明显升高(P<0.01);学习记忆能力明显减弱(P<0.01);CA1区海马神经元出现损伤;TUNEL阳性神经元数量增多(P<0.01);GRP78、CHOP、caspase-12、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3基因和蛋白表达水平升高(P<0.01)。与模型组比较,HPTQ各组及PCA组肝铜水平降低、24 h尿铜水平升高(P<0.01);学习记忆能力改善(P<0.01,P<0.05);海马神经元损伤减轻;TUNEL阳性神经元数量减少(P<0.01);GRP78、CHOP、caspase-12、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3基因和蛋白表达水平降低(P<0.01,P<0.05)。结论HPTQ对WD铜负荷大鼠模型具有神经保护作用,其机制可能与抑制ERS介导的凋亡途径有关。

ROS/PERK介导的内质网应激在白花蛇舌草总黄酮诱导CNE1鼻咽癌细胞周期阻滞和凋亡中的作用

目的:探究白花蛇舌草总黄酮对鼻咽癌细胞CNE1周期和凋亡的影响及可能的分子作用机制。方法:①为研究白花蛇舌草总黄酮对CNE1细胞周期和凋亡的影响,在考察白花蛇舌草总黄酮对鼻咽癌细胞CNE1和鼻咽上皮细胞NP69细胞活力的影响后,将CNE1细胞分为对照组、白花蛇舌草总黄酮(25、50、100μg/mL)组;四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测细胞活力;平板克隆检测白花蛇舌草总黄酮对CNE1细胞克隆形成能力的影响;JC-1荧光探针检测线粒体膜电位;Hoechst 33258染色检测细胞凋亡形态学变化;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率;②为研究白花蛇舌草总黄酮抑制CNE1细胞增殖可能的分子机制,将CNE1细胞分为对照组、白花蛇舌草总黄酮(100μg/mL)组,采用Western Blot检测p-PERX、ATF4、CHOP蛋白表达,并利用转录组测序技术获取基因表达,对差异表达基因进行生物学分析;③为研究类PKR的内质网激酶(PERK)在白花蛇舌草总黄酮诱导CNE1细胞周期阻滞和凋亡中的作用,采用小干扰核糖核酸(siRNA)进行干预;④为研究活性氧(ROS)在调控PERK信号中的作用,在白花蛇舌草总黄酮处理过程中孵育N-乙酰半胱氨酸(NAC)。结果:与对照组比较,白花蛇舌草总黄酮组CNE1细胞的存活率显著降低(P<0.05),其作用呈剂量及时间依赖性。白花蛇舌草总黄酮处理引起的细胞周期阻滞于G_(0)/G_(1)期并诱导CNE1细胞的凋亡(P<0.05),其作用呈浓度依赖性。转录组测序结果表明,白花蛇舌草总黄酮处理后细胞中PERK信号通路变化显著。与对照组比较,白花蛇舌草总黄酮处理引起p-PERK、ATF4、CHOP蛋白表达显著升高(P<0.05)。与NC siRNA+白花蛇舌草总黄酮组比较,PERK siRNA组和PERK siRNA+白花蛇舌草总黄酮组细胞凋亡率、G_(0)/G_(1)期比例及p-PERK、ATF4、CHOP蛋白表达显著降低(P<0.05)。与白花蛇舌草总黄酮组比较,NAC+白花蛇舌草总黄酮组CNE1细胞ROS水平和p-PERK蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论:白花蛇舌草总黄酮诱导CNE1细胞周期阻滞和凋亡可能与其激活ROS调节的PERK信号通路有关。

内质网应激诱导细胞类凋亡的机制研究进展

类凋亡(paraptosis)是一种新的程序性细胞死亡方式,以内质网和线粒体肿胀、细胞质空泡化为典型特征。有研究表明:内质网应激(endoplasmicreticulumstress,ERS)不仅可以调控类凋亡,还有可能与多种类凋亡信号通路发生作用。文章对内质网应激与类凋亡之间的关系及调控机制进行了综述,并探讨了目前类凋亡研究尚未解决的问题,力求从中探寻内质网应激在类凋亡中的具体作用机制,以期为类凋亡相关的药物作用靶点的发现及药物研发提供理论依据和参考。

小反刍兽疫病毒诱导的内质网应激对山羊肾细胞PERK信号通路和细胞凋亡的影响

病毒感染可引起宿主细胞产生内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)和未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR),导致内质网稳态失衡。为了深入探讨小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)感染诱导的ERS对宿主细胞UPR信号通路、病毒复制和细胞凋亡的影响,采用MTT试验测定、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot观察PPRV在山羊肾细胞(LDG-2)的增殖,采用Western blot和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)观察PPRV感染对GRP78、PERK及其下游信号分子、细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达水平的影响。结果显示,PPRV感染36 h后,细胞存活率显著降低并产生明显细胞病变,PPRV-N蛋白表达水平呈上升趋势,且在病毒感染30 h后显著高于细胞对照;与此同时,GRP78、p-eIF2α和GADD153表达水平、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比值均显著升高。用4-PBA阻断PPRV诱导的ERS,PPRV感染细胞中PPRV-N蛋白、GRP78、p-eIF2α和GADD153表达水平及p-eIF2α/eIF2α、p-PERK/PERK比值均显著降低。在PPRV感染30和36 h,与细胞凋亡相关的Bcl-2表达下调,Bax表达上调,Bcl-2/Bax比值则显著降低。由此可见,PPRV感染可激活PERK/eIF2α/GADD153信号通路,缓解病毒诱导的ERS,促进病毒复制;阻断PPRV诱导的ERS,可抑制PERK信号通路和病毒复制;PPRV感染和持续的ERS可诱导宿主细胞凋亡。

牛磺熊去氧胆酸通过抑制内质网应激诱导的凋亡促进类鼻疽菌的清除

目的 拟通过类鼻疽菌感染RAW264.7巨噬细胞模型,探讨牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)促进类鼻疽菌胞内清除的作用机制。方法 类鼻疽菌感染RAW264.7细胞后8 h,设置未感染组和类鼻疽菌感染组,在不同浓度TUDCA处理条件下,采用流式细胞仪检测类鼻疽菌诱导细胞凋亡的情况;同时使用另外一种内质网应激抑制剂4-PBA,通过Annexin-V/PI双染法和MTT细胞增殖实验分别检测类鼻疽菌感染对宿主细胞凋亡和增殖的影响;进一步使用siRNA干扰内质网应激关键基因CHOP,设置siC对照组和siCHOP干扰组,通过Western blot和流式细胞仪检测类鼻疽菌感染后Caspase-3、Caspase-12等细胞凋亡相关蛋白的表达水平及细胞凋亡情况;通过细菌胞内生存实验分析TUDCA通过抑制内质网应激减少其诱导的细胞凋亡、增强巨噬细胞对类鼻疽菌胞内清除作用的机制。结果 在不同浓度TUDCA处理下,100μmol/L或200μmol/L TUDCA可明显减少类鼻疽菌感染诱导的RAW264.7细胞凋亡数量(P<0.05)。分别使用两种内质网应激抑制剂TUDCA和4-PBA均可降低类鼻疽菌感染诱导的细胞凋亡(P<0.05)。在siC对照组,相较于未感染时类鼻疽菌感染后Caspase-3和Caspase-12表达明显增加。在siCHOP干扰组,细胞凋亡相关蛋白的表达显著低于siC对照组,TUDCA处理后细胞凋亡相关蛋白表达水平与未加TUDCA药物相比无明显差异。流式细胞仪检测结果也显示,TUDCA能够减少类鼻疽菌感染后诱导的细胞凋亡(P<0.05),但在siCHOP干扰组中,TUDCA对类鼻疽菌感染诱导的凋亡无明显改变。细菌胞内生存计数结果显示,在siC对照组加入TUDCA能够增加宿主细胞对类鼻疽菌的清除(P<0.05),而在siCHOP干扰组中TUDCA的处理对类鼻疽菌胞内增殖无明显影响。结论 在类鼻疽菌感染RAW264.7细胞模型中,TUDCA能够通过抑制巨噬细胞内质网应激诱导的凋亡,促进巨噬细胞对类鼻疽菌的胞内清除。

基于内质网应激PERK/ATF4/CHOP信号通路探讨丹参多酚酸盐对膜性肾病大鼠足细胞凋亡的影响

目的:基于蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/活化转录因子4(ATF4)/转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)信号通路探讨丹参多酚酸盐对膜性肾病(MN)大鼠内质网应激的影响。方法:将80只雄性SD大鼠随机分配,其中20只为正常组,剩余60只大鼠采用尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)的方法诱导MN病变。将造模成功的大鼠随机分为模型组、贝那普利组和丹参多酚酸盐低、中、高剂量组,每组10只,另取10只正常组大鼠共同进行实验。贝那普利组每日给药剂量为10 mg/kg,丹参多酚酸盐低、中、高剂量组每日给药剂量分别为16.7、33.3、66.7 mg/kg,正常组和模型组予等体积生理盐水,各组均每日灌胃1次,连续4周。检测各组大鼠治疗后24 h尿蛋白定量(24 h-UTP);腹主动脉取血分离血清,检测各组大鼠血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)含量;过碘酸六胺银(PASM)染色后光镜观察各组大鼠肾组织病理形态,透射电子显微镜进一步观察各组大鼠肾组织细微结构变化;免疫荧光法检测各组大鼠肾组织免疫球蛋白G(IgG)沉积情况;免疫组化(IHC)法检测各组大鼠肾组织足细胞裂隙膜蛋白(Podocin)、足细胞裂孔隔膜蛋白(Nephrin)表达水平;蛋白免疫印迹(Western blot)法检测各组大鼠肾组织PERK、ATF4、CHOP、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达。结果:相较于正常组,模型组大鼠的肾组织显示出显著的病理性变化,肾小球基底膜显著增厚,并出现类似钉突的结构改变,同时伴有系膜基质的增生现象,沿毛细血管袢有IgG弥漫性沉积;各给药组大鼠肾组织上述病理改变有所缓解,足细胞损伤减少,IgG沉积减轻。模型组大鼠24 h-UTP水平显著高于正常组(P<0.01);各给药组大鼠24 h-UTP水平均显著低于模型组(P<0.05,P<0.01),其中丹参多酚酸盐中剂量组大鼠24 h-UTP水平与贝那普利组比较差异无统计学意义(P>0.05),丹参多酚酸盐高剂量组大鼠24 h-UTP水平明显低于贝那普利组(P<0.01),丹参多酚酸盐对MN模型大鼠24 h-UTP水平的降低作用具有明显的剂量依赖性(P<0.01)。各组大鼠血清BUN、Scr水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠肾组织Podocin、Nephrin蛋白表达显著低于正常组(P<0.05);各给药组大鼠上述蛋白表达均显著高于模型组(P<0.05),其中丹参多酚酸盐中剂量组大鼠上述蛋白表达水平与贝那普利组比较差异无统计学意义(P>0.05),丹参多酚酸盐高剂量组大鼠上述蛋白表达水平明显高于贝那普利组(P<0.05),丹参多酚酸盐对MN模型大鼠上述蛋白表达水平的升高作用具有明显的剂量依赖性(P<0.05)。模型组大鼠肾组织PERK、ATF4、CHOP、Bax蛋白表达水平均明显高于正常组(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平明显低于正常组(P<0.01);各给药组大鼠肾组织上述蛋白表达水平均较模型组显著改善(P<0.05,P<0.01),其中丹参多酚酸盐中剂量组大鼠上述蛋白表达水平与贝那普利组比较差异无统计学意义(P>0.05),丹参多酚酸盐高剂量组大鼠上述蛋白表达的改善程度显著优于贝那普利组(P<0.01),丹参多酚酸盐对MN模型大鼠上述蛋白表达水平的改善作用具有明显的剂量依赖性(P<0.01)。结论:丹参多酚酸盐可能通过调控PERK/ATF4/CHOP信号通路,缓解肾组织内质网应激,抑制足细胞凋亡,进而保护肾脏及延缓疾病进展。

内质网应激介导的脾淋巴细胞凋亡在猪复苏后免疫功能抑制中的作用

目的探讨内质网应激介导的脾脏T淋巴细胞凋亡是否参与猪复苏后免疫功能抑制。方法通过建立心室颤动8 min心脏骤停(CA)动物模型,将26只实验用公猪随机分为假手术(Sham)组(n=6)、自主循环恢复(ROSC)12 h组(n=10)和ROSC 24 h组(n=10),ROSC后用流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群的数量及比例;分别用蛋白免疫印迹(Western blot)法和实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测脾脏T淋巴细胞葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的蛋白定量和信使RNA(messenger RNA,mRNA)水平,用原位末端标记(TUNEL)法观察脾脏T淋巴细胞的凋亡情况。结果ROSC组20只动物中有8只在首次电击中成功除颤,电击次数、总除颤能量和ROSC时间分别为(2.9±1.6)次、(472.9±169.1)J和(6.3±2.4)min。ROSC 12 h组和24 h组猪外周血CD4+T淋巴细胞明显低于Sham组[(28.4±2.3)%和(24.1±1.6)%vs.(48.4±2.9)%,均P<0.05]。ROSC 12 h组和ROSC 24 h组猪脾脏T淋巴细胞凋亡指数明显高于Sham组[(0.102±0.031)%和(0.125±0.058)%vs.(0.035±0.014)%,均P<0.01]。ROSC 12 h组和24 h组猪脾脏T淋巴细胞的GRP78(0.167±0.049和0.263±0.049 vs.0.091±0.025)、CHOP(0.146±0.027和0.150±0.048 vs.0.075±0.015)的蛋白定量和GRP78(4.767±1.890和7.706±2.919 vs.1)、CHOP(3.110±0.767和3.923±0.915 vs.1)的mRNA水平明显高于Sham组(均P<0.01)。结论内质网应激介导的凋亡机制参与复苏后猪脾脏T淋巴细胞的凋亡,可能是心肺复苏后机体产生免疫抑制的原因之一。

基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路探讨健骨颗粒对UMR-106细胞内质网应激凋亡的影响

目的探讨健骨颗粒含药血清对UMR-106成骨样细胞内质网应激ERS凋亡的影响和作用机制。方法选用UMR-106成骨样细胞,采用0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05μmol/L不同浓度的GSK2606414(PERK抑制剂)对细胞进行干预,采用CCK8法筛选GSK2606414最佳干预浓度。将生长状态较好的UMR-106细胞随机分为阴性对照组(NC组)、模型组(H_(2)O_(2)组)、健骨颗粒组(H_(2)O_(2)+JG组)和阳性对照组(H_(2)O_(2)+GSK2606414组)4组。NC组和H_(2)O_(2)组采用10%生理盐水血清干预12 h,H_(2)O_(2)+JG组采用10%健骨颗粒含药血清干预12 h,H_(2)O_(2)+GSK2606414组采用0.03μmol/L的GSK2606414和10%生理盐水血清干预12 h,除NC组外,其余各组在不更换新培养基的情况下,再分别加入10μmol/L H_(2)O_(2)干预12 h。采用激光共聚焦显微镜观察细胞内NC组和H_(2)O_(2)组GRP78和Caspase-12荧光表达情况,DCFH-DA检测活性氧(ROS)含量,激光共聚焦显微镜观察细胞内钙离子实时动态变化判断ROS/ERS模型是否成立。再采用An⁃nexin V-FITC/PI检测4组细胞晚期凋亡率,qPCR和Western blot检测4组ERS相关标志指标GRP78、PERK、eIf2α、ATF4和CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量。结果与0μmol/L组比较,0.03μmol/L的GSK2606414是干预UMR-106细胞12 h后对细胞活力没有影响的最大浓度,故使用该浓度作为后续H_(2)O_(2)+GSK2606414组的实验干预条件。与NC组相比,H_(2)O_(2)组ROS含量显著增高(P<0.01),GRP78和Caspase-12的蛋白荧光表达量明显增加,细胞内钙离子流动速度加快并持续增高,表明H_(2)O_(2)诱导UMR-106细胞ROS/ERS模型的成功建立。与NC组相比,H_(2)O_(2)组凋亡率显著增高(P<0.05),GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量均显著增高(P<0.01)。与H_(2)O_(2)组相比,H_(2)O_(2)+JG组和H_(2)O_(2)+GSK2606414组ROS含量显著降低(P<0.01),凋亡率显著降低(P<0.05),GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平(P<0.05)和蛋白相对表达量(P<0.01)均显著降低。结论健骨颗粒可通过PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路缓解内质网过度应激,降低成骨细胞凋亡率,发挥防治绝经后骨质疏松症的作用。

AMPK调节内质网应激对高糖诱导的内皮细胞凋亡的机制研究

观察一磷酸腺苷(AMP)依赖的蛋白激酶(AMPK)对内质网应激的调节作用,并探讨其对高糖诱导的内皮细胞凋亡及动脉粥样硬化的影响。方法 体外培养胰腺血管内皮细胞株(MS-1),分别用AMPK激动剂(AICAR)、AMPK抑制剂(Compund C)、内质网应激诱导剂(Thapsigargin,TG)、内质网应激拮抗剂(4-苯基丁酸,4-PBA)和高糖处理,给予低糖培养基的组为对照组,建立糖尿病致动脉粥样硬化小鼠模型,给予小剂量STZ+高脂饮食诱导糖尿病,尾静脉注射AMPKα1过表达病毒,观察AMPKα1对动脉粥硬化影响。采用CCK-8测定细胞活力,采用TUNEL法检测内皮细胞凋亡情况,采用Western blot检测内质网应激相关蛋白(PERK、BIP)的表达,采用油红染色检测动脉粥样硬化的情况。结果 与对照组相比,高糖刺激细胞后细胞凋亡和BIP蛋白表达增加(P<0.05)。相较于高糖组,给予AICAR处理后显著抑制细胞凋亡和BIP蛋白表达,给予AMPK抑制剂后明显增加细胞凋亡(P<0.05)。与高糖组相比,给予内质网诱导剂预处理高糖诱导的内皮细胞凋亡明显增加,给予内质网拮抗剂后高糖诱导的内皮细胞凋亡显著减少(P<0.05)。而高糖刺激细胞后,相较于对照组,PERK蛋白表达增加(P<0.05),但给予AICAR处理后,PERK蛋白表达无明显差异(P>0.05),与对照病毒组相比,AMPKα1过表达病毒尾静脉注射后粥样斑块形成明显减少。结论 AMPK可能通过降低BIP内质网应激相关蛋白,从而抑制高糖诱导的细胞凋亡,从而抑制动脉粥样硬化形成。

柴胡疏肝散含药血清对衣霉素诱导神经元内质网应激模型细胞凋亡的影响

目的:探讨柴胡疏肝散(CSS)含药血清对衣霉素诱导的内质网应激(ERS)模型神经元凋亡的影响。方法:采用衣霉素对NG108-15神经细胞进行诱导,建立ERS细胞模型并分成5组,模型组(10%空白兔血清干预)、安理申(盐酸多奈哌齐片)组(10%安理申含药血清干预)、2.5%CSS含药血清(低剂量)组、5%CSS含药血清(中剂量)组、10%CSS含药血清(高剂量)组。同时设置正常空白血清孵育且未经衣霉素诱导的正常组,干预后采用流式细胞仪和荧光染色检测各组细胞凋亡率。结果:流式细胞仪检测结果显示,各干预组细胞凋亡率均低于模型组(P <0.05);同时高剂量CSS含药血清组细胞凋亡率明显低于中低剂量组(P <0.05)。联合荧光染色也证明高剂量CSS含药血清组细胞凋亡率明显低于中低剂量组。结论:CSS能够抑制衣霉素诱导的ERS模型神经元凋亡,且其抑制作用随着药物浓度升高而增强。

苁蓉散通过抑制内质网应激减少AD模型大鼠海马神经元细胞凋亡

目的:探究苁蓉散(Cong Rong San,CRS)对阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)模型大鼠神经元损伤及内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的影响。方法:将60只SD雄性大鼠(2月龄)随机分为对照组、模型组、低剂量CRS组、中剂量CRS组、高剂量CRS组和盐酸美金刚组。Morris水迷宫实验检测大鼠的学习记忆能力;HE和尼氏染色观察大鼠海马CA1区的神经元形态;透射电镜观察大鼠海马的内质网形态;TUNEL染色观察大鼠海马CA1区神经元的凋亡情况;Western blot实验检测大鼠海马中葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2关联X蛋白(Bcl-2-ssociated X protein,Bax)、caspase-3及通路蛋白蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、p-PERK、激活转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表达。结果:与模型组比较,中、高剂量的CRS能有效提高大鼠学习记忆能力,减少神经元的丢失,抑制ERS通路PERK-ATF4-CHOP的发生,减少海马中凋亡蛋白Bax和caspase-3的表达,增加海马中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。结论:CRS可以减轻AD大鼠认知损伤、海马神经元的损伤和神经元凋亡,其机制可能是抑制了ERS。

加味春泽汤调控内质网应激凋亡治疗脊髓损伤大鼠的尿潴留

背景:前期临床观察发现加味春泽汤是临床治疗脊髓损伤后尿潴留的有效方剂。动物实验发现磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路与膀胱功能障碍程度密切相关。目的:进一步验证加味春泽汤对脊髓损伤后尿潴留大鼠膀胱功能及PI3K/Akt通路的影响。方法:将60只SD雌性大鼠随机分为假手术组、模型组、加味春泽汤低剂量组、加味春泽汤高剂量组、激动剂组。假手术组大鼠暴露脊髓但不切断,其余各组大鼠采用改良后的Hassan Shaker脊髓横断法建立骶髓损伤大鼠模型。造模24 h后,假手术组和模型组大鼠给予等体积生理盐水灌胃,加味春泽汤低、高剂量组大鼠分别给予含有14.4 g/kg和28.8 g/kg的加味春泽汤颗粒剂,等体积灌胃4周,激动剂组大鼠给予PI3K/Akt信号通路激动剂740Y-P腹腔注射0.02 mg/kg治疗。治疗4周后采用尿流动力学检测各组大鼠膀胱最大容量、漏尿点压力、膀胱顺应性,膀胱离体逼尿肌条收缩性检测各组大鼠膀胱最小收缩张力、收缩频率,苏木精-伊红染色观察各组大鼠膀胱病理学改变,ELISA法检测各组大鼠血清中GRP78、CHOP、Caspase-12水平,RT-PCR、Western blot法检测大鼠膀胱组织PI3K、Akt、GRP78、CHOP、Caspase-12 mRNA及蛋白的表达。结果与结论:①与假手术组相比,模型组大鼠膀胱最大容量、膀胱顺应性、最小收缩张力升高(P<0.05),漏尿点压力、膀胱收缩频率降低(P<0.05);血清中GRP78、CHOP、Caspase-12水平升高(P<0.05);膀胱上皮细胞排列紊乱,细胞间存在单核细胞浸润,组织水肿,逼尿肌束萎缩;膀胱组织PI3K、Akt mRNA和蛋白表达降低,GRP78、CHOP、Caspase-12 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05)。②与模型组相比,加味春泽汤低、高剂量组及激动剂组干预4周后,大鼠膀胱最大容量、膀胱顺应性、最小收缩张力降低(P<0.05),漏尿点压力、膀胱收缩频率升高(P<0.05);血清中GRP78、CHOP、Caspase-12水平降低(P<0.05);膀胱上皮细胞分布较均匀,排列较整齐,炎细胞浸润较少,逼尿肌束较饱满;膀胱组织PI3K、Akt mRNA和蛋白表达增加,GRP78、CHOP、Caspase-12 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)。加味春泽汤高剂量组优于低剂量组,与激动剂组结果相似。③结果说明,加味春泽汤可以改善脊髓损伤后尿潴留大鼠膀胱功能,其作用机制可能与通过PI3K/Akt信号通路减轻膀胱组织内质网应激的发生,进而减轻凋亡有关。

CTCFL/RPS3A通过抑制内质网应激减少神经元细胞凋亡缓解阿尔兹海默症大鼠认知功能障碍实验研究

目的:探究RPS3A在阿尔兹海默症(AD)中的作用及其分子机制。方法:通过将Aβ注射到大鼠双侧海马区,构建AD模型。采用RPS3A的腺病毒载体(Ad-RPS3A)注射AD大鼠,饲养14 d后通过水迷宫测试评估大鼠的学习与记忆能力,通过Y迷宫测试评估大鼠的空间探索能力。此外,采用RPS3A的过表达载体(RPS3A)、shRNA(sh-RPS3A)、CTCFL的过表达载体(CTCFL)、shRNA(sh-CTCFL)分别转染神经元HT22细胞48 h,然后采用30μmol/L的Aβ处理细胞24 h。使用JASPAR预测CTCFL在RPS3A启动子的结合,并通过Ch-IP分析和荧光素酶报告基因分析进行验证。RT-qPCR检测过表达和沉默效率;Western blot检测RPS3A和CTCFL蛋白,以及内质网应激相关蛋白和凋亡相关蛋白表达水平;CCK-8和流式细胞术分别检测细胞活力和细胞凋亡率。结果:与假手术组相比,AD模型组大鼠海马组织中RPS3A的mRNA和蛋白水平显著下调。Aβ诱导的HT22细胞中RPS3A蛋白表达显著下调;过表达RPS3A促进HT22细胞增殖,抑制Aβ诱导的细胞凋亡,降低Cleaved caspase-3和Bax蛋白表达,促进Bcl-2蛋白表达,抑制内质网应激相关蛋白CRP78、CHOP、ATF6和XBP1表达,降低IRE1和PERK磷酸化水平。机制研究显示CTCFL通过与RPS3A启动子区结合,促进RPS3A转录激活。过表达CTCFL促进RPS3A蛋白表达;而沉默CTCFL作用相反。体内结果显示,过表达RPS3A降低AD大鼠抵达平台的时间、到达平台距离以及第一次进入SW区的时间,增加大鼠自发交替率和进入新异臂次数的比值,改善Aβ诱导的AD大鼠的学习与记忆能力障碍和空间探索能力障碍。结论:CTCFL介导的RPS3A通过内质网应激诱导神经元细胞凋亡,促进阿尔兹海默病小鼠的认知功能障碍。

缺血性视网膜损伤致细胞凋亡的内质网应激机制研究

目的分析缺血对视网膜神经节细胞(retinalganglioncells,RGCs)凋亡过程中内质网应激(endoplasmicreticulumstress,ERS)相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(glucoseregulatedprotein78,GRP78)、增强子结合蛋白同源蛋白(C/BEBPhomologousprotein,CHOP)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)-12表达的影响,探究缺血性视网膜损伤(ischemic retinal injury,IRI)致RGCs凋亡的分子水平发病机制,为预防和治疗IRI提供新的思路和方法。方法应用前房高眼压法制作大鼠右眼IRI模型。健康雄性SD大鼠40只,按照缺血时间的不同分为正常对照组、IRI30 min组、IRI60 min组以及IRI120 min组,每组各10只。应用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法观察不同分组中大鼠视网膜组织形态学变化;应用免疫组织化学(immunohistochemical,IHC)染色法观察不同分组中细胞凋亡相关因子B细胞原癌基因-2(B-cell lymphocyte/leukemia-2,Bcl-2)、Bcl-2关联X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)和Caspase-3的表达及定位情况;应用免疫荧光(immunofluorescence,IF)染色法观察不同分组中ERS相关蛋白GRP78、CHOP和Caspase-12的表达及定位情况。结果HE染色结果显示,与正常对照组相比,IRI各组可见视网膜水肿,视网膜内层厚度增加,视网膜细胞分布紊乱,RGCs数量减少,空泡组织增多。IHC染色结果显示,正常对照组视网膜中仅有少量Bax、Caspase-3蛋白表达,IRI各组中Bax、Caspase-3蛋白主要表达于神经节细胞层和内核层,与正常对照组相比,IRI各组视网膜中Bax、Caspase-3蛋白表达量明显增加,且IRI各组间差异也具有统计学意义。正常对照组视网膜神经节细胞层和内核层中可见大量Bcl-2蛋白表达,与正常对照组相比,IRI各组视网膜中Bcl-2蛋白表达量明显减少,且IRI各组间差异具有统计学意义。IF染色结果显示,正常对照组视网膜中GRP78、CHOP、Caspase-12阳性表达较少,与正常对照组相比,IRI各组视网膜神经节细胞层和内核层中GRP78、CHOP、Caspase-12阳性表达均显著增多,且差异有统计学意义。结论IRI可诱导视网膜发生细胞凋亡,其机制可能与ERS相关通路激活有关。

内质网应激在缺氧诱导子痫前期胎盘滋养细胞模型中调控凋亡的作用及机制

目的研究内质网应激(ERS)在体外缺氧诱导子痫前期(PE)滋养细胞模型中调控凋亡的作用及机制。方法收集PE胎盘和健康胎盘,检测细胞凋亡率及ERS标志基因:葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、ERS凋亡基因C/EBP同源蛋白(CHOP)、磷酸化JNK(p-JNK)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-12(Cleaved caspase-12)的表达水平。培养胎盘滋养细胞HTR8/SVneo,采用低氧(1%O_(2))处理24 h诱导PE细胞模型,采用ERS激动剂处理细胞,在PE细胞模型诱导过程中转染CHOP siRNA或给予JNK拮抗剂、Caspase-12抑制剂,检测细胞增殖水平(D值)、凋亡率及GRP78、CHOP、p-JNK、Cleaved caspase-12的表达水平。结果PE胎盘细胞凋亡率及GRP78、CHOP、p-JNK、Cleaved caspase-12的表达水平高于健康胎盘(P<0.05),且细胞凋亡率与GRP78、CHOP、p-JNK、Cleaved caspase-12的表达水平呈正相关;PE组及ERS激动剂组细胞的D值低于对照组,凋亡率及GRP78、CHOP、p-JNK、Cleaved caspase-12的表达水平高于对照组(P<0.05);缺氧诱导PE模型过程中转染CHOP siRNA降低CHOP表达,给予JNK拮抗剂降低p-JNK表达,给予Caspase-12抑制剂降低Cleaved caspase-12表达后,细胞D值升高,凋亡率及GRP78的表达水平降低(P<0.05)。结论缺氧诱导PE滋养细胞模型中ERS,通过CHOP、JNK和Caspase-12介导细胞凋亡。

白藜芦醇对高碘诱导的甲状腺滤泡细胞内质网应激和凋亡的影响

目的探讨白藜芦醇对高碘诱导的甲状腺滤泡细胞内质网应激和凋亡的影响。方法体外培养甲状腺滤泡细胞系Nthy-ori 3-1,根据不同培养方法分为正常培养组(Normal组)、高碘组(HI组)、白藜芦醇组(RES组)和高碘联合白藜芦醇组(HI+RES组)。采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性,采用TUNEL法检测各组细胞凋亡情况,采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测各组细胞BIP、CHOP、IRE1 mRNA表达,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测BIP、CHOP、IRE1蛋白表达。结果与Normal组相比,HI组细胞培养72 h后增殖活性下降,凋亡细胞占比升高,TUNEL染色阳性细胞占比升高,BIP、CHOP、IRE1 mRNA相对表达量升高,BIP、CHOP蛋白相对表达量升高,差异有统计学意义(P<0.001或P<0.05);与HI组相比,HI+RES组细胞培养72 h后增殖活性升高,凋亡细胞占比降低,TUNEL染色阳性细胞占比降低,BIP、CHOP mRNA相对表达量降低,BIP、CHOP蛋白相对表达量降低,差异有统计学意义(P<0.001或P<0.01)。结论白藜芦醇对高碘诱导的甲状腺滤泡细胞具有保护效应,可显著抑制碘过量摄入引起的内质网应激和细胞凋亡。

氟化钠通过氧化应激和内质网应激途径诱导PC12细胞凋亡

目的 探讨氟化钠对PC12细胞凋亡的影响及机制。方法 采用0,0.5,1,2,4 mmol/L浓度梯度的氟化钠培养基分别培养PC12细胞6,12,24,48 h。通过CCK-8法检测细胞活力,筛选构建氟中毒PC12细胞模型所需采用的氟化钠浓度和作用时间。将0,2,4 mmol/L氟化钠溶液培养24 h的PC12细胞进行AnnexinⅤ-FIFC/PI双染流式细胞术验证细胞凋亡状况;生化方法检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)以及丙二醛(MDA)的表达水平;RT-PCR及Western blot检测内质网应激标志物葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)的mRNA及蛋白表达水平。结果 0,2,4 mmol/L氟化钠分别作用PC12细胞24 h,细胞活力与氟化钠成剂量依赖性降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。显微镜下观察细胞形态和流式细胞术验证了细胞凋亡率与氟化钠浓度呈剂量依赖性增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。与0 mmol/L氟化钠相比,2,4 mmol/L氟化钠作用下细胞内SOD水平降低,而MDA的水平增加(均P<0.01);GRP78的mRNA及蛋白表达水平增加(P<0.05)。结论 氟化钠可通过细胞氧化应激及内质网应激介导细胞凋亡通路,诱导PC12细胞凋亡。