色素上皮源性因子、内质网氨基肽酶1和Sprouty1在银屑病皮损组织中的表达及相关性研究

目的研究银屑病皮损组织中色素上皮源性因子(PEDF)、表皮内质网氨基肽酶1(ERAP1)和Sprouty1的表达情况及相关性。方法收集河北省儿童医院皮肤科病理室2019年1月—2020年12月诊断的120例银屑病患者皮损组织蜡块标本进行研究,并纳入病例组;另外选取该院实验室保存的120例健康体检者的皮肤组织蜡块标本作为对照,纳入健康对照组。对比两组PEDF、ERAP1和Sprouty1的表达差异,单因素分析银屑病患者不同病情严重程度的PEDF、ERAP1和Sprouty1表达差异,分析PEDF、ERAP1和Sprouty1与银屑病患者皮损严重程度的相关性。结果①与健康对照组相比,病例组的PEDF、ERAP1 mRNA和蛋白均呈高表达,Sprouty1 mRNA和蛋白均呈低表达(P<0.05);②重度银屑病患者皮损的PEDF、ERAP1表达明显高于轻中度患者,Sprouty1表达明显低于轻中度患者(P<0.05);③PEDF、ERAP1的表达均与银屑病皮损面积严重度指数(PASI)评分呈正相关,Sprouty1的表达与PASI评分呈负相关。结论银屑病患者皮损组织中PEDF、ERAP1和Sprouty1的表达与正常组织存在明显差异,PEDF、ERAP1和Sprouty1的表达均与银屑病皮损组织严重程度存在密切关系。在银屑病患者治疗以及诊断中可将PEDF、ERAP1和Sprouty1作为新的研究方向进行深入探索。

羊骨粉碱性蛋白酶水解各指标的相关性分析

水解可大幅提高羊骨的营养价值和生物活性,水解程度越高,生物利用度越高,其抗氧化、促免疫等活性亦越强。本研究以碱性蛋白酶水解羊骨粉,探讨反映水解程度的水解度、短肽得率、氨基态氮含量、多肽生成量4个指标间的相关性,为水解效果评价提供最优指标。结果表明,单因素试验过程中,除温度外,各指标达到最大值时均具有相同的底物浓度(8%)、酶添加量(4%)、酶解时间(4h)和起始pH值(9),4个指标中,多肽生成量受各因素影响最大。相关性分析结果表明各指标之间均呈显著相关(P<0.01),与水解度的相关性(r值)依次为短肽得率(0.981)、氨基酸态氮(0.801)、多肽生成量(0.641),因此在优化羊骨酶解工艺时,水解度和短肽得率为优选指标,胶原肽经进一步分离纯化或直接干燥后,可广泛应用于饲料、食品、医药、化妆品等领域。

右美托咪定对呼吸机相关性肺损伤大鼠肺组织内质网应激的影响及PI3K/Akt 信号通路的关系

目的探讨右美托咪定(DEX)对大鼠呼吸机相关性肺损伤(ventilator associated lung injury,VALI)时内质网应激(ERS)诱导的细胞凋亡及磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路的影响。方法将80只SD大鼠采用随机数字表法分为四组(n=20):对照组(C组)、机械通气组(V组)、右美托咪定组(D组)和右美托咪定+PI3K/Akt信号转导通路抑制剂(LY294002)组(DL组)。C组不行机械通气,自主呼吸空气;V组、D组、DL组机械通气4h,机械通气前20minD组静脉输注右美托咪定5.0μg/kg,机械通气期间以5.0μg/(kg·h)的速率静脉输注;DL组在给予右美托咪定前5min静脉输注LY2940020.3mg/kg;V组给予等容量生理盐水。机械通气4h时处死大鼠,测定肺通透指数(LPI)与肺湿/干质量(W/D)比值。采用蛋白质印迹(Westernblot)法检测Akt、磷酸化Akt(P-Akt)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(caspase-12)的表达水平。光镜下观察肺组织病理学结果,测定肺泡损伤率(IAR),采用原位末端标记技术(TUNEL)法观察肺组织细胞凋亡情况并计算凋亡指数(AI)。结果与C组比较,V组与DL组W/D比、LPI、IAR(%)、AI(%)明显升高,GRP78、CHOP、caspase-12表达升高(C组:0.35±0.02、0.28±0.02、0.51±0.03;V组:1.27±0.11、1.09±0.13、1.37±0.15;DL组:0.97±0.08、0.66±0.07、1.01±0.09;P<0.05),P-Akt表达降低(C组:0.81±0.04;V组:0.23±0.01;DL组:0.44±0.02;P<0.05);与V组比较,DL组与D组W/D比、LPI、IAR(%)、AI(%)明显降低,GRP78、CHOP、caspase-12表达降低(V组:1.27±0.11、1.09±0.13、1.37±0.15;DL组:0.97±0.08、0.66±0.07、1.01±0.09;D组:0.62±0.04、0.43±0.05、0.79±0.07;P<0.05),P-Akt表达升高(V组:0.23±0.01;DL组:0.44±0.02;D组:0.65±0.03;P<0.05)且肺组织病理损伤减轻;与D组比较,DL组W/D比、LPI、IAR(%)、AI(%)明显升高,GRP78、CHOP、caspase-12表达升高(D组:0.62±0.04、0.43±0.05、0.79±0.07;DL组:0.97±0.08、0.66±0.07、1.01±0.09;P<0.05),P-Akt表达降低(D组:0.65±0.03;DL组:0.44±0.02;P<0.05),肺组织病理损伤较重。结论右美托咪定可减轻大鼠VALI,与其激活PI3K/Akt信号通路,抑制ERS,减少肺组织细胞凋亡有关。

内质网应激在年龄相关性黄斑变性中的研究进展

年龄相关性黄斑变性(ARMD)是老年人不可逆视力损害的主要原因,以黄斑区玻璃膜疣的形成、色素紊乱、地图样萎缩、脉络膜新生血管形成为主要病理特征,视网膜色素上皮(RPE)细胞功能失调与ARMD关系密切。内质网是真核生物一个特殊的细胞器,主要负责蛋白的合成、修饰、整合和质量控制,并参与Ca^(2+)稳态维持和脂质的生物合成。细胞内外环境的变化,导致内质网应激,激活细胞内的信号转导通路——未折叠蛋白反应,以恢复细胞功能和维持细胞内环境稳态。但长期强烈的内质网应激可能导致内质网动态平衡难以恢复,而触发细胞凋亡。ARMD的发病机制尚未完全阐明,但大量研究证明内质网应激与其相关。本文就内质网应激的信号转导通路、内质网应激在RPE中的生理作用及内质网应激可能介导ARMD的机制作一综述。

老年急性脑梗死患者血清胶质纤维酸性蛋白、泛素羧基末端水解酶L1水平与卒中量表评分的相关性分析

目的:分析老年急性脑梗死患者血清胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)水平与美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分的相关性。方法:回顾性收集洛阳市第三人民医院2019年1月—2020年1月收治的83例老年急性脑梗死患者临床资料,将轻度神经功能缺损37例患者资料作为轻度组,将中度神经功能缺损31例患者资料作为中度组,将重度神经功能缺损15例患者资料作为重度组。比较三组血清GFAP、UCH-L1水平、NIHSS评分,并分析血清血清GFAP、UCH-L1水平与NIHSS评分相关性。结果:三组中重度组GFAP、UCH-L1水平、NIHSS评分最高,其次中度组,轻度组各指标最低,差异有统计学意义(P<0.05);经双变量Pearson相关性检验分析得知,血清GFAP、UCH-L1水平与NIHSS评分均呈正相关(r>0,P<0.05),提示血清GFAP、UCH-L1水平越高,老年急性脑梗死患者NIHSS评分越高。结论:老年急性脑梗死患者血清GFAP、UCH-L1水平与NIHSS评分均呈正相关,临床需定期检测患者GFAP、UCH-L1水平,以评估神经功能缺损情况,指导临床治疗。

热休克蛋白5调控内质网应激在视网膜色素上皮细胞保护中的作用

目的探讨相对分子质量70 000的热休克蛋白5(heat shock 70 kDa protein 5,HSPA5)调控内质网应激在N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(N-retinylidene-N-retinylethanolamine,A2E)联合蓝光诱导视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞损伤对RPE细胞的保护作用。方法建立A2E联合蓝光诱导RPE细胞损伤模型,显微镜下观察RPE细胞对A2E的摄取。在RPE细胞损伤后3 h、6 h、12 h、24 h和48 h,运用CCK-8法检测RPE细胞活力;Western blot检测RPE细胞内质网应激相关蛋白HSPA5和CHOP的表达情况。构建HSPA5 shRNA慢病毒载体抑制RPE细胞中HSPA5的表达,实验分3组,HSPA5干扰组转染了HSPA5干扰序列,阴性干扰组转染了阴性对照序列,野生型组为未转染的RPE细胞。检测在RPE细胞损伤时,干扰HSPA5对内质网应激相关凋亡分子CHOP、Caspase-12表达以及RPE细胞活力的影响。结果细胞活力检测结果显示,A2E联合蓝光照射后3 h、6 h、12 h、24 h和48 h,RPE细胞活力分别是对照组的(80.9±6.2)%、(73.3±5.8)%、(70.6±5.4)%、(62.3±6.1)%和(51.4±4.5)%,与对照组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。Western blot检测结果显示,HSPA5和CHOP蛋白表达在RPE细胞损伤后均有不同程度增高(P<0.05)。在A2E联合蓝光处理后12 h,HSPA5干扰组的CHOP和Caspase-12蛋白表达较对照组显著升高,并且RPE细胞活力明显下降(均为P<0.05)。结论 A2E联合蓝光可诱导RPE细胞发生损伤,损伤机制与内质网应激相关。HSPA5具有调控内质网应激,减轻A2E及蓝光损伤,促进RPE细胞存活的作用。

基于网络药理学探讨缺血性脑卒中内质网应激机制及脑蛋白水解物的脑保护作用

目的 基于网络药理学方法和动物实验初步研究脑蛋白水解物的脑保护作用及其调控缺血性脑卒中内质网应激的相关作用机制。方法 利用GeneCards和OMIM数据库筛选出缺血性脑卒中和内质网应激相关靶点,绘制韦恩图,得到两者交集基因,利用String数据库下载蛋白质-蛋白质相互作用网络图,通过Cytoscape软件进行可视化分析,并利用cytoHubba插件筛选出前10位基因,最后进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。采用线栓法制备小鼠缺血性脑卒中模型,随机分为假手术组,模型组,脑蛋白水解物0.2 g·kg^(-1)组、0.5 g·kg^(-1)组和依达拉奉8 mg·kg^(-1)组,每组11只。术后连续给药5 d。TTC染色测定脑梗死体积,ELISA法测定脑缺血半暗带和血清中白细胞介素(IL)-6、IL-1β、γ-干扰素(IFN-γ)和脑源性神经营养因子(BDNF)的含量,免疫组化法观察脑组织中Caspase-3和AKT蛋白的表达变化。结果 网络药理学结果筛选得到41个缺血性脑卒中和内质网应激的交集基因,筛选出排前10的基因分别是IL-6、ALB、INS、TNF、AKT1、CASP3、MAPK3、TP53、SIRT1和VEGFA。GO富集得到515个相关条目,KEGG通路富集涉及脂质和动脉粥样硬化通路、人巨细胞病毒感染、阿尔茨海默病、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路等。与模型组比较,脑蛋白水解物2个给药组小鼠的脑梗死体积明显减小(P<0.01),小鼠血清和半暗带中IL-6、IL-1β和IFN-γ含量显著降低、BDNF显著增加(P<0.05),脑组织中Caspase-3表达显著降低、AKT表达显著增强(P<0.05)。结论 基于网络药理学分析,缺血性脑卒中的内质网应激机制可能与炎症和凋亡相关,脑蛋白水解物的神经保护机制可能与激活BDNF/PI3K/AKT通路及抑制炎症和细胞凋亡有关。

血浆可溶性环氧化物水解酶与脑梗死的相关性研究

目的探讨血浆可溶性环氧化物水解酶与脑梗死的相关性研究。方法选取2020年1—10月在医院接受治疗的脑梗死患者120例,作为研究组,患者年龄28~76岁,平均年龄(51.19±2.12)岁,男性患者65例,女性患者55例,血浆可溶性环氧化物水解酶采用ELISA检测试剂盒;并与120名健康体检者作为对照组,男性64名,女性56名,年龄28~77岁,平均年龄(51.32±4.43岁),血浆可溶性环氧化物水解酶采用ELISA检测试剂盒。结果研究组患者的高密度脂蛋白异常者(64例,53.33%)与对照组高密度脂蛋白异常者(15例,12.50%)相比较差异有统计学意义(P<0.05);研究组低密度脂蛋白异常者(72例,60.00%)显著高于对照组低密度脂蛋白异常者(20例,16.67%),差异有统计学意义(P<0.05)。研究组sEH水平(141.53±2.45)ng/mL显著高于对照组sEH水平(0.19±0.01)ng/mL,差异有统计学意义(P<0.05)。sEH与高密度脂蛋白呈负相关(r=-0.525),sEH与低密度脂蛋白异常呈现正相关。结论血浆可溶性环氧化物水解酶与脑梗死患者低密度脂蛋白异常呈现正相关,该指标水平能够提示该类患者疾病的进展,可能在血管重塑发挥重要作用。

内质网应激反应分子机理研究进展

内质网应激是导致心脑组织缺血梗塞、神经退行性疾病等发生的重要环节 .目前发现同型半胱氨酸、氧化应激、钙代谢紊乱等都能引起内质网应激级联反应 ,表现为蛋白质合成暂停、内质网应激蛋白表达和细胞凋亡等 .这些表现包括在未折叠蛋白反应 (UPR)、整合应激反应 (ISR)和内质网相关性死亡 (ERAD)三个相互关联的动态过程中 ,每一过程的分子机理现已逐步被揭示 .作为细胞保护性应对机制的内质网应激体系一旦遭到破坏 ,细胞将不能合成应有的蛋白质 ,亦不能发挥正常的生理功能 ,甚至会出现细胞凋亡 .

超声优化水解胶原蛋白粒径对合成施胶剂性能影响

利用超声波细胞粉碎机对水解胶原蛋白进行预处理,通过FT-IR、XRD、TG等手段测定超声波处理前后胶原蛋白结构的变化,结果表明,超声波处理并不改变胶原蛋白的结构。利用纳米粒度仪测定超声波处理时间和处理功率对胶原蛋白粒径的影响,以及超声波处理前后胶原蛋白的粒径分布,实验结果表明,超声波处理时间和功率在一定的范围内的确可以改变胶原蛋白的粒径,超过范围后则影响较小;超声波处理过程中,胶原蛋白大分子逐渐变为小分子,小分子通过氢键与大分子结合。利用处理过的胶原蛋白合成施胶剂,然后对瓦楞原纸进行表面施胶,通过考察施胶后纸张的性能,得到合成施胶剂的粒径与施胶后纸张的性能呈现相关性。

Survivin shRNA-APC双基因对结肠癌裸鼠皮下移植瘤细胞内质网通路中GRP78、Caspase-12 表达的影响

目的探讨细胞增殖因子短截型核糖核酸-腺瘤样结肠息肉基因(Survivin shRNA-APC)双基因对内质网应激凋亡通路中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-12(Caspase-12)表达的影响。方法将40只健康裸鼠随机分成5组(每组8只):SurvivinshRNA-APC双基因组(简称双基因组)、APC组、Survivin shRNA组、空载组和空白组。将前期构建好的Survivin shRNA-APC、APC、Survivin shRNA、空载稳转株及人HT-29结肠癌细胞分别接种至对应组裸鼠的左前腋下,采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-timePCR)及免疫组化方法分别检测5组移植瘤组织细胞中GRP78、Caspase-12mRNA及蛋白的表达情况。结果与空白组、空载组比较,双基因组、APC组、SurvivinshRNA组GRP78.Caspase-12mRNA及蛋白的表达明显增强(P<0.05),与APC组和Survivin shRNA组比较,双基因组增加更显著(P<0.05),空载组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论Survivin shRNA-APC双基因可能通过抑制Survivin表达,上调内质网通路中GRP78、Caspase-12mRNA及蛋白表达,最终诱导结肠癌细胞发生凋亡,且Survivin shRNA-APC双基因调控GRP78、Caspase-12mRNA及蛋白表达、诱导细胞凋亡能力较APC组和Survivin shRNA组强。

肾小管上皮细胞内质网应激时NGAL表达改变的调控机制研究

目的:探讨人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)发生内质网应激时,NGAL表达增加的上游调控机制。方法:将HK-2细胞分为对照组(正常HK-2细胞),TG(毒胡萝卜素,thapsigargin)组(5μmol/L TG处理8 h),单纯转染组(siRNAATF4试剂转染24 h),转染+TG组(siRNA-ATF4试剂转染24 h后,5μmol/L TG处理8 h),阴性对照组(siRNA-阴性对照物转染24 h),DMSO组(5μmol/L DMSO处理8 h)。采用Western blot检测各组细胞内质网源性转录因子(CHOP)、内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、中性粒细胞明胶酶相关性载脂蛋白(NGAL)、激活转录因子4(ATF4)的表达,采用Real-time PCR方法测得ATF4mRNA、NGALmRNA表达量。结果:与对照组相比,TG组细胞NGAL、ATF4、ATF4mRNA、NGALmRNA表达量显著提高(P <0. 05),而转染+TG组、单纯转染组、阴性对照组、DMSO组中ATF4及NGAL差异无统计学意义(P> 0. 05)。与TG组相比,转染+TG组ATF4、NGAL、ATF4mRNA及NGALmRNA表达量呈显著降低趋势(P <0. 05)。在TG组与转染+TG组细胞中,CHOP和GRP78呈过表达状态(P <0. 05),而转染+TG组细胞CHOP和GRP78提升趋势明显低于TG组细胞(P <0. 05)。结论:(1) TG可诱导人肾小管上皮HK-2细胞发生内质网应激反应。(2) HK-2细胞发生内质网应激反应时,抑制ATF4表达会引起NGAL降低,提示ATF4是NGAL表达的上游调控因子。(3) HK-2细胞发生内质网应激反应时,抑制ATF4不能阻止CHOP和GRP78发生过表达,但可降低其升高程度,提示ATF4及NGAL降低可能对内质网应激反应介导HK-2细胞损伤起到一定的缓解作用。

不同水解度的大豆分离蛋白结构与功能性关系探究

利用碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白(soybean protein isolated,SPI),并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、快速粘度分析仪(rapid viscosity analyzer,RVA)技术对不同水解度(hydrolyzing degree,DH)下的SPI的结构与粘度进行分析,并对SPI的DH与其粘度、溶解性、持水性关系进行相关性分析。结果表明:随着DH的增大,SPI被逐渐水解形成更多的低分子量多肽,且A亚基和B亚基附近的低分子蛋白条带逐渐减少。随着DH的增大,持水性逐渐降低,由2.85降低至2.2(P<0.05);且溶解性显著性增加,由(41.33±1.18)%升高至(61.25±0.96)%(P<0.05);RVA测定的最终粘度值也显著性降低,粘度由1 945 cp降低至545 cp;DH与RVA粘度值、持水性之间都呈显著负相关,与溶解度之间呈现正相关关系。

槲皮素预处理高糖环境培养的人脐静脉内皮细胞氧化应激、内质网应激反应观察

目的观察不同浓度槲皮素预处理后高糖培养条件培养的人脐静脉内皮细胞、氧化应激、内质网应激情况,并探讨其可能作用机制。方法体外培养内皮细胞,分为槲皮素组(Q20组、Q50组及Q100组)、高糖组(HG组)及正常对照组(Control组),Q20组预先加入20μmol/L的槲皮素预处理1 h,再加入10 mg/L的葡萄糖培养细胞,Q50组预先加入50μmol/L的槲皮素预处理1 h,再加入10 mg/L的葡萄糖培养细胞,Q100组预先加入100μmol/L的槲皮素预处理1 h,再加入10 mg/L的葡萄糖培养细胞。HG组在培养液中加入10 mg/L的HG培养细胞,Control组采用低糖DMEM培养基培养。干预24 h时采用CCK-8法观察各组细胞活性;培养24 h时采用流式细胞术测算内皮细胞凋亡率及细胞活性氧簇(ROS)含量,采用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定内皮细胞细胞培养液中LDH活性,采用WesternBlotting法检测各组内皮细胞内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶12(Caspase 12)。结果与Control组比较,培养24 h时HG组内皮细胞活性下降(P<0.05);与HG组比较,Q20组、Q50组及Q100组内皮细胞活性增加(P均<0.05),且随浓度增加,细胞活性上升(P均<0.05)。与Control组比较,培养24 h时HG组细胞凋亡率增加(P<0.05);与HG组比较,培养24 h时Q20组、Q50组及Q100组细胞凋亡率降低,且随槲皮素浓度增加,细胞凋亡率下降(P均<0.05)。与Control组比较,培养24 h时HG组细胞ROS含量升高(P<0.05);与HG组比较,Q20组、Q50组及Q100组细胞ROS含量降低,且随槲皮素浓度增加,ROS含量降低(P均<0.05)。与Control组比较,培养24 h时HG组细胞培养液中LDH活性升高(P<0.05);与HG组比较,Q50组及Q100组细胞培养液中LDH活性降低(P均<0.05);与Q50组比较,Q100组细胞培养液中LDH活性降低(P均<0.05)。与Control组比较,培养24 h时HG组内皮细胞GRP78、CHOP、Caspase 12表达升高(P均<0.01);与HG组比较,Q20组、Q50组及Q100组内皮细胞GRP78、CHOP、Caspase 12表达量降低(P均<0.01)。结论槲皮素预处理能提高高糖培养液中的内皮细胞活性,降低细胞培养液中LDH活性,抑制细胞凋亡,降低ROS含量,抑制细胞GRP78、CHOP及Caspase 12表达,且随着浓度的增加,其抑制作用增强。槲皮素可能通过抑制高糖条件下内皮细胞的氧化应激和内质网应激反应,抑制内皮细胞的凋亡,发挥内皮细胞保护作用。

Calnexin/Calreticulin循环与糖蛋白内质网相关性降解

Calnexin/Calreticulin循环与糖蛋白内质网相关性降解 (GERAD)是真核细胞内负责糖蛋白折叠质量的重要监控机制 ,监督糖蛋白在内质网中空间构象的正确折叠 ,促进未完全折叠糖蛋白再折叠 ,错误折叠糖蛋白经GERAD途径被降解。内质网应激引起内质网功能障碍时 ,Calnexin/Calreticulin循环和 (或 )GERAD发生异常 ,错误折叠的糖蛋白在内质网堆积导致细胞功能障碍和某些疾病的发生。错误折叠糖蛋白从Calnexin/Calreticulin循环释放到GERAD一系列途径的分子机理现已逐渐明了 ,了解糖蛋白Calnexin/Calreticulin循环与内质网相关性降解过程对进一步设计针对病毒性肝炎、帕金森病等疾病的治疗方案有重要的指导意义。

转录因子X盒结合蛋白1参与视网膜色素上皮抗氧化防御机制

【目的】视网膜色素上皮(RPE)的氧化损伤在年龄相关性黄斑变性(ARMD)的发病机制中起着核心作用。本研究旨在探讨内质网应激及其重要的转录因子X盒结合蛋白1(XBP1)在丙烯醛引起的RPE氧化损伤中起到的作用,从而为阐明ARMD的发病机制提供思路。【方法】用75μmol/L丙烯醛分别处理人视网膜色素上皮细胞系(ARPE-19)2~24 h,观察内质网应激蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)及XBP1的表达。用XBP1 si RNA转染细胞,下调XBP1蛋白水平,用Western blot检测抗氧化基因Nrf2、SOD2在蛋白水平的表达;用DCF染色观察细胞活性氧产物(ROS)的产生;用TUNEL染色观察细胞凋亡改变。细胞用XBP1 si RNA或对照si RNA预处理后,加入丙烯醛,检测RPE细胞的凋亡情况。7只XBP1^(flox/flox)小鼠,一眼视网膜下注射Cre腺病毒,对侧眼视网膜下注射GFP腺病毒作对照。1周后取眼球。其中3只小鼠用TRIzol提取RPE的RNA,用实时RT-PCR法,检测XBP1的下游基因ERdj4和p58IPK在RNA水平的表达。另4只小鼠眼球作视网膜冰冻切片,观察腺病毒在视网膜下腔的表达,用免疫荧光染色法检测XBP1以及抗氧化基因Nrf2和SOD2在RPE的表达。【结果】丙烯醛分别处理RPE细胞2 h和4 h,GRP78的表达明显增加。处理6 h XBP1蛋白激活。XBP1表达的下调伴有抗氧化基因Nrf2和SOD2表达的减少,细胞内ROS的增加,并诱发细胞的凋亡。敲低XBP1以后丙烯醛对细胞的毒性作用明显增加。通过视网膜下注射Cre腺病毒成功转染XBP1^(flox/flox)小鼠RPE。与对照组相比,转染Cre腺病毒的小鼠RPE内的XBP1蛋白表达明显减少,RPE内的ERdj4和p58IPK RNA水平显著下调;抗氧化基因Nrf2和SOD2表达明显减少。【结论】丙烯醛作用于RPE细胞,激活内质网应激以及转录因子XBP1。抑制XBP1引起RPE内抗氧化基因表达的减少,ROS的产生增加,并且增加丙烯醛的细胞毒性。XBP1参与RPE细胞内抗氧化应激防御机制。

模拟酶解大豆7S、11S蛋白及其抗氧化活性的研究

以"活性肽搜寻与蛋白模拟水解系统"为工具,选择碱性蛋白酶和中性蛋白酶对大豆7S、11S蛋白进行模拟水解,得到不同水平的抗氧化肽肽段,以重均分子量为手段,评价理论模拟与实验水解的相关性;以还原力、清除二苯代苦味酰基苯肼(DPPH·)自由基能力比较以上蛋白酶水解物的抗氧化活性。结果表明:模拟与实验水解得到的分子量分布在比例以及重均分子量方面有显著相关性(P<0·01);四种酶解产物均具有一定的抗氧化活性,其中,以7S蛋白的碱性蛋白酶产物表现出最高的还原力和DPPH·清除能力(P<0·05)。

周期性张应力作用下软骨细胞半胱氨酸蛋白酶12的表达规律

背景:过度力学刺激可引起细胞内质网应激,内质网应激在退行性疾病的发生发展过程中扮演重要角色,半胱氨酸蛋白酶12是内质网应激的特异性分子,内质网应激的强弱程度可由半胱氨酸蛋白酶12表达水平来体现。目的:观察周期性张应力作用下软骨细胞半胱氨酸蛋白酶12的表达规律。方法:以人软骨细胞为实验对象,对实验细胞成功分组后,运用细胞牵张力学加载系统,将加力组及其配对的相应Z-ATAD-FMK抑制剂组分别给予2,12,24,36,48 h的力学刺激条件,空白组(0 h)及其配对的Z-ATAD-FMK抑制剂组除不加力外培养条件和加力组完全相同。规定加力时间终止后,显微镜下观察细胞形态变化及生长状态,随即采用RT-PCR和Western blot检测各组半胱氨酸蛋白酶12基因和蛋白表达变化规律。结果与结论:(1)细胞形态学观察结果显示,从加力2 h开始,细胞出现凋亡,到24 h此现象最明显,随着加力时间延长,细胞出现顺应力生长趋势,但细胞凋亡现象减弱。说明周期张应力可以使软骨细胞凋亡,内质网应激可能被激活,细胞体外受力模型建立成功;(2)半胱氨酸蛋白酶12基因与蛋白随时间延长表达趋势一致,加力24 h表达量达高峰,与空白和抑制剂组相比,差异均有显著性意义(P<0.05);(3)以此得出,周期性张应力可引起软骨细胞内质网应激,并影响半胱氨酸蛋白酶12表达。

内质网相关性降解与呼吸系统疾病

内质网相关性降解（ERAD）通过清除内质网腔内的错误折叠蛋白质，从而预防和缓解内质网应激，是真核生物蛋白质质量控制和维持细胞正常功能状态的重要机制。ERAD包含底物（即错误折叠蛋白）识别、底物泛素化与逆转运、底物降解三个基本环节，其中任何一个环节失调都会导致细胞功能障碍，并可能进一步导致疾病的发生与发展。近几年研究发现，ERAD参与了COPD、肺癌、肺囊性纤维化等疾病发生过程。本文就参与ERAD的相关因子的研究进展进行综述。