含EMC6基因重组真核表达载体的构建及其在人肝L-02细胞中的异位表达

目的:构建pcDNA3.1(+)/EMC6真核表达载体,并将其在人肝L-02细胞株中过表达。方法:查询Pub Med上EMC6的基因序列,针对该序列设计引物,提取L-02细胞的总RNA、聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段,采用基因重组技术将EMC6的cDNA定向插入真核表达载体pcDNA3.1中,构建pcDNA3.1(+)/EMC6真核表达载体,经菌落PCR,测序验证构建的准确性。应用脂质体转染方法将重组载体转入L-02细胞中,RT-PCR、蛋白质印迹法检测EMC6基因的mRNA和蛋白表达水平。结果:PCR和基因测序结果均表明pcDNA3.1(+)/EMC6重组质粒构建成功,RT-PCR和蛋白质印迹检测结果证实EMC6在人肝L-02细胞中过表达。结论:成功构建人pcDNA3.1(+)/EMC6重组质粒,并在L-02细胞中过表达。

内质膜蛋白复合体亚基6对海拉细胞自噬的调控作用

目的 探讨内质膜蛋白复合体亚基6（EMC6）基因在海拉（HeLa）细胞中的自噬调解活动。 方法 （1）构建3种质粒：EMC6真核表达质粒、特异性干扰EMC6质粒、空白质粒。分别将3种质粒转染HeLa细胞，筛选3组中的稳定表达细胞株。（2）用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）、Western blot检测3组质粒转染后Hela细胞中EMC6 mRNA表达结果。（3）电镜下观察HeLa细胞内自噬体；用自噬抑制剂Bafilomycin A1和3-甲基腺嘌呤（3-MA）分别作用于转染EMC6质粒的处理组、空白质粒组和HeLa组，在共焦显微镜下观察比较细胞株中绿色荧光蛋白（GFP）-微管相关蛋白1轻链3（LC3）的变化。 结果 （1）Real-time PCR法检测转染不同质粒进入HeLa细胞株后，处理组、干扰组及空白质粒组各5例，2－ΔΔCt的平均值分别为3.29±0.62、0.38±0.04、1.11±0.20，EMC6 mRNA拷贝数量在3组之间差异有统计学意义（P＝0.020）。（2）在转染了EMC6质粒的HeLa细胞组中可观察到自噬体形成，并观察到Bafilomycin A1作用于3组细胞后，可见GFP-LC3斑点聚集，而EMC6过表达组的LC3斑点明显较空白质粒组及HeLa组丰富。 结论 过表达EMC6蛋白可使HeLa细胞内自噬体数目增加，可能使宫颈癌细胞内自噬活动增强；EMC6过表达细胞株中，磷酸肌醇3激酶（PI3K）抑制剂抑制了EMC6所诱发的自噬过程。