内质网蛋白驻留受体2蛋白对胰腺癌恶性生长的影响及机制研究

目的:探讨赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(KDEL)内质网蛋白驻留受体2(endoplasmic reticulum protein retention receptor 2,KDELR2)对胰腺癌细胞恶性生长的影响,并初步探究相关作用分子机制。方法:通过癌症基因组学数据分析平台(UCSC XENA)分析KDELR2 mRNA在泛癌和人胰腺癌组织中的表达水平;通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)分析其表达水平与胰腺癌患者临床病理特征及生存预后的关系;采用基因本体功能富集分析(Gene Ontology, GO)、京都基因和基因组数据库富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)探索KDELR2相关差异表达基因参与调节的信号通路;通过ssGSEA算法分析KDELR2免疫浸润情况。应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹实验检测不同胰腺癌细胞系(BXPC-3、MIA PaCa-2、PANC-1、PaTu 8988-T)以及正常人胰腺导管上皮细胞(HPNE)中KDELR2的mRNA和蛋白表达水平,并检测人胰腺癌组织及对应癌旁组织中KDELR2的蛋白表达水平。通过慢病毒转染构建KDELR2过表达和敲减的稳转细胞株(PaTu 8988-T和PANC-1)及其对照空载体细胞株(“KDELR2-OE”和“Vec”、“shKDELR2-S1/S2”和“shNC”),利用CCK8、EdU、Transwell、细胞克隆形成实验观察KDELR2过表达及敲低后稳转细胞株的生物学行为变化;使用JC-1、MitoSOX和DCFH-DA染色实验以及检测ATP水平观察PaTu 8988-T和PANC-1细胞KDELR2敲低后的线粒体功能。通过构建裸鼠皮下荷瘤模型观察KDELR2敲低对胰腺癌PANC-1细胞在体生长的影响。结果:KDELR2在人胰腺癌组织及细胞中显著高表达,其高表达水平与胰腺癌患者的病理特征及不良预后密切相关。GO功能和KEGG富集分析表明,KDELR2可能通过调控细胞能量代谢调节胰腺癌细胞生长。敲低KDELR2显著抑制胰腺癌细胞的增殖和迁移能力,过表达KDELR2显著促进胰腺癌细胞的增殖和迁移能力;KDELR2敲低后,胰腺癌细胞线粒体膜电位明显下降,活性氧水平明显升高,ATP水平明显降低(P均<0.05)。裸鼠皮下荷瘤模型证实KDELR2敲低显著抑制胰腺癌细胞的在体生长。结论:KDELR2在胰腺癌中显著高表达且与患者不良预后密切相关,KDELR2可能参与调控线粒体的功能影响癌细胞能量代谢。

腺苷A2a受体激动剂对脓毒症急性肾损伤中内质网应激的调节作用

目的:探究腺苷A2a受体激动剂对脓毒症诱导急性肾损伤(AKI)模型大鼠内质网应激(ERS)途径及单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)表达的影响。方法:实验分为4组,包括对照组、腺苷A2a受体激动剂(CGS21680)组、模型(AKI)组、腺苷A2a受体激动剂干预(CGS21680+AKI)组,每组10只SD大鼠,CGS21680组和CGS21680+AKI组腹腔注射CGS21680,接着将除对照组外的其余3组大鼠均制备AKI模型。1周后,全自动生化仪检测血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平,酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清肾损伤分子-1(KIM-1)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)水平,苏木精-伊红(HE)染色和过碘酸雪夫(PAS)染色观察肾组织病理形态学变化情况,TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色观察肾组织内细胞凋亡情况,免疫组化染色检测肾组织内CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和葡萄糖调节蛋白78(GRP78),蛋白质免疫印迹(Western blot)法测定肾组织X-盒-结合蛋白-1(XBP1)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、真核起始转录因子2α亚基(eIF2α)及磷酸化真核细胞起始因子2α(p-eIF2α)表达水平,免疫组化染色检测肾组织内MCP-1阳性表达情况,Western blot法测定肾组织中MCP-1蛋白表达水平。结果:与对照组比较,AKI组大鼠SCr、BUN、KIM-1、NGAL水平升高(P<0.05),肾组织内可见肾小管扩张、变性及肾小球水肿等病理损伤现象,TUNEL阳性率增加(P<0.05),GRP78、CHOP阳性表达比例升高(P<0.05),肾组织内XBP1、PERK蛋白相对表达量及eIF2α/p-eIF2α比值均上调(P<0.05),MCP-1阳性表达比例与蛋白相对表达量也升高、上调(P<0.05)。与AKI组比较,CGS21680+AKI组大鼠SCr、BUN、KIM-1、NGAL水平降低(P<0.05),肾组织病理损伤情况明显改善,TUNEL阳性率减少(P<0.05),GRP78、CHOP阳性表达比例降低(P<0.05),肾组织内XBP1、PERK蛋白相对表达量及eIF2α/p-eIF2α比值均下调(P<0.05),同时,MCP-1阳性表达比例与蛋白相对表达量也降低、下调(P<0.05)。结论:腺苷A2a受体激动剂能够减轻AKI大鼠急性肾损伤,这可能与其缓解内质网应激,抑制MCP-1水平有关。

钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ和兰尼碱受体2与内质网钙渗漏关系的研究进展

内质网是人体Ca2＋中转站,是钙循环的重要调节中心.内质网通过调节心肌细胞内游离Ca2＋的浓度来控制心肌的收缩和舒张.心肌细胞膜上L型Ca2＋通道开放,形成内向Ca2＋流激活肌浆网Ca2＋释放通道,使得大量Ca2＋进入细胞质.当细胞质内游离Ca2浓度达10-5mmol/L时,肌钙蛋白被激活,使肌球蛋白和肌动蛋白相互接触,引起心肌收缩.心肌收缩后内质网钙泵又将细胞内游离Ca2＋重新泵回内质网中储存.当细胞质内游离Ca2＋浓度降低至10-7mmol/L时,肌球蛋白和肌动蛋白分离,引起心肌舒张,这样就形成一个完整的心脏收缩-舒张过程.任何原因导致的内质网Ca2＋渗漏,都会引起Ca2＋调节异常,使得心肌细胞收缩、舒张功能障碍,最终引起心力衰竭和心律失常等疾病的发生.钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）是细胞内Ca2＋的关键调节分子,兰尼碱受体2（RyR2）是内质网Ca2＋释放的重要通道,本文对CaMKⅡ-RyR2和内质网钙渗漏的关系进行综述.

糖络宁对高糖环境中雪旺细胞内质网应激IRE1通路的影响

目的观察中药复方糖络宁对高糖环境下雪旺细胞的抗凋亡保护作用,探讨糖络宁对于内质网应激IRE1信号通路的调控作用。方法在高糖环境中培养雪旺细胞,设置空白对照组、模型组、糖络宁组、不同阻断剂组。培养12、24小时后,应用流式细胞术检测糖络宁含药血清处理下的细胞凋亡水平,应用免疫印迹法(Western blot,WB)检测内质网应激的IRE1-TRAF2-JNK凋亡通路的标志蛋白肌醇依赖酶1(inositol-requiting enzyme 1,IRE1)、X盒结合蛋白(X-box binding protein 1,XBP1)、肿瘤坏死因子受体相关因子2(TNF receptor-associated factor 2,TRAF2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)的表达,应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测XBP1、TRAF2、JNK的基因表达。结果高糖孵育雪旺细胞12、24小时可显著诱导其损伤,细胞活力下降;与正常组比较,高糖环境下雪旺细胞凋亡水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,糖络宁含药血清能够改善高糖环境下雪旺细胞的凋亡(P<0.05)。在造模后检测时间点12小时、24小时,与空白组比较,模型组IRE1α、TRAF2和JNK表达显著升高(P<0.05);与模型组比较,糖络宁组含药血清组TRAF2和JNK蛋白的表达显著降低(P<0.05)。在造模后检测时间点12小时,与空白组、模型组比较,糖络宁组含药血清组XBP1蛋白表达显著升高(P<0.05)。PCR结果显示,糖络宁含药血清能够发挥类似于TRAF2 siRNA阻断剂的作用,抑制IRE1途径下游凋亡通路。结论糖络宁可对抗高糖环境引起的雪旺细胞损伤,作用机制与调控内质网应激IRE1信号通路有关。在IRE1通路被激发的初期,可能激活IRE1-XBP1通路,提高高糖环境下雪旺细胞的存活能力;当内质网应激过载时糖络宁抑制IRE1-TRAF2-JNK通路,减轻高糖环境下的雪旺细胞的凋亡。

鼠曲草提取物通过抑制PERK/eIF2α/CHOP通路改善ACLT诱导的大鼠骨关节炎

目的探讨鼠曲草提取物对前交叉韧带横断(anterior cruciate ligament transection,ACLT)诱导骨关节炎(osteoarthritis,OA)大鼠损伤的影响。方法选取SPF级健康雄性SD大鼠90只,按体重随机分为假手术组、模型组、鼠曲草提取物低剂量组(400mg/kg)、鼠曲草提取物中剂量组(800mg/kg)、鼠曲草提取物高剂量组(1600mg/kg)和双醋瑞因组(54mg/kg),每组15只,除假手术组外,使用ALCT将余下大鼠制成OA模型并给予相应药物干预,连续干预30d。HE染色观察膝关节软骨组织病理损伤情况,酶联免疫吸附法检测血清和膝关节灌洗液中炎性因子水平,比色法检测膝关节灌洗液中氧化应激因子水平,Westem印迹检测膝关节组织中蛋白激酶受体R样内质网激酶/真核翻译起始因子2a/CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(PERK/eIF2α/CHOP)信号通路相关蛋白表达。结果假手术组有光滑、完整的软骨表面,模型组和鼠曲草提取物低剂量组软骨组织破坏严重且关节软骨层状结构模糊、细胞排列紊乱,鼠曲草提取物中、高剂量组和双醋瑞因组病理损伤程度较模型组得到明显的缓解。模型组大鼠Mankins评分和血清、关节灌洗液中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、IL-1β水平高于假手术组(P<0.05),关节灌洗液中丙二醛(MDA)水平高于假手术组(P<0.05),关节灌洗液中超氧化物歧化酶(SOD)、胱甘肽过氧化物酶(CSH-Px)含量低于假手术组(P<0.05),PERK、eIF2α、CHOP蛋白表达高于假手术组(P<0.05)。鼠曲草提取物中、高剂量组和双醋瑞因组Mankin's评分和血清、关节灌洗液中的TNF-α、IL-6、IL-1β水平低于模型组(P<0.05),关节灌洗液中MDA水平低于模型组(P<0.05),关节灌洗液中SOD、CSH-Px含量高于模型组(P<0.05),PERK、eIF2α、CHOP蛋白表达低于模型组(P<0.05)。结论鼠曲草提取物适宜剂量可明显改善OA大鼠膝关节病理损伤和降低体内炎性反应、氧化应激反应,还可降低PERK/eIF2α/CHOP信号通路活性。

维生素D对糖尿病大鼠模型主动脉中层厚度的影响及其作用机制

目的:探究维生素D(Vit-D)对糖尿病(DM)大鼠模型主动脉中层厚度的影响及其蛋白激酶受体样内质网激酶(PERK)和真核翻译起始因子2α(eIF2α)(PERK/eIF2α)通路的作用机制。方法:选用30只Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠,采用随机数表法将其分为对照组、DM组和DM+Vit-D组,每组10只。通过给每只大鼠腹腔注射链脲佐菌素建立大鼠DM模型,DM+Vit-D组大鼠使用活性形式的Vit-D3灌胃(0.1μg·kg^(-1)·d^(-1))。比较各组大鼠的血糖水平、主动脉损伤情况、血清一氧化氮(NO)和内皮素(ET)水平,并采用Westernblot检测主动脉组织中PERK/eI F2α通路中的蛋白表达水平。结果:DM模型大鼠的血糖水平均>16.7 mmol·L^(-1),干预后DM组和DM+Vit-D组的尾静脉空腹血糖(FBG)水平差异无统计学意义。DM组的收缩压和脉搏波传导速度(PWV)显著高于对照组,其差异有统计学意义(t=5.263,t=4.956,P<0.05);DM+Vit-D组的收缩压和PWV显著低于DM组,其差异有统计学意义(t=5.016,t=4.332;P<0.05)。DM组大鼠的主动脉中层厚度[(103.24±4.98)μm]显著高于对照组[(90.15±3.24)μm],DM+Vit-D组的主动脉中层厚度[(96.74±4.21)μm]显著低于DM组[(80.25±2.86)μm],差异有统计学意义(t=3.521,t=3.852;P<0.05)。DM组的NO水平为(51.49±6.85)μmol·L^(-1)显著降低、ET水平为(110.28±11.39)pg·ml^(-1)显著升高,与对照组比较差异有统计学意义(t=4.585,t=5.677;P<0.05);DM+Vit-D组的NO水平[(61.18±8.21)μmol·L^(-1)]显著升高,ET水平[(101.44±11.32)pg·ml^(-1)]显著降低,与DM组比较差异有统计学意义(t=5.029,t=5.881;P<0.05)。DM组大鼠的PERK和eIF2α蛋白水平显著高于对照组,差异有统计学意义(t=3.612,t=4.083;P<0.05);DM+Vit-D组的PERK和eIF2α蛋白水平显著低于DM组,差异有统计学意义(t=3.506,t=3.892;P<0.05)。结论:Vit-D可通过抑制DM大鼠的主动脉中PERK/eIF2α通路水平,缓解主动脉损伤和血管内皮功能。

NOD2介导的信号通路及其与自身炎症性疾病关系以及抑制剂研究进展

核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2(nucleotide-binding oligomerization domain containing 2,NOD2)是一类胞浆内模式识别受体,其被激活后通过一系列信号级联转导,诱导炎症因子释放,从而在固有免疫应答中发挥重要作用。NOD2信号通路异常涉及多种疾病的发生和发展,尤其是其基因的遗传多态性与自身炎症性疾病(autoinflammatory diseases,AIDs)密切相关。因此,靶向NOD2通路的抑制剂在炎症免疫性疾病治疗中具有巨大潜力。基于此,本文对NOD2受体介导的信号转导通路及其调节机制,NOD2与AIDs的关系以及NOD2通路抑制剂研究的最新进展进行综述。

烧伤后内质网应激在胰岛素抵抗中的作用

炎症和应激是严重烧伤后的主要病理特征。在2型糖尿病中已证实，内质网应激／非折叠蛋白反应与胰岛素抵抗高度相关。为进一步明确烧伤后高糖血症和胰岛素抵抗的发生，是否与内质网应激／非折叠蛋白激活后所致胰岛素受体信号通路受损有关，该研究对人院466d内的重症烧伤患儿及对照组进行比较，采用临床生物标志物测定、蛋白及基因芯片分析等方法，

地榆皂苷Ⅱ抑制肿瘤细胞增殖和诱导其凋亡的作用

目的检测地榆皂苷II对多种肿瘤细胞的体外增殖抑制作用,研究地榆皂苷II诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制。方法采用SRB法检测地榆皂苷II对肿瘤细胞的体外增殖抑制,通过Western blot来研究地榆皂苷II对三大凋亡通路的影响。结果地榆皂苷Ⅱ可上调MDA-MB-231细胞中活性氧的水平,上调CHOP的表达,激活内质网应激途径;下调Bcl-2的表达,上调Bax的表达,激活线粒体凋亡途径;上调DR4、DR5的表达,激活TRAIL外源凋亡通路。结论地榆皂苷II通过激活三大细胞凋亡通路来抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞的凋亡。