IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白降低软骨细胞的自噬功能

目的探究肌醇依赖性激酶1α(IRE1α)通过调控内质网钙稳态蛋白(CHERP)影响软骨细胞自噬功能的相关机制。方法衣霉素(TM)处理人软骨细胞C28/I2,Western blot检测不同时间点的内质网应激和自噬相关蛋白指标。4μ8c、雷帕霉素(Rapa)处理C28/I2(分为:NC组、4μ8c组、Rapa组、4μ8c+Rapa组),Western blot检测自噬相关蛋白指标。分别从软骨组织特异性ERN1基因敲除小鼠(ERN1 CKO)和对照小鼠(Control)软骨组织分离原代软骨细胞,qPCR检测ERN1及自噬相关蛋白ATG5、ATG7的mRNA水平,Western blot检测IRE1α/p-IRE1α、CHERP表达水平,流式细胞术检测胞内钙离子含量。巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1)处理原代软骨细胞(分为Control组、Control+Bafilomycin A1组、ERN1 CKO组、ERN1 CKO+Bafilomycin A1组),Western blot检测LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的表达。自噬双荧光病毒在Rapa处理下检测自噬流(分为Control+Rapa组、ERN1 CKO+Rapa组)。C28/I2中过表达CHERP与IRE1α,免疫荧光检测自噬水平。结果TM处理C28/I2细胞后,内质网应激相关标志蛋白表达上调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调(P<0.05),p62表达下调(P<0.05)。相较对照组,Rapa上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值(P<0.001),4μ8c+Rapa组相较Rapa组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P<0.05)。相较于对照组,原代软骨细胞中敲除ERN1/IRE1α后,ERN1(P<0.01)、ATG5(P<0.001)、ATG7(P<0.001)mRNA水平显著下调。IRE1α/p-IRE1α蛋白表达缺失或显著下调(P<0.01),CHERP蛋白表达上调(P<0.05),胞内钙离子含量显著上升(P<0.001)。巴佛洛霉素A1处理原代软骨细胞后,Control+Bafilomycin A1组较Control组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调(P<0.01),ERN1 CKO+Bafilomycin A1组较ERN1 CKO组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调(P<0.05)、较Control+Bafilomycin A1组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降(P<0.05)。自噬双荧光病毒处理后,ERN1 CKO+Rapa组较Control+Rapa组未淬灭LC3-GFP荧光增强(P<0.05)。C28/I2细胞中过表达CHERP降低LC3荧光强度,过表达IRE1α增强LC3荧光表达并能部分挽救CHERP导致的荧光降低情况。结论IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白,升高胞内钙离子含量,进一步导致软骨细胞的自噬功能受损。

硒蛋白K基因干扰对T淋巴细胞内质网钙稳定蛋白的影响

目的探讨SelK mRNA干扰效果及其硒蛋白K(SelK)基因干扰后对细胞内质网钙稳态蛋白(endoplasmicreticulum calcium homeostasis protein,CHERP)的表达,观察T淋巴细胞内Ca^(2+)浓度的变化。方法从SelK m RNA(NM_019979.2)的编码序列中符合设计要求的靶位点设计特异性干扰SelK mRNA的RNAi片段,构建shRNA干扰载体靶向干扰SelK RNA,用核酸序列分析方法分析重组片段的正确性,利用荧光定量PCR和Westeron blot鉴定SelK mRNA的干扰效果,采用Real time-PCR的方法检测SelK干扰后细胞内的CHERP的变化。结果阳性重组载体可以被BamH I酶切。酶切片段序列分析重组子质粒结果与所设计片段完全一致,正确率为100.0%。三个ShRNA表现了不同的干扰效果,sh222、sh102和sh101的干扰效率分别为12.13%、16.46%和42.37%,在核酸水平上重组质粒sh101对SelK的干扰效果最佳,与sh222和sh102相比,差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot检测重组质粒sh101在蛋白水平上的干扰效率为45.4%,干扰组细胞中CHERP的表达与对照组相比抑制率达到40.0%。结论重组质粒sh101对SelK在核酸和蛋白质水平上都有较好的干扰效率,SelK干扰对细胞中CHERP的表达有抑制的作用,或因此打乱了内质网与胞质中的钙离子平衡,从而影响到了细胞内游离的钙离子浓度,是导致T淋巴细胞激活的因素之一。