慢病毒介导的热休克蛋白70基因对缺血/缺氧诱导嗜铬细胞瘤细胞内钙通道调节机制的研究

目的：探讨慢病毒介导的热休克蛋白70（HSP70）基因表达对缺血/缺氧嗜铬细胞瘤（PC12）细胞内质网钙稳态的影响及钙通道的调节机制。方法取对数生长期的PC12细胞，分为重组慢病毒感染组〔感染含HSP70及绿色荧光蛋白（GFP）基因的慢病毒〕、慢病毒对照组（感染含GFP但不含HSP70基因的慢病毒）及未感染组。采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测PC12细胞经缺血/缺氧处理4、8、12、24h后的细胞活性，以选取最佳缺血/缺氧时间。采用实时定量反转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）检测缺血/缺氧8h时HSP70、肌质/内质网Ca2＋-ATP酶亚型（SERCA2a、SERCA2b）、兰尼碱受体2（RyR2）、三磷酸肌醇受体1（IP3R1）的mRNA转录水平；采用蛋白质免疫印迹试验（WesternBlot）检测缺血/缺氧8h时HSP70、SERCA、IP3R的蛋白表达水平；采用流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）及游离钙离子（[Ca2＋]i）水平。结果随着缺血/缺氧时间延长，各组细胞活性呈先增强后减弱的趋势，均于8h时达峰值。缺血/缺氧8h时，重组慢病毒感染组细胞活性较未感染组和慢病毒对照组均明显升高〔A值（×10-2）：20.3±2.2比14.1±2.1、15.0±1.6，均P＜0.01〕，HSP70和SERCA的mRNA及蛋白表达均明显上调〔HSP70mRNA（2-ΔΔCt）为0.785±0.018比0.428±0.019、0.423±0.023，HSP70蛋白（灰度值）为2.72±0.20比1.56±0.36、1.63±0.41，SERCA2amRNA（2-ΔΔCt）为0.971±0.037比0.367±0.014、0.347±0.012，SERCA2bmRNA（2-ΔΔCt）为8.869±0.162比3.015±0.091、2.941±0.091，SERCA蛋白（灰度值）为2.84±0.18比1.48±0.26、1.52±0.29〕，IP3R2的mRNA及蛋白表达均明显下调〔IP3R2mRNA（2-ΔΔCt）为0.183±0.020比0.439±0.020、0.433±0.040，IP3R2蛋白（灰度值）为1.15±0.12比1.91±0.20、1.83±0.19〕，差异均有统计学意义（均P＜0.01），而RyR1mRNA表达差异无统计学意义〔2-ΔΔCt（×10-3）：1.97±0.63比2.02±0.22、2.01±0.09，均P＞0.05〕；细胞内ROS及[Ca2＋]i的荧光强度均显著降低（ROS为30.54±1.23比58.03±1.97、57.72±2.35，[Ca2＋]i为34.50±2.05比48.20±3.02、46.80±2.75，均P＜0.01）。结论外源性HSP70能维持PC12细胞内质网钙稳态，对细胞内质网钙释放通道IP3R及肌质网钙泵SERCA调控Ca2＋的通道蛋白具有显著影响，可能对缺血/缺氧引起的PC12细胞内损伤具有保护作用。

金匮肾气丸对微波辐射性生殖功能障碍小鼠生精细胞Ca^(2+)、RyRs及MMP的影响

目的:探讨微波辐射对小鼠生精细胞损伤机制及金匮肾气丸治疗机制。方法:将50只雄性BALB/c小鼠随机分为正常组,辐射组,金匮1、2、3组。除正常组外,其余4组均暴露于2 450MHz、10m W/cm2连续微波中,1h/d,18d。金匮1、2、3组每次分别给予0.1、0.2、0.4g/kg体质量金匮肾气丸灌胃,正常组、辐射组分别给予0.1m L 0.9%氯化钠溶液灌胃,1次/d,18d。检测小鼠生精细胞内Ca^(2+)荧光强度、内质网钙通道蛋白(Ry Rs)、线粒体膜电位(MMP)。结果:与正常组比较,辐射组Ca^(2+)荧光强度显著升高,而MMP、Ry Rs阳性表达显著降低(P<0.05);而金匮1、2、3组与辐射组比较,Ca^(2+)荧光强度降低,MMP、Ry Rs阳性表达显著升高(P<0.05),呈浓度依赖型,其中,金匮3组在Ca^(2+)荧光强度方面改善优于金匮1、2组(P<0.05)。结论:微波辐射损伤可使生精细胞内Ca^(2+)浓度增高,MMP、Ry Rs阳性表达降低,金匮肾气丸可通过调节Ry Rs、MMP修复损伤,降低细胞内Ca^(2+)浓度而达到治疗效果,且药量增加效果显著。