内质膜蛋白复合体亚基6对海拉细胞自噬的调控作用

目的 探讨内质膜蛋白复合体亚基6（EMC6）基因在海拉（HeLa）细胞中的自噬调解活动。 方法 （1）构建3种质粒：EMC6真核表达质粒、特异性干扰EMC6质粒、空白质粒。分别将3种质粒转染HeLa细胞，筛选3组中的稳定表达细胞株。（2）用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）、Western blot检测3组质粒转染后Hela细胞中EMC6 mRNA表达结果。（3）电镜下观察HeLa细胞内自噬体；用自噬抑制剂Bafilomycin A1和3-甲基腺嘌呤（3-MA）分别作用于转染EMC6质粒的处理组、空白质粒组和HeLa组，在共焦显微镜下观察比较细胞株中绿色荧光蛋白（GFP）-微管相关蛋白1轻链3（LC3）的变化。 结果 （1）Real-time PCR法检测转染不同质粒进入HeLa细胞株后，处理组、干扰组及空白质粒组各5例，2－ΔΔCt的平均值分别为3.29±0.62、0.38±0.04、1.11±0.20，EMC6 mRNA拷贝数量在3组之间差异有统计学意义（P＝0.020）。（2）在转染了EMC6质粒的HeLa细胞组中可观察到自噬体形成，并观察到Bafilomycin A1作用于3组细胞后，可见GFP-LC3斑点聚集，而EMC6过表达组的LC3斑点明显较空白质粒组及HeLa组丰富。 结论 过表达EMC6蛋白可使HeLa细胞内自噬体数目增加，可能使宫颈癌细胞内自噬活动增强；EMC6过表达细胞株中，磷酸肌醇3激酶（PI3K）抑制剂抑制了EMC6所诱发的自噬过程。

甘蔗细胞色素b6-f复合体铁硫亚基(SoCYT)基因的克隆和表达分析

以甘蔗叶片总RNA为模板,通过RT-PCR扩增细胞色素b6-f复合体铁硫亚基基因的c DNA,采用生物信息学软件分析所克隆基因的编码蛋白特性,并用荧光定量PCR分析该基因的表达情况。结果表明：克隆得到的c DNA片段长度为796 bp,包括1个579 bp的开放阅读框,编码192个氨基酸。甘蔗与高粱CYT基因c DNA序列的同源性为94.0%,氨基酸序列同源性为99.0%;该基因推导的蛋白分子量大小为20.67KD,等电点为6.24,疏水性分值在0.50~2.11;蛋白二级结构中α-螺旋占17.19%,随机卷曲占53.12%,延伸链占21.53%,β-转角只占8.33%,Gen Bank登录号为JQ712582。实时荧光定量分析结果表明,随着甘蔗干旱胁迫时间的延长,So CYT基因表达均呈下降的趋势,PEG与PEG加Si处理的So CYT基因的表达量有显著差异,加硅可减缓So CYT基因表达的下降速度和对细胞色素b6/f复合体的结构的损伤和影响。

光系统I捕光天线及反应中心、细胞色素b6f复合物的结构与功能研究2011年度报告

该研究旨在揭示光合膜色素蛋白复合体——光系统I捕光天线及核心复合体、细胞色素b6f复合物的结构与功能。通过多种光谱学技术研究光能的吸收传递和转化的量子机理,并通过获得膜蛋白晶体,在近原子或原子水平分辨率解析膜蛋白的空间结构,揭示光合作用的物质基础,更深刻地理解光合作用机理。该报告还将研究参与光合膜组装、光能转换和利用及功能调控有关的重要基因以及相应的蛋白的结构与功能,揭示光合作用中光抑制和光氧化调控的分子机理,为提高光能利用效率提供理论依据。

含EMC6基因重组真核表达载体的构建及其在人肝L-02细胞中的异位表达

目的:构建pcDNA3.1(+)/EMC6真核表达载体,并将其在人肝L-02细胞株中过表达。方法:查询Pub Med上EMC6的基因序列,针对该序列设计引物,提取L-02细胞的总RNA、聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段,采用基因重组技术将EMC6的cDNA定向插入真核表达载体pcDNA3.1中,构建pcDNA3.1(+)/EMC6真核表达载体,经菌落PCR,测序验证构建的准确性。应用脂质体转染方法将重组载体转入L-02细胞中,RT-PCR、蛋白质印迹法检测EMC6基因的mRNA和蛋白表达水平。结果:PCR和基因测序结果均表明pcDNA3.1(+)/EMC6重组质粒构建成功,RT-PCR和蛋白质印迹检测结果证实EMC6在人肝L-02细胞中过表达。结论:成功构建人pcDNA3.1(+)/EMC6重组质粒,并在L-02细胞中过表达。

光系统I捕光天线及反应中心、细胞色素b6f复合物的结构与功能研究立项报告

该课题旨在揭示光合膜色素蛋白复合体棗光系统I捕光天线及核心复合体、细胞色素b6f复合物的结构与功能。通过多种光谱学技术研究光能的吸收传递和转化的量子机理,并通过获得膜蛋白晶体,在近原子或原子水平分辨率解析膜蛋白的空间结构,揭示光合作用的物质基础,更深刻地理解光合作用机理。该课题还将研究参与光合膜组装、光能转换和利用与功能调控有关的重要基因以及相应的蛋白的结构与功能,揭示光合作用中光抑制和光氧化调控的分子机理,为提高光能利用效率提供理论依据。

EMC6对宫颈癌HeLa细胞生长的影响研究

目的研究EMC6(内质网膜复合亚基6)基因对宫颈癌HeLa细胞生长的影响及EMC6在宫颈癌发生过程中的作用,为探讨诱导自噬用于治疗宫颈癌提供线索。方法 (1)构建3种质粒:EMC6真核表达质粒、特异性干扰EMC6质粒、空质粒。分别将3种质粒转染HeLa细胞。筛选3组中的稳定表达细胞株。(2)用Real timePCR、Western blot检测3组质粒转染后Hela细胞中EMC6mRNA表达结果。(3)15只裸鼠被随机地分成3组。接种3种表达株至裸鼠皮下成瘤。记录3组瘤体生长速度及并测量瘤体大小。免疫组化检测3组瘤体组织中EMC6蛋白表达水平。结果与HeLa组(未转染质粒)裸小鼠相比,Hela-shRNA组(EMC6被干扰)裸小鼠致瘤活性明显增强,生长加快,瘤体体积明显变大(P<0.05)。HeLa-EMC6组(EMC6过表达)裸小鼠致瘤活性明显降低,生长缓慢,瘤体体积明显缩小(P<0.05)。Hela-shRNA组裸小鼠瘤体重量(1.03±0.12)g,较HeLa组肿瘤增重28.75%(P<0.05);HeLa-EMC6组瘤体重量(0.39±0.14)g,较HeLa组明显减轻51.25%(P<0.05)。结论EMC6蛋白在裸鼠体内能明显抑制HeLa细胞生长,致瘤性降低。

EMC6在宫颈癌中的表达及临床意义

目的研究新发现的基因内质网膜复合亚基6(EMC6)在正常宫颈、宫颈上皮内瘤样病变及宫颈癌组织中的表达。方法收集正常宫颈组织(正常宫颈组)及宫颈上皮内瘤变组织(CIN组)各80例和宫颈癌组织100例(宫颈癌组)石蜡组织标本。用免疫组化法研究EMC6分别在上述病例中的表达。结果宫颈癌组中EMC6表达率为64.0%(64/100),CIN组中EMC6表达率为93.8%(75/80),正常宫颈组中EMC6表达率为81.3%(65/80),各组EMC6表达差异有统计学意义(P<0.05)。EMC6蛋白表达率与宫颈癌患者年龄、临床分期、癌组织的大小、大体类型、病理类型、分化程度、有无淋巴结转移等均无相关性(P>0.05)。结论 EMC6的表达降低可能参与了宫颈癌的发生、发展。但EMC6表达水平与宫颈癌患者的各临床特征,包括年龄、期别、癌组织的大小、大体类型、病理类型、病理分化程度、有无淋巴结转移等无关。

血清INTS6P1作为肝细胞癌疾病筛查新型标志物的可行性研究

目的探讨血清中整合因子复合体亚基6假基因1(INTS6P1)作为肝细胞癌患者疾病筛查新型标志物的可行性。方法采用Northern杂交方法检测33例肝细胞癌患者肿瘤组织及临近肺肿瘤组织中INTS6P1的表达情况,通过细胞试验检测INTS6P1在细胞培养上清和胞内表达情况,最后检测INTS6P1在100例患者体内的表达情况。结果与临床非肿瘤组织相比,33例肝细胞癌患者肿瘤组织中的INTS6P1表达量显著降低(P=0.0066)。血清检测结果表明,肝细胞癌患者血清中INTS6P1表达水平显著低于非肝细胞癌患者(P<0.01)。此外,曲线下面积-ROC曲线分析表明,血清-AFP含量低于20 ng/ml时INTS6P1可以作为肝细胞癌患者疾病筛查的诊断标志物(P<0.05)。结论血清INTS6P1可以作为肝细胞癌疾病筛查新型标志物,将该标志物纳入检测能提高肝细胞癌临床诊断的准确率。

CSN6对宫颈癌细胞自噬的调节作用

目的探讨组成型光形态发生因子9信号复合体亚基6(constitutive photomorphogenesis 9 signalosome subunit 6,CSN6)对宫颈癌HeLa细胞和SiHa细胞自噬能力的影响。方法用自噬双标腺病毒mRFP-GFP-LC3感染宫颈癌细胞示踪自噬流的水平,将阴性对照序列(siCtrl)、CSN6 siRNA(siCSN6)、空载体质粒(Vector)及CSN6过表达质粒(CSN6)分别转染宫颈癌细胞,Western blot检测CSN6及微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated proteinl light chain 3,LC3)的表达。结果与siCtrl组相比,siCSN6组CSN6表达下降,而自噬体数量和LC3表达增加;与Vector组相比,CSN6组CSN6表达增加,而自噬体数量和LC3表达下降。结论转染小干扰CSN6增加宫颈癌细胞自噬水平,CSN6过表达抑制自噬活性。

CSN6对宫颈癌HeLa细胞与SiHa细胞自噬能力的影响研究

目的探讨组成型光形态发生因子9信号复合体亚基6(CSN6)对宫颈癌HeLa细胞与SiHa细胞自噬能力的影响。方法购置宫颈癌HeLa细胞与SiHa细胞,并测定腺病毒中GFP与mRFP表达水平,标记、追踪LC3,示踪自噬流的水平;将购置的细胞放置在6孔板中进行培养,随机分为对照序列组、CSN6 siRNA组、空载体质粒组与CSN6过表达组,各组细胞均进行相应的处理(连续完成24 h干预);采用Western Blot法测定各组细胞中CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表达水平,荧光显微镜下检测两种细胞中自噬体个数,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞干预后增殖抑制率。结果siCSN6组不同宫颈癌细胞中自噬体个数高于siCtrl组,差异具有统计学意义(P<0.05);siCSN6组CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表达水平高于siCtrl组、siCSN6组及CSN6组,差异具有统计学意义(P<0.05);CSN6组CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表达水平低于siCtrl组、siCSN6组,差异具有统计学意义(P<0.05);siCSN6组干预后2、6、12、24、48 h细胞增殖抑制率高于siCtrl组、siCSN6组及CSN6组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论转染CSN6能提高宫颈细胞的自噬水平,而过表达CSN6则能抑制自噬活性,均会对细胞增殖抑制率产生影响。