黑龙江野鲤核糖体内转录间隔区1(ITS-1)的克隆及二级结构的预测与分析

黑龙江野鲤是中国北方重要的养殖鱼类,分析和了解其遗传结构对鲤鱼种质资源的保护和遗传性状的改良具有重要的意义。该研究对黑龙江野鲤(Cyprinus carpio haematopterus)核糖体内转录间隔区1(ITS-1)进行了克隆测序,并对ITS-1序列进行了分析。结果显示:所克隆的黑龙江野鲤ITS-1序列长度为365 bp,其中A、T、G、C 4种碱基的含量分别为21.4%、12.3%、34.0%和32.3%;与从GenBank中检索到的6种鲤科鱼类的ITS-1序列相比较,相似性较低,介于24.9%至59.5%之间;同时利用最小自由能原理预测7种鲤科鱼类ITS-1序列的二级结构,并分析了其结构特点。根据鲤鱼与其他6种鲤科鱼类的ITS-1序列的同源性构建NJ系统进化树,与根据该保守序列形成的发夹结构的相似性构建的进化树大致相同,所得的分类结果与传统的分类结果基本一致。因此,一、二级结构相结合将是研究物种分子系统学的重要手段。

金焰笛鲷rDNA基因转录间隔区ITS-1序列分析

以持异性引物扩增了金焰笛鲷(Lutjamts fulviflamma)的核糖体第一转录间隔区(ITS-1),扩增产物经克隆后测序,测得 ITS-1长度为566 bp。其中 A、T、G、C 4种碱基的含量分别为14.1%、16.1%、30.2%、39.6%,G+C(69.8%)含量明显高于 A+T 含量(30.2%)。将此引物在笛鲷属其他4种鱼类中扩增,发现该对引物有很好的通用性;比较发现在不同种中 ITS-1存在着较大的差异,适合将其应用于分子系统学和种质资源方面的研究。

我国不同利什曼病流行区利什曼原虫分离株核糖体内转录间隔区1的多态性分析

目的分析我国不同利什曼病流行区的利什曼原虫分离株核糖体内转录间隔区1 (ITS-1)序列的多态性。方法实验室培养10个分离自我国不同利什曼病流行区的利什曼原虫分离株,包括四川/甘肃山丘型内脏利什曼病流行区的SC6和Cy分离株,新疆喀什人源型内脏利什曼病流行区的801和KS-2分离株,新疆伽师荒漠型内脏利什曼病流行区的JIASHI-1、 JIASHI-5、 XJ771分离株以及新疆克拉玛依皮肤利什曼病流行区的KXG-Xu、KXG-Liu和KXG-927分离株。收集利什曼原虫前鞭毛体,提取DNA, PCR扩增各利什曼原虫分离株的ITS-1并送测序,用GENEDOC软件对ITS-1序列进行比对分析,从GenBank下载利什曼原虫其他分离株的ITS-1序列,构建系统进化树,分析我国利什曼原虫分离株的亲缘关系。结果我国10个利什曼原虫分离株均扩增出单一的条带。序列分析结果显示, 801和KS-2分离株的ITS-1片段为316 bp,与MHOM/IN/80/DD8参照株比较其碱基突变率为0; JIASHI-1、 JIASHI-5和XJ771分离株为313 bp,碱基突变率为1.6%; KXG-Xu、 KXG-Liu和KXG-927分离株为312 bp,碱基突变率为1.6%; Cy和SC6分离株为318 bp,碱基突变率为0.6%。系统进化树显示,这10个利什曼原虫分离株ITS-1序列聚集成2个群和3个亚群,其中JIASHI-1、 JIASHI-5和XJ771分离株聚集为A亚群, KXG-Xu、 KXG-Liu和KXG-927分离株聚集为B亚群, A和B亚群聚集于群Ⅰ,为婴儿利什曼原虫; Cy、SC6、 801和KS2分离株聚集为C亚群,属群Ⅱ,为杜氏利什曼原虫。结论我国不同利什曼病流行区的利什曼原虫分离株的ITS-1序列存在多态性。

我国人源蛔虫和猪源蛔虫核糖体第一内转录间隔区的扩增克隆及序列分析

本研究旨为研究人蛔虫和猪蛔虫核糖体第一内转录间隔区(ITS-1 r DNA)的遗传变异,应用聚合酶链式反应(PCR)对人蛔虫和猪蛔虫分离株ITS-1 r DNA序列进行扩增、克隆、测序,将获得的序列用Clustal X 1.83程序进行比对分析,再用Phy ML 3.0程序中的最大似然树法(ML)绘制种系进化树。本结果显示,人蛔虫和猪蛔虫的ITS-1 r DNA序列长度分别为447~448 bp和447~451 bp;人蛔虫和猪蛔虫ITS-1 r DNA序列的差异性为0.4%~1.6%。种系发育树表明,人蛔虫和猪蛔虫分离株位于两个不同分支。本研究结果支持人蛔虫和猪蛔虫可能为同一个种不同基因型的结论。

四个鲤鱼种群ITS-1序列的遗传变异分析

对我国四个鲤鱼种群的核糖体DNA内转录间隔区ITS-1进行了PCR扩增、测序.序列分析显示,370bp的ITS-1序列中GC含量明显高于AT含量,共检测到34个变异位点,96个样本得到14个单倍型,平均单倍型多样性为0.637±0.055,核苷酸多样性为0.00857±0.00200,遗传多样性表现较低.黑龙江野鲤种群与建鲤种群间遗传距离最远,为0.10129,黑龙江野鲤种群与黄河鲤种群间遗传距离最近,为0.02305.分子方差分析(AMOVA)表明,群体间遗传分化系数Fst为0.05373,几乎所有变异都来自群体内,群体间遗传分化极小.ITS-1序列构建系统进化树显示,四个种群分为南北2支,黑龙江野鲤和黄河鲤种群聚为北方支,建鲤和荷包红鲤种群聚为南方一支.

基于ITS-1序列的5种兔球虫系统进化分析

利用核糖体DNA内转录间隔区1(ITS-1)序列对兔艾美耳球虫进行系统进化分析,并探讨生物学和形态学特征在兔球虫进化中的意义。单卵囊分离大型、黄、肠、中型及穿孔艾美耳球虫卵囊,接种无球虫兔获得纯种卵囊,CTAB法提取卵囊基因组DNA,PCR扩增ITS-1区后克隆、测序。将测序结果与GenBank发布的兔球虫ITS-1序列进行比对和遗传距离分析,绘制系统进化树。结果显示:大型、黄、肠、中型及穿孔艾美耳球虫河北株ITS-1序列分别长320、330、351、336和341bp。5种兔球虫河北株与GenBank中同种兔球虫ITS-1序列相似性分别为96.9%、97.3%、96.9%、99.1%和99.4%。兔球虫形成单系群,该单系群分为2个姐妹谱,与卵囊残体有无相对应,其它形态学和生物学特征与系统进化无相关性。研究结果表明外残体的有无可作为兔球虫进化分类的特征。

海水鱼类寄生本尼登虫的ITS1序列

从不同的海水鱼上采获一批本尼登虫 (单殖纲、分室科、本尼登亚科 ) ,其中部分标本经形态学研究后仍不能定种 .本文采用PCR扩增及DNA序列测定的分子生物学方法 ,对棘鳞鱼畏本尼登虫、玫氏新本尼登虫、新本尼登虫未定种 1和新本尼登虫未定种 2的rDNA基因的ITS1序列进行了研究 .结果表明 :新本尼登虫未定种 1和新本尼登虫未定种 2与玫氏新本尼登虫的ITS1序列非常相似 ,差异率为 0 7%(小于 1%) ,应为同一个种 .而本尼登虫与新本尼登虫间的差异在 33%以上 .本研究弥补了本尼登类单殖吸虫形态分类的某些不足 .

基于ITS-1基因序列的隐孢子虫种群分类

本试验以内转录间隔区1(ITS-1)基因作为研究对象,用PCR技术分别对广东(GD)禽源、广东(GD)和安徽(AH)牛源3个隐孢子虫分离株ITS-1基因进行扩增、克隆、序列测定和分析。将扩增序列用DNAStar(4.0)和ClustalX1.81软件与GenBank上登录的参考序列比对,用Phylip3.67构建种群发育进化树,以确定分离株与其他隐孢子虫虫种之间的亲缘关系。通过对ITS-1基因全序列分析,结果表明:禽源隐孢子虫GD分离株为Cryptosporidium baileyi,牛源隐孢子虫GD分离株和AH分离株均为C.andersoni。因此,ITS-1基因可作为隐孢子虫分离株种群分类的遗传标记,从而为隐孢子虫属的种间鉴定以及进一步的分子流行病学调查和分子诊断学研究奠定了基础。

皖浙两省部分地区宠物犬肠道中犬新孢子虫的感染情况

目的 了解安徽省和浙江省宠物犬肠道中犬新孢子虫的感染情况。 方法 2013年4-12月从安徽省合肥市包河区、宣城市宣州区、滁州市凤阳县和明光市、蚌埠市龙子湖区和宿州市泗县，以及浙江省杭州市余杭区的宠物门诊采集315份新鲜宠物犬粪样。所有样品处理后先采用基于犬新孢子虫特异基因NCLI-004830的巢式PCR方法进行检测，随后对阳性样品进行PCR扩增和分析其内转录间隔区1（ITS1）序列以进一步验证。 结果 315份粪样中NCLI-004830基因巢式PCR共扩增出5份犬新孢子虫DNA阳性样品，产物大小为420 bp，阳性率为1.6%，滁州和蚌埠宠物犬的阳性率分别为3.4%（3/89）和6.5%（2/31），其余调查点未发现犬感染犬新孢子虫。5份NCLI-004830基因阳性样品的ITS1序列经PCR扩增后，均扩增出137 bp的条带，序列鉴定正确。成年犬和幼龄犬之间，雄性犬和雌性犬之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。 结论 安徽省滁州和蚌埠的宠物犬有犬新孢子虫感染。

犬源环孢子虫的ITS-1序列鉴定

目的对犬粪中新发现的环孢子虫进行分子鉴定。方法在GenBank中登录的环孢子虫18S和5.8S rDNA序列的保守区设计一对引物ITS-1+F/ITS-1+B,扩增犬源环孢子虫ITS-1+序列;将扩增产物纯化并连接到质粒载体pMD19-T,克隆转入感受态细胞JM109,挑选阳性克隆测序并进行相似性比较和种类鉴定。结果犬源环孢子虫ITS-1+序列长为547bp,包含58bp的18S rDNA序列,333bp的ITS-1序列和156bp的5.8S rDNA序列。其中的18S rDNA和5.8S rDNA与艾美耳科原虫的相似性最大;其中的ITS-1序列与人源环孢子虫、牛源环孢子虫、狒狒源环孢子虫均不相同。结论该犬源环孢子虫可能为环孢子虫属的一个新种。

象山港黄墩支港菲律宾蛤仔种群COI和ITS1基因序列特征及遗传多样性分析

为了解象山港黄墩支港菲律宾蛤仔种质资源的遗传多样性现状,采用COI和ITS1分子标记对该种群进行了基因序列特征和遗传多样性分析.结果表明:在该种群30个个体中扩增得到的COI基因序列长度均为709 bp,ITS1序列长度范围在693~729 bp(共有746个位点).COI基因序列的位点中有670个保守位点(占94.50%)、39个变异位点(占5.50%);ITS1序列的位点中有保守位点671个(占89.95%)、变异位点62个(占8.31%)和缺失/插入位点13个(占1.74%).COI基因序列的保守性高于ITS1序列.在COI基因序列中碱基(A+T)的占比(65.84%)高于(C+G),而ITS1序列中则是碱基(A+T)占比(37.59%)低于(C+G).COI和ITS1序列的遗传距离分析均显示群体内遗传分化不明显.基于COI基因序列和ITS1序列构建的遗传进化树显示:各科贝类分别相聚,象山港菲律宾蛤仔位于帘蛤科的分支中,其COI序列与杂色蛤进化关系最近.遗传进化树中各种贝类的聚类关系与传统分类学结果相一致,可作为分类的参考. COI和ITS1序列的平均核苷酸差异数分别为5.497和6.549,核苷酸多样性指数分别为0.007 75和0.009 73,单倍型数目分别为21和28,单倍型多样性分别为0.963和0.993,根据COI和ITS1两个序列计算得到的菲律宾蛤仔象山港群体单倍型多样性均大于0.5,核苷酸多样性指数均大于0.005,表明该种群遗传多样性丰富,并处于稳定状态.本研究结果补充了菲律宾蛤仔遗传多样性方面的研究资料,并可为象山港菲律宾蛤仔种质资源保护和遗传育种提供理论基础.

上海市1例输入性罗阿丝虫病的临床特征与诊断

目的对上海市1例输入性罗阿丝虫病的临床特征与诊治进行分析。方法收集患者临床资料,进行相关流行病学调查;采集患者骨髓及外周血,制作涂片瑞氏染色后镜检;提取患者血样DNA,用丝虫核糖体内转录间隔区1(ITS-1)通用引物PCR进行扩增,对扩增产物进行基因测序检测并进行BLAST比对分析。根据诊断结果给予相应治疗。结果患者,浙江仙居人,2015年5-11月在刚果(金)务工,回国后于2016年1月发现左上肢远端皮肤肿胀,伴皮肤颜色加深。当地医院血检显示嗜酸粒细胞计数升高,核磁共振检查示左前臂部分肌群及腕关节肌腱炎性病变,诊断为"嗜酸性筋膜炎",服用甲泼尼龙片(美卓乐)治疗1年余,无明显效果。2018年2月27日至上海市瑞金医院皮肤科就诊。查体:皮肤黝黑,无皮疹、肿块及淋巴结肿大,其余均无异常。外周血嗜酸粒细胞计数8.2×10~9/L,外周血、骨髓涂片查见微丝蚴,8 ml全血离心浓缩后检出较多微丝蚴。PCR扩增出457 bp的阳性条带,条带序列与罗阿丝虫(Gen Bank登录号:DQ995497)ITS1的相似性为100%。根据微丝蚴形态学和PCR检测结果诊断该病例为罗阿丝虫病,给予伊维菌素150μg/(kg·d)单剂口服,治疗2周后复查,外周血厚、薄血膜中均未查见虫体,8 ml全血离心浓缩后检出12条微丝蚴,外周血嗜酸粒细胞计数为6.39×109/L,伊维菌素治疗有效。结论经病原学和分子生物学检测确诊病例为输入性罗阿丝虫病例。

源于长颈鹿毛首线虫的形态特征及分子鉴定

目的 以合肥野生动物园长颈鹿体内分离出的毛首线虫（Trichuris）为研究对象，分析感染长颈鹿毛首线虫的形态特征并对其作分子鉴定。方法 对长颈鹿体内分离出的毛首线虫进行形态学特征分析，采用PCR扩增其内转录间隔区1（ITS-1），构建克隆载体并送测序，所获得的序列在GenBank中进行同源性分析，利用最大简约法构建系统进化树。 结果 雄虫总长35.89-58.56 mm；食道占体长比例为0.29-0.40，交合刺长1.96-3.89 mm，粗部长7.02-23.45 mm，细部长28.05-40.05 mm，与已报道的感染长颈鹿的毛首线虫呈不同程度的差异。PCR扩增片段为491 bp，包含部分18S rRNA和全长ITS-1，序列比对分析结果表明，其与野牛毛首线虫西班牙株（T. bos taurus，HE608848）、捷克狍毛首线虫（T. capreolus，JX218218）、日本瞪羚毛首线虫（T. japanese，AB367795）的同源性最高，为98.6%；与异色首线虫（T. discolor，AB367794）同源性仅为46.0%。在系统进化树上它与异色毛首线虫、绵羊毛首线虫（T. ovis）和野牛毛首线虫西班牙株等均不在同一分枝上。 结论 从长颈鹿分离的毛首线虫与已报道的毛首线虫在形态学和ITS-1基因序列上均存在明显的差异，是否为毛首线虫新种有待进一步研究。

甘肃省迭部县犬利什曼原虫种型鉴定及种系发育分析

目的了解甘肃省迭部县犬利什曼原虫虫种类型和种系发育关系,为探索犬源型内脏利什曼病防控新方法提供依据。方法提取8份甘肃省迭部县洛大行政村无症状感染利什曼原虫犬血液样本DNA,采用PCR法扩增分离核糖体内转录间隔区1(ITS-1)基因片段,对扩增的目的片段进行基因测序;采用MEGA 7.0软件进行多序列比对,并经邻接法构建系统发育树,分析甘肃省迭部县犬利什曼原虫种系发育关系。结果8份无症状感染利什曼原虫犬血液样本均扩增出约320 bp的片段,与目标序列ITS-1大小一致。ITS-1序列比对显示,8份样本与婴儿利什曼原虫MG969403、MN648755虫株序列同源性为99.1%~100.0%;系统发育树显示,8份样本均与婴儿利什曼原虫聚为一支。结论甘肃省迭部县8份无症状感染利什曼原虫犬血液样本的原虫种型均为婴儿利什曼原虫。

虫种特异性基因检测小鼠无虫病理组织裂头蚴感染的可行性研究

目的研究用细胞色素C氧化酶1基因(cox1)及内转录间隔区1(ITS-1)特异性序列检测小鼠无虫病理组织中裂头蚴感染的可行性。方法 6~8周龄昆明小鼠20只,采用随机抽签法分为感染组(15只)和未感染组(5只),感染组小鼠经口感染蛇源裂头蚴(5条/只),未感染组不作任何处理。感染后第14天剖杀小鼠,取感染组小鼠皮下含裂头蚴肌肉组织(含虫组织)、去除裂头蚴肌肉组织(无虫组织)及未感染组小鼠相应部位肌肉,制作组织切片,苏木精-伊红染色法(HE)染色后观察。用改良的蛋白酶K消化法提取未染色肌肉组织切片的DNA,PCR扩增cox1(2对引物,对应cox1-1和cox1-2片段)和ITS-1序列。选取从感染组无虫组织DNA扩增的cox1-1进行克隆并测序,与Gen Bank中猬裂头蚴序列(KJ418421、KF990161、GQ999947)进行比对。以猪囊尾蚴感染的小鼠肌肉组织同法制作切片并提取DNA,评价cox1和ITS-1 PCR扩增的特异性。结果感染组含虫组织DNA经1次PCR即可扩增出414 bp(cox1-1)、151 bp(cox1-2)、822 bp(ITS-1)的条带。感染组无虫组织DNA第1次PCR未扩增出条带,以第1次PCR产物为模板再次PCR,扩增出相同大小的3条条带。未感染组DNA第1次和第2次PCR均未扩增出条带。序列比对结果显示,从感染组无虫组织DNA扩增的cox1-1序列与KJ418421、KF990161、GQ999947序列的同源性分别为98.2%、99.1%、99.1%。猪囊尾蚴感染组织DNA没有扩增出条带。结论以cox1和ITS-1序列为靶序列进行重复PCR,能鉴定小鼠无虫病理组织裂头蚴感染。