兔痒螨和水牛痒螨第二转录间隔区(ITS-2)基因序列分析

为了探讨水牛痒螨株和兔痒螨株的分类地位,采用PCR技术扩增了四川水牛痒螨株和四川兔痒螨株的第二内部转录间隔区(ITS-2)基因,并与GenBank中注册的5个国外痒螨株的同源基因进行了比较。序列分析发现:兔痒螨株和水牛痒螨株的序列长度分别为277bp和281bp,两序列间存在多处转换、颠换和缺失。四川水牛痒螨株同四川兔痒螨株间及国外痒螨分离株间的ITS-2基因同源性较低(87.1%～88.0%);而四川兔痒螨株与国外痒螨分离株的同源性较高(95.5%～100.0%)。用痒螨ITS-2基因构建的MP,NJ,ME及UPGM树中,兔痒螨株和水牛痒螨株在不同的系统树中其位置比较固定,且两者相距均较远。根据痒螨ITS-2基因同源性分析和系统树构建结果以及其他已报道的相关证据,作者认为:兔痒螨株和水牛痒螨株可能为痒螨属Psoroptes中两个不同的种,兔痒螨分离株为马痒螨P.equi;而水牛痒螨株与来自兔、山羊、绵羊和黄牛等痒螨株亲缘关系较远,可能为痒螨属中的另一个独立有效种。

香蕉枯萎病菌4个生理小种核糖体DNA内转录间隔区的RFLP分析

【目的】明确香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense 4个生理小种的系统发育关系。【方法】利用PCR扩增该病菌4个生理小种的核糖体DNA内转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS),利用AIu I、Hpa II和Taq I 3种限制性内切酶对这些小种的ITS产物进行RFLP分析。【结果】PCR扩增结果表明:来自4个生理小种的8个菌株均可扩增得到568 bp的ITS单一片段,但这些生理小种间的片段没有明显的多态性;对这些生理小种ITS产物进行RFLP分析发现,不同生理小种之间的差异很小。【结论】PCR-RFLP技术不适用香蕉枯萎病菌生理小种的分析鉴定。

HIV、SARS-CoV-2合并马尔尼菲篮状菌机会感染

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种RNA病毒,易变异、传染性极强。多数SARS-CoV-2感染(COVID-19)患者愈后良好,少数患者病情危重,特别是老年人和有慢性基础疾病感染者,往往预后较差,青壮年患者病情迁延不愈的情况在临床诊疗中并不常见[1]。本文报道的病例为1例青年COVID-19患者,因病情迁延不愈,多次治疗效果不佳入院。

茅莓鉴别与空心莓组ITS序列分析

目的:通过对茅莓(Rubus parvifolius L.)的鉴别,为茅莓的开发利用,质量标准制定提供理论依据。方法:采用性状鉴定、显微鉴定、薄层色谱鉴定及分子鉴定进行研究,对空心组植物ITS序列进行分析。结果:茅莓根和茎均有草酸钙簇晶、草酸钙方晶和具缘纹孔导管;叶中有两种非腺毛,一种棒状腺毛。薄层色谱可以有效鉴别茅莓。内部转录间隔区(ITS)序列作为DNA条形码,可以将52种空心莓组植物区分,得到与传统分类不同的分组,遗传距离推测绒毛叶亚组和柔毛叶亚组可能为其他亚组的祖先。结论:该结果可为茅莓及其同组植物的进一步开发利用提供参考依据。

阪崎肠杆菌实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立

目的建立针对阪崎肠杆菌的高灵敏、高特异的实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应(PCR)快速检测体系。方法根据阪崎肠杆菌基因组16SrRNA～23SrRNA的内部转录间隔区(ITS)基因和外膜蛋白A(OmpA)基因的特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用高通量实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的灵敏度;用50种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌评价该检测体系的特异性。结果实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系对阪崎肠杆菌重组质粒的检测灵敏度为1×102拷贝/反应体系;对阪崎肠杆菌基因组的检测灵敏度为4×10-1pg/反应体系;该检测体系在检测50种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现特异性扩增,整个反应在2h内完成。结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan PCR检测体系可作为阪崎肠杆菌灵敏、特异、快速的检测方法,并同时检测阪崎肠杆菌的致病力。

巢式PCR检测琯溪蜜柚黑斑病病原菌

利用特异性引物从琯溪蜜柚黑斑病菌基因组DNA中扩增出一条分子量为487 bp的特异性条带,准确地与疮痂病、炭疽病和黄斑病菌等蜜柚常发性真菌病害区分开。采用巢式PCR对该引物的检测灵敏度进行测定,结果显示,对于黑斑病菌基因组DNA,巢式PCR的检测灵敏度为100 fg/μL,灵敏度比常规PCR至少提高100倍;对于发病组织,巢式PCR可从病斑组织含量为100μg的DNA样品中检测到黑斑病菌。采用巢式PCR检测技术,可从蜜柚的黑斑病显症组织和未显症组织特异性地检测到病原菌,且检出率分别为96.67%和90%。

我国珠母贝属(Pinctada)主要种类亲缘关系的初步分析

采用核糖体DNA内部转录间隔子1(ITS1)序列初步分析了珠母贝属8个种的亲缘关系。结果表明,ITS1长度范围分布在402—474bp之间,大珠母贝的ITS1序列最长,黑珠母贝的最短。作为外群的企鹅珍珠贝ITS1长385bp。系统发育分析表明,所研究种类聚合成3个类群。类群I包括合浦珠母贝Pinctadafucata和覆瓦珠母贝P.imbricata。类群II包括白珠母贝P.albina、黑珠母贝P.nigra、长耳珠母贝P.chemnitzi和射肋珠母贝P.radiata,其中前2个种聚合成1枝,后两个种聚合成另一枝,分别形成两个亚群类群IIA和类群IIB。类群III包括珠母贝P.margaritifera和大珠母贝P.maxima。类群IIA与类群IIB之间、类群III的大珠母贝与珠母贝之间的遗传距离较近(0.080—0.100),类群I与类群II之间遗传距离较远(0.250—0.270),类群III与类群I和类群II之间的遗传距离最大(0.400—0.570)。类群I中我国的P.fucata和澳大利亚的P.imbricata之间遗传距离很小(0.000—0.013),而两者的种内遗传距离分别为0.002—0.013和0.005,种内与种间遗传距离相重叠,表明P.fucata和P.imbricata应为同种。类群IIA的P.albina与P.nigra之间的遗传距离为0.013,可能为两个亚种。类群IIB中的P.radiata与P.chemnitzi之间的遗传距离只有0.005—0.007,而本研究的P.chemnitzi的ITS1序列与GenBank中的P.chemnitzi的ITS1序列高度一致,表明P.radiata的鉴别可能有误。

两株野生侧耳属菌株鉴定及生物学特性研究

本文对采自吉林省不同寄主植物的两株野生侧耳属菌株1和菌株2进行鉴定和生物学特性研究,基于形态学和分子生物学鉴定结果表明,这2个野生菌株均为肺形侧耳(Pleurotus pulmonarius)。通过选取不同碳源、氮源以及p H对2株菌株进行培养,最终结果表明菌株1菌丝最适生长条件为蔗糖、硝酸钾、p H 6;菌株2菌丝的最适生长条件为蔗糖、硫酸铵、p H 7。

真菌性角膜炎致病菌种属的PCR鉴定

目的通过对核糖体18S rRNA基因内部转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）序列的PCR鉴定,建立快速、准确地鉴定真菌性角膜炎致病真菌种属的方法。方法采用眼科常见5种致病菌标准菌株;镜检确诊真菌阳性的角膜炎临床标本29例,其中真菌培养阳性15例,真菌培养阴性14例。所有标本均采用液氮研磨结合小玻璃珠振荡法破碎真菌细胞壁,提取真菌基因组DNA,并以此为模板PCR扩增其18S rRNA基因ITS保守区序列,进行基因测序后在基因库中查询致病菌的种属,与镜检结果比对。结果禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、燕麦镰刀菌、烟曲霉、白色念珠菌等5种标准菌株培养物和29例临床真菌样本（包括15例真菌阳性培养物和14例真菌培养阴性的角膜病变组织样本）,各5mg样品中提取的DNA样品的浓度在1.7~22.5mg·mL-1。PCR扩增后5种标准菌株均有目的条带,15例真菌阳性培养物也均有目的条带,14例真菌培养阴性的角膜病变组织样本有2例有目的条带,其余12例没有目的条带。标准菌株的PCR鉴定阳性率100%,镜检确诊真菌阳性的临床样本PCR阳性率58.6%,高于真菌培养法鉴定的阳性率51.7%。PCR产物进行基因测序后在基因库中查出了致病菌的种属,检索结果与镜检结果完全一致。结论通过核糖体18S rRNA基因ITS序列PCR鉴定真菌性角膜炎致病菌的方法特异性强,灵敏度较传统的培养加镜检法更高。若能改进从角膜病变组织中提取真菌基因组DNA的方法,其灵敏度还能进一步提高。

一种引起成年桑树根部腐烂的病害及致病菌分离与初步鉴定

对山西省运城市投产桑园内桑树发生根部腐烂、枝叶萎凋枯死病害的病原菌进行分离鉴定,为病害的有效控制提供理论依据。从桑树发病植株根部分离到一株病原菌(暂命名为TY.GF1),将该病原菌接种到健康桑树根部,其致病症状与桑根腐病的症状相似。该病原菌在PDA培养基上的培养性状及孢子形态特征与米根霉(Rhizopus oryzae)相似。通过病原菌TY.GF1的核糖体18S rDNA及内部转录间隔区(ITS)序列PCR扩增和测序,分别获得长度为1 805、627 bp的序列片段。基于18S rDNA及ITS序列构建的进化树显示,与TY.GF1菌株亲缘关系最近的为米根霉和淀粉霉(Amylomyces rouxii)。结合病原菌致病性特点及形态特征与18S rDNA、ITS序列分析结果,初步鉴定这种新发生的桑树病害为桑根腐病,其病原菌可能为米根霉。

红瑞木溃疡病病原菌的鉴定

为了明确近年来引起上海辰山植物园红瑞木上枝干溃疡病的病原菌种类,首先对病原菌分离并依据柯赫氏法则进行了致病性测定和病原菌验证,然后进行了形态学特征观察、rDNA-ITS序列分析和系统发育树构建。病原菌形态学特征与葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)一致,其rDNA-ITS序列(已提交GenBank,登录号:JN638454)与GenBank中葡萄座腔菌相似性达到99%,在系统发育树上与葡萄座腔菌处于同一分支。将辰山植物园红瑞木枝干溃疡病的病原菌鉴定为葡萄座腔菌(B.dothidea)。

基于核糖体基因分析的中华血吸虫分子种系发生研究

目的 测定中华血吸虫细胞核核糖体基因 r DNA- ITS2和 L SU序列 ,并根据这些序列 ,构建基因树 ,探讨中华血吸虫在裂体属内的系统发生位置。 方法 以 GNT- K法抽提基因组 DNA后 ,用特异引物 ,PCR扩增目的基因。扩增后的 PCR产物经纯化后克隆于载体质粒 p T- adv中再次扩增后 ,提取并纯化质粒 DNA,并以此作模板 ,使用通用测序引物 M13 (F/ R)于 L icor测序仪上进行测序。检索 Gen Bank,查找曼氏血吸虫相关血吸虫两基因序列 ,将有关血吸虫同一基因排序、比较分析后 ,以毛毕吸虫和杜氏小裂体吸虫作为外群 ,使用 PHYL IP和 MEGA以邻接法和最大简约法绘制系统发生树。 结果 克隆并测定了中华血吸虫的 r DNA - ITS2和 L SU ,毛毕吸虫的r DNA- ITS2序列 ,以及根据这些序列构建系统发生树。 结论 中华血吸虫 ITS2和 L SU基因的系统发生树结果一致 ,均提示中华血吸虫归属于亚洲血吸虫种群 。

一种引起火龙果茎病害的病原菌鉴定

对贵州省西南地区火龙果种植园发生的一种茎病害进行发病率调查，并对其病原菌进行鉴定。结果表明：该茎病害的发病率为10％-20％，病原菌显微结构观察和分子鉴定结果表明其为黑附球菌（Epicoccumnigrum）。本研究是该病原菌对火龙果危害的初次报道。

中国、日本和澳大利亚珍珠贝的ITS2序列特征分析

对中国、日本和澳大利亚的珍珠贝核糖体DNA第二内部转录间隔子(ITS2)的序列特征进行了分析。PCR扩增产物包括5.8S基因部分序列、ITS2基因和28S基因部分序列。去除引物序列后5.8S基因片段长64bp,ITS2长230～237bp,28S基因片段长249bp。共分析了16个基因型的序列特征,结果表明,5.8S和28S基因片段高度保守,仅28S有1个碱基位点突变;而ITS2变异大,237个比对位点中有20个位点发生突变,其中12个位点为缺失/插入突变,4个简约信息位点。在碱基组成中,5.8S和28S的GC含量(58.1%～59.4%)高于AT含量,也高于ITS2的GC含量(51.3%～52.0%),ITS2的GC含量与AT含量相差不大。碱基组成中5.8S的A碱基含量较低,28S的T碱基含量较低,存在较大的碱基偏倚性。3个地理群体内和群体间的遗传距离都很小(0.010～0.013),且相互重叠。从基因型数据看,3个群体既有各自独立的基因型,也有共享基因型。但从序列的碱基变异数据看,3个群体没有各自独有的突变位点。上述结果表明,3个地理群体既具有丰富的遗传多样性,又具有高度的遗传一致性,即亲缘关系近,可能存在基因交流,或者分化时间不长。丰富的遗传多样性有利于合浦珠母贝的遗传选育。

高产紫杉醇内生真菌J11的鉴定

从南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)的幼茎中分离出一株产紫杉醇内生真菌J11.菌株J11的发酵提取物经高分辨质谱分析,证实J11菌株可产紫杉醇.提取该菌株的基因组DNA,扩增核糖体internal transcribed spacer(ITS)和28S核糖体large subunit rRNA gene(LSU)序列,经测序获得该菌的ITS序列和LSU序列.序列比对和检索结果表明,J11菌株为葡萄座腔菌(Botryosphaeria ssp.)属中的一个新菌株.形态学鉴定符合葡萄座腔菌属特征,高效液相色谱分析表明,J11菌株的紫杉醇含量约为615.1μg/L.本研究首次证实葡萄座腔菌J11是一株高产紫杉醇野生型菌株,具有潜在的应用前景.

ITS结合RPS0两步PCR快速鉴定临床5种假丝酵母菌

目的:建立快速准确鉴定常见假丝酵母菌种类的基因检测技术。方法:提取假丝酵母菌基因组DNA;第一步PCR用通用引物扩增ITS基因;第二步三重PCR用种特异性引物扩增RPS0基因;分别对已知及未知样本检测、验证。结果:ITS基因扩增,光滑假丝酵母菌(Cg)和克柔假丝酵母菌(Ck)分别得到与预期结果吻合的881bp和419bp的PCR产物;白假丝酵母菌(Ca)、热带假丝酵母菌(Ct)和近平滑假丝酵母菌(Cp)的ITS扩增片段均略大于500bp;RPS0三重PCR对Ca、Ct和Cp DNA扩增,分别得到约310bp、147bp及110bp的片段,与预期结果相符;30株已知假丝酵母菌两步PCR检测结果,种类符合率为100%;43株未知样本两步PCR鉴定结果,经RPS0扩增产物序列测定,符合率亦为100%。结论:建立了ITS通用基因结合RPS0种特异基因鉴定5种常见假丝酵母菌种类的两步PCR技术,该技术简单、快速、准确及廉价;对双重感染患者更有鉴别优势,有临床应用价值。

ITS-RFLP分析进行昆虫病原线虫斯氏属和异小杆属的分类鉴定

本研究通过PCR扩增和六种限制性内切酶 (AluⅠ、HinfⅠ、MboⅠ、RsaⅠ、HaeⅢ和PvuⅡ )酶切 ,对国内害虫防治上常用的几种昆虫病原线虫 ,包括斯氏属S.car pocapsae、S.feltiae和S.glaseri以及异小杆属H .bacteriophora、H .zealandica、H .indicus和H .megidis等 8个品系rDNA -ITS进行分析 ,建立起可以区分各线虫种的标准RFLP图谱。该方法快速简便、稳定可靠 ,需要的样品量少 ,可以用于新鲜的、或冻存的样品 ,甚至分析单条的线虫。不仅可进行昆虫病原线虫的快速分类鉴定 ,而且进一步可以应用于线虫田间释放的辅助监测 ,实际田间感染率的测定和线虫毒力的比较。

珠母贝属的系统发育:核rDNA ITS序列证据

珠母贝属(Pinctada)的一些种类是生产海水珍珠的重要母贝,个别种类已濒临灭绝。本文利用核糖体DNA内部转录间隔区1(ITS1)和2(ITS2)序列对珠母贝属常见种类的系统发育和分类地位进行了分析。结果表明:ITS1长410–482bp,其中Pinctadamaxima最长,P.fucata,P.fucatamartensii,P.imbricata和P.nigra最短。ITS2长210–249bp,其中P.albina和P.nigra最长,P.maxima和P.margaritifera最短。碱基替换的同质性检测发现,P.maxima、P.margaritifera和P.chemnitzi的碱基替换格局存在显著性差异,前二者的GC含量显著高于其他种,在进化上可能比较原始;而P.chemnitzi可能发生过染色体重排事件,可能是新近形成的种。系统发育分析表明,所研究的种类可分成3个类群:类群I包含P.fucata、P.fucatamartensii和P.imbricata;类群II包含P.albina、P.nigra、P.chemnitzi和P.radiata;类群III包含P.maxima和P.margaritifera。在类群I中,我国的P.fucata、日本的P.fucatamartensii和澳大利亚的P.imbricata的种间遗传分化不明显,可能为同种,根据命名优先原则应以P.imbricata命名该种为宜。类群II中P.albina和P.nigra可能是两个亚种,而GenBank中的P.radiata(AY144603)可能是P.chemnitzi的误定。类群III(P.maxima和P.margaritifera)分化较早,与碱基替换格局的检测结果相符。

基于ITS2序列诊断临床深部真菌感染的初步研究

目的建立以ITS2为靶序列的PCR方法诊断临床深部真菌感染,并进行初步研究。方法用通用引物扩增纯菌落和临床标本的ITS2区域,对PCR产物测序,测序结果在GenBank中进行Blastn等分析,以此来鉴定真菌属种。结果 10种常见致病性真菌纯菌落和10例临床标本的DNA测序结果均与表型鉴定符合。结论以ITS2为靶序列的PCR可成为临床快速诊断深部真菌感染的重要方法之一。

穿刺引流液中病原性真菌的ITS测序研究

目的探讨内部转录间隔区(ITS)测序用于快速检测穿刺引流液中病原性真菌的价值。方法采用临床常见的14种细菌和4种真菌及人类基因组DNA验证真菌通用引物(ITS1/ITS4和ITS3/ITS4)的特异性和敏感性;采集90例临床疑似真菌感染患者的穿刺引流液标本10mL,其中8mL用于常规真菌培养,剩余2mL用于提取真菌DNA并分别用ITS1/ITS4和ITS3/ITS4作为引物进行扩增,将阳性扩增产物测序并与BLAST比对,将测序法与培养法的阳性率结果进行统计学比较。结果14种细菌及人类基因组扩增产物均为阴性,4种真菌扩增产物为阳性。ITS3/ITS4和ITS1/ITS4的最低检测限分别为102CFU/mL和103 CFU/mL。90例标本培养阳性率为4.44%(4/90),测序法阳性率为12.22%(11/90),二者差异具有统计学意义(P<0.05)。结论引物ITS1/ITS4和ITS3/ITS4的特异性良好,后者较前者扩增敏感性更高;测序真菌ITS区可作为临床快速检测穿刺引流液中病原性真菌感染的方法。