合成酮内酯类3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B糖多孢红霉菌M的构建

大环内酯类抗生素基因工程是近年来研究的一个新领域 ,迄今已合成了 10 0多种新的聚酮类化合物。以糖多孢红霉菌A2 2 6基因组DNA为模板 ,用重叠PCR方法扩增出去除KR6酶域DNA的约 3 2kbDNA片段 ,克隆于pWHM3载体 ,构建了同源重组质粒pWHM2 2 0 1。PEG介导原生质体转化法将pWHM2 2 0 1转入糖多孢红霉菌A2 2 6 ,并整合于染色体红霉素合成基因位点。整合体在R3M斜面上生长两代后 ,制备原生质体涂R3M平皿。利用PCR鉴定筛选出 8株KR6敲除的突变体糖多孢红霉菌M(1 8)。ZabsPecFab质谱鉴定 ,证实糖多孢红霉菌M1合成了 3 脱氧 3 羰基 红霉内酯B 。

两亲性带羰基官能团聚己内酯嵌段共聚物的合成与表征

将带有羰基官能团的4-羰基己内酯(OPD)和ε-己内酯分别在甲氧基聚乙二醇(MPEG,Mn=5000)为引发剂,异辛酸亚锡为催化剂溶液和本体体系中开环聚合,合成了两亲性侧基带有羰基官能团的聚己内酯嵌段共聚物(MPEG-b-P(OPD-co-CL))。1HNMR结果表明采用溶液聚合法合成的聚合物各峰的峰位置和分裂情况与理论一致,证明了产物是实验所设计的嵌段共聚物,而采用本体聚合法合成的聚合物由于温度的影响,聚合物各峰的峰位置发生了变化,说明其结构发生了变化;差示扫描量热法分析结果表明随着OPD单体含量的增加,聚合物的熔点,玻璃化转变温度和熔融焓增加;热失重测试结果表明OPD单体的引入增加了聚合物的热敏感性。实验结果表明采用溶液聚合可以成功的合成两亲性官能团化聚己内酯嵌段共聚物,而本体聚合由于其反应温度高,所得到聚合物容易发生热降解。

β-苄氧羰基-β-丙内酯的合成

以L-苹果酸与乙酰氯反应生成环状酸酐,酸酐开环同时通过苄醇酯化保护羧基,再经Mitsunobu反应环化得到β-丙内酯,并对其结构进行了鉴定。

青蒿素类化疗研究的近展

1972年中国学者从青蒿(Artemisia annua L.)分离提取出抗疟有效成分青蒿素(Qinghaosu QHS;Artemisinin)可以说是传统中草药青蒿进入现代化疗研究的新纪元。随后陆续研究了不少青蒿素的衍生物,其中以蒿甲醚(Artemether AM)与青蒿琥酯(Artesunate AS)应用为多。在QHS的构效关系中发现一些过氧链变成醚键的化合物均无效,提示其分子中过氧键是发挥抗疟药效的必需基因。另外,保留QHS分子的环骨架部分而使内酯羰基还原,并引进侧链,则抗疟活性提高,如AM与AS即为例证。

红色糖多孢菌M合成3-脱氧-3-羰基-赤酮酸内酯B的限速因子研究

目的探讨红色糖多孢菌KR6基因突变体生物合成3-脱氧-3羰基-赤酮酸内酯B(DOEB)产量显著降低的原因。方法以KR6基因突变体M菌株为研究对象,采用相对实时荧光定量RT-PCR技术、抗原-抗体检测技术和高分辨LC-MS分析技术等,分别从基因的转录水平、翻译水平以及聚酮化合物水平等层面研究了DOEB的生物合成量。结果红色糖多孢菌M菌株与出发菌株A226相比,两者聚酮合酶(PKS)基因簇在转录水平和翻译水平上的表达差异均非造成DOEB产量降低的限速因子;而DOEB的前体转化能力却大幅度降低,因此,DOEB合酶的活力降低是造成生物合成DOEB产量降低的关键因素。结论 DOEB合酶的活力是生物合成DOEB的限速因子,本研究为进一步探讨利用基因工程途径提高新酮内酯类化合物产量奠定了基础。

3-羟甲基四氢呋喃的合成研究

介绍了呋虫胺的重要中间体3-羟甲基四氢呋喃的合成和国内目前采用的合成路线,并加以改进,以丙二酸二乙酯为原料,在醇钠作用下与环氧乙烷缩合,再用硼氢化钾还原两步反应制得目标产物,在缩短了反应步骤的同时,还通过使用价格相对低廉的原料,将制备成本大幅下降,总收率由文献报导的30.2%提高到52.5%,有利于工业化生产。

经由3-乙酰基-2-丁烯内酯烯醇醚与胺类衍生物区域选择性制备烯胺酮

在乙醇溶液中具有烯醇醚结构的3-乙酰基-4-甲氧基-2-丁烯内酯和3-(1-甲氧基亚乙基)-4-羰基-2-丁内酯与不同的胺类衍生物发生区域选择性加成-消除反应生成一系列新的稳定的烯胺酮结构衍生物.它们的化学结构经~1H NMR、^(13)C NMR、X射线衍射和高分辨质谱的确证.其中生成的3-(1-胺基亚乙基)-4-氧代-2-丁内酯类化合物存在明显的Z/E两种异构体.同时对制备反应中产生的副产物结构也进行了确证.

糖多孢红霉菌λC3-SRR突变体的构建及其产物鉴定

目的 :构建糖多孢红霉菌KR6酶域基因失活突变体 ,探讨SRR氨基酸相应 9核苷酸去除突变体与合成酮内酯类化合物 3 脱氧 3 羰基 红霉内酯B的关系。方法 :以糖多孢红霉菌基因组DNA为模板 ,用重叠PCR技术扩增出缺少SRR氨基酸相应 9核苷酸的KR6酶域DNA片段 ,并克隆到载体pWHM3上 ,构建了同源重组质粒pWHM3 SRR。将pWHM3 SRR质粒转化糖多孢红霉菌λC3菌株 ,筛选出质粒整合到染色体上红霉素合成基因位点的整合体λC3 A、B和C。λC3 A在无硫链丝菌肽 (Thio)的R3M斜面上生长两代后 ,制备的原生质体涂R3M平皿 ,挑选出不能在含Thio的R3M斜面上生长、发酵液也无抑制枯草芽孢杆菌活性的突变菌株λC3 SRR。结果 :部分基因组DNA序列分析表明 ,糖多孢红霉菌λC3 SRR染色体上SRR氨基酸相应 9核苷酸已经敲除 ,ZabspecFab质谱分析证实λC3 SRR菌株合成了 3 脱氧 3 羰基 红霉内酯B。结论 :糖多孢红霉菌KR6酶域SRR氨基酸相应 9核苷酸敲除的λC3 SRR突变菌株可以合成 3 脱氧 3 羰基 红霉内酯B ,SRR为KR6酶域上NADPH 2′ 磷酸结合位点。

红色糖多孢菌A226-YA突变体构建及产物分析

目的:用红色糖多孢菌(前称糖多孢红霉菌)KR6突变体合成酮内酯类化合物3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B,同时,KR6突变体不合成红霉素。方法:以红色糖多孢菌A226基因组DNA为模板,用重叠PCR技术扩增KR6酶域中Tyr2699密码子TAC突变为A la密码子GCC的1 000 bp DNA序列,克隆到载体pWHM3上构建同源重组质粒pWHM3-YA。将pWHM3-YA转化到A226中,并整合到红霉素合成基因座,经染色体二次重组后筛选TAC突变为GCC的突变体A226-YA,再进行突变体A226-YA产物分析。结果:通过染色体同源重组,构建了红色糖多孢菌突变菌株A226-YA,Zabspec Fab质谱分析结果显示A226-YA突变体合成了3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B,而没有检测到红霉素。结论:突变Tyr2699能有效失活KR6,但3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B的产量较低。

红色糖多孢菌A226-SP突变体构建及代谢产物分析

目的:构建红色糖多孢菌突变菌株,生物合成酮内酯类抗生素。方法:利用反向PCR技术,扩增红色糖多孢菌KR6酮还原酶基因突变DNA片段SP(KR6酶中Gly1141Ala1142替换成SerPro),克隆于pWHM3上构建染色体同源重组质粒pWHM3-SP。通过PEG介导原生质体转化,将pWHM3-SP导入红色糖多孢菌中。经染色体二次重组后,筛选出1株红色糖多孢菌KR6酶突变菌株A226-SP。结果:DNA序列分析表明,A226-SP染色体上编码KR6酶中Gly1141Ala1142序列GGTGCG突变成SerPro编码序列AGCCCT。HPLC-HRMS分析证实A226-SP菌株合成了3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B(DOEB),同时检测到其中间产物C18H34O6,但没有发现红霉素产物。结论:Gly1141Ala1142位于KR6酮还原酶的重要功能位点,红色糖多孢菌A226-SP突变体可以合成酮内酯类化合物。