艾叶多糖对小鼠腹腔巨噬细胞内酶活性的影响

目的研究艾叶多糖对体外巨噬细胞内酶活性的影响。方法制备艾叶多糖,灌洗法提取小鼠腹腔巨噬细胞,并对其进行纯化,用不同浓度的艾叶多糖与巨噬细胞共孵育48 h后行酸性磷酸酶(ACP)、非特异性酯酶(NSE)和琥珀酸脱氢酶(SDH)的酶化学染色,光学显微镜直观地观察各组巨噬细胞胞内酶的活性。结果与对照组比较,艾叶多糖中浓度组巨噬细胞的ACP和NSE活性均明显增强,高浓度组巨噬细胞的ACP、NSE和SDH活性均明显增强。结论一定浓度的艾叶多糖能增强体外培养巨噬细胞胞内酶活性。

考马斯亮蓝染色双向电泳凝胶胶内酶切方法的改进

介绍一种简便高效的从考马斯亮蓝染色的双向电泳凝胶切取蛋白质点,通过胶内酶切制备基质辅助激光解吸 电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)样品的方法。该方法操作简便,样品的质谱鉴定结果经网上数据库检索检出率 可高达80％以上,适于我国目前小规模蛋白质组学研究的国情,便于推广应用。

一种适用于质谱分析的简化胶内酶解方法

在常规方法的基础上,设计了一种适于质谱分析的简化胶内酶解方法。改进的步骤包括:(1)通过加大洗涤所用超纯水量、延长涡混时间来强化凝胶洗涤的环节;(2)加入酸化处理来提高胰蛋白酶的活性;(3)在预酶解时不加CaCl_2,减少了酶的自切作用;(4)省略了蛋白质样品脱盐、脱SDS的步骤;(5)直接吸取酶解液进行质谱分析。系统比较该简化酶解法和最新报道的一种酶解方法的质谱鉴定效果,简化法能有效减少酶解后肽段的损失,增加质谱数据库搜索的信息量,得到更可靠的蛋白质鉴定结果。

真核细胞顺乌头酸酶活性检测新技术——胶内酶活性分析法

顺乌头酸酶(aconitase,Aco)是细胞内重要的铁硫蛋白酶,它催化细胞内柠檬酸经中间产物顺乌头酸生成异柠檬酸.真核细胞中顺乌头酸酶有两种,分别定位在细胞质的顺乌头酸酶1(cAco)和定位在线粒体的顺乌头酸酶2(m-Aco).检测它们活性的变化能敏感地反映出细胞中能量代谢、自由基产生、铁硫簇组装及铁代谢水平的改变.顺乌头酸酶活性的传统检测方法通常是测定细胞中总的顺乌头酸酶活性,该方法难以准确区分出c-Aco和m-Aco各自的活性变化.因此我们建立一种胶内酶活性分析法检测顺乌头酸酶活性.该方法利用非变性电泳技术将c-Aco和m-Aco浓缩分离,通过泡染底物显色,条带颜色深浅反映了酶活性的强弱.同时,比较了胶内酶活性分析法和分光光度法检测细胞内c-Aco和m-Aco的活性,并对比检测了过氧化氢处理细胞前后Aco活性的变化.结果显示,这两种方法均可敏感地检测出Aco的活性改变,并有广泛的细胞系实用性,但胶内酶活性分析法可区别测定c-Aco和m-Aco活性,不需繁琐的细胞质和线粒体分离,简便易行.文中介绍的线粒体分离纯化技术也为线粒体功能深入研究提供了一个快速、高效的分离纯化方法.

非离子去污剂提高双向电泳银染后胶内酶切的效率

目的改进二维凝胶电泳银染色后的胶内酶切方法,提高蛋白质的鉴定率。方法应用超高效纳升液相色谱-电喷雾串联质谱(HD-MS),对改进方法 (酶切中加入非离子去污剂正十二烷-β-D-麦芽糖苷)和原有方法进行比较。结果 2D胶上的10个蛋白质斑点中的蛋白质用两种方法均得到明确的鉴定结果,但60%的蛋白质用改进方法鉴定的氨基酸序列覆盖率较原有方法明显提高。结论改进后的方法简便,适用于凝胶为基础的蛋白质组学研究。

小分子表面活性剂在胶内酶切增效中的应用

本研究成功地将一种有机小分子表面活性剂RapiGest SF（Waters）用于改进电泳分离的蛋白质的鉴定效率。通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI—TOF—MS）的肽质量指纹谱，考察了酶切时间、加入量、加样次序、点靶方法对方法灵敏度、蛋白质鉴定率的影响。RapiGest SF浓度为0．5％～1％，在酶切之前加入可获得更多的肽段峰和更高的鉴定率。本方法考染体系的总灵敏度为332fmol，银染体系为664fmol。比较了RapiGest SF与MALDI—TOF—MS和电喷雾质谱（ESI—MS）兼容性，未观察到明显的负影响。方法操作简便，重复性较好，适合鉴定电泳分离的低丰度蛋白质。

牛精子蛋白胶内酶切条件优化及问题分析

针对银染蛋白的胶内酶切质谱鉴定成功率较低的技术现状,对影响牛精子蛋白酶切鉴定的酶量、酶切时间、凝胶存储时间等影响因素进行了摸索,并优化了挖点、脱色、脱水、酶切消化和抽提肽段等操作细节,同时对质谱峰图中出现的污染问题进行了分析解决,提高了蛋白鉴定的成功率,为牛精子蛋白质的质谱鉴定奠定了技术基础。

高浓度酶快速胶内酶解技术用于磷酸化蛋白质组学分析

聚丙烯酰胺凝胶电泳是一项高效的蛋白质分离技术,通过与质谱技术联用,可以鉴定成千上万的蛋白质点。但是,复杂繁琐的操作流程限制了它在蛋白质组学研究方面的广泛应用。本研究表明,高浓度的胰蛋白酶并不会影响胶内酶解后磷酸化肽段的富集,反而可以实现快速高效的蛋白酶解,据此建立了一种快捷、高效的蛋白质酶解方法。首先,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳,对50μg复杂蛋白样品进行分离,分成5个组分;然后,选择高浓度胰蛋白酶酶解30 min;最后,运用固定钛离子亲和色谱小柱离心法富集磷酸化肽段。经液相色谱-串联质谱分析,成功鉴定到约2000个磷酸化位点,而传统方法则只鉴定到不足1500个位点。实验表明,在高浓度胰蛋白酶的促进作用下,胶内酶解过程在0.5 h内即可以完成,并且得到比对照组更高的磷酸化位点的鉴定量和更低的酶解漏切率,而传统方法需要16 h。这也证实了本方法不仅可以加速酶解反应,同时还能提高蛋白酶解效率。

蛋白质胶内酶切技术研究进展

胶内酶切是蛋白质组研究中衔接电泳分离和质谱鉴定的重要环节,对最终的蛋白质定性和定量分析结果有显著的影响。该技术自1992年初步建立以来,一直处于不断完善中,出现了种类繁多的改进方案。为了更有效地利用胶内酶切技术,从凝胶脱色、杂质去除、蛋白酶切、肽段提取4个方面归纳整理了近年来蛋白质胶内酶切技术的主要研究进展。

超声辅助胶内酶切方法的优化及其酶切特点的分析

分别应用20、100和200 W超声功率对牛血清白蛋白以及人尿蛋白组的胶内条带进行胶内酶切,通过比较不同功率鉴定的多肽数和蛋白数,确定最优的超声功率。同时比较超声辅助酶切与传统过夜酶切方法,并分析超声辅助胶内酶切方法的特点。结果表明,超声功率为20W时对胶粒破坏最小,样品损失最少,在牛血清白蛋白样品中鉴定的多肽数最多为65。在人尿蛋白组2个条带中,20 W方法鉴定的蛋白数分别为168和199,鉴定效果最优。通过对多肽误切率和不完全酶切多肽的定性和定量分析发现,超声酶切方法的误切率高于传统方法,但不完全酶切率较低。通过分析多肽误切位点发现,传统过夜酶切法和超声辅助酶切法的主要误切类型分别为脯氨酸(P)和天冬氨酸/谷氨酸(D/E),3种超声方法之间各种误切类型所占比例均无明显差别。超声辅助酶切可显著缩短蛋白质胶内酶切时间,其中20 W功率超声酶切的效果最佳。与传统过夜酶切法相比,超声辅助酶切多肽的鉴定结果更好,其多肽的误切率更高,不完全酶切率较低,可用于发现蛋白质组学研究。

用于质谱鉴定蛋白质胶内酶解方法的优化

【目的】提高蛋白质胶内酶解效率,减少萃取过程中肽段的损失,增加质谱鉴定的成功率。【方法】在常规胶内酶解方法的基础上,优化脱色、酶解、萃取等步骤,包括:用铁氰化钾和硫代硫酸钠对银染胶块脱色,酶解温度提高至55℃,以40mmol/L碳酸氢铵作为酶切缓冲液,使用50%乙腈(ACN)水溶液3步萃取;并使用一步法胶内酶解探索快速胶内酶解方法。【结果】使用铁氰化钾和硫代硫酸钠可在短时间内将银染胶块完全脱色,55℃温浴可使酶切时间由20h减少为2h,以40mmol/L碳酸氢铵作为酶切缓冲液,可省去ZipTip脱盐步骤。优化后,质谱鉴定率提高30.0%(绝对值),且能明显高酶切效率,使目标肽段更高丰度地呈现出来。【结论】优化后的胶内酶解法可显著提高蛋白质胶内酶解的质谱鉴定成功率和肽段覆盖率,其中一步法胶内酶解法有效减少了胶内酶解时间和步骤,可用于高丰度蛋白质的快速质谱检测。

针麻与蓝斑、缝际核内酶及递质的关系——定量的组织化学观察

选用192只成年、健康、雄性大白鼠分成电针组及对照组:电针组针刺手三里及环跳;对照组不加电针。测痛后,立即杀死动物,用组织化学的方法观察了蓝斑、缝际背核的儿茶酚胺、单胺氧化酶及乙醯胆碱酯酶的反应;并用显微光度计度进行了定量测定。针刺后大部分动物痛阈升高,但电针组蓝斑内儿茶酚胺及单胺氧化酶则未见有明显的增高。测定了针刺组及对照组蓝斑内AChE的量:与对照组比较,蓝斑以及其单细胞内AChE量都有非常显著的增强;但少量针刺而痛阈未升高动物的蓝斑内AChE未见有明显变化。电针组缝际背核内AChE阳性细胞数比对照组有非常明显的增多。实验结果支持了我们的假设:针刺可以影响中枢神经系统某些重要核团内神经递质及生物酶参与机体某些功能调节及镇痛作用。

改进的质谱兼容的胶内酶切方法

目的:改善胶内酶切的肽段回收率,提高蛋白质的有效鉴定率。方法:将改进的胶内酶切“四步提取法”,应用到96个双向电泳蛋白质斑点分析。结果:该方法提高了胶内蛋白质酶切肽段的回收率,改善了质谱图谱的质量。蛋白质的有效鉴定率达89.6%,其中,数据库检索得分80分以上者达82%。另外,证实了酶解原液直接用于质谱分析可获得较好信噪比的谱图。结论:应用“四步提取法”使得酶解肽段提取率和蛋白质的有效鉴定率明显提高。

SINPV基因组酶切图谱及多角体基因的序列分析

用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＸａｂＩ、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＨｉｄｎⅢ、Ｓｍａｌ酶解斜纹夜蛾核多角体病毒广州株基因组ＤＮＡ，分别得到２６、２６、２４、２０、１３、１７、９、１条片段，并算得基因组平均大小为１３６．０ｋｂｐ。以ＡｃＮＰＶ多角体基因的部分读码框为探针，经Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交将ＳＩＮＰＶ多角体基因定位于ＸｂａＩＯ片段上。将此片段克隆并序列分析，结果表明ＳＩＮＰＶ的多角体基因位于ＸｂａＩ Ｏ片段的ＸｂａＩ－ＳａｌＩ ０．８ｋｂｐ片段上，其开放读码框为７５０ｂｐ，编码一２４９ａａ的蛋白质，与ＳｐｌｉＮＰＶ相同，为目前所发现的最长的多角体基因。ＳＩＮＰＶ多角体蛋白Ｍｒ＝２９２３６，其氨基酸序列与其它核多角体病毒的多角体蛋白氨基酸序列有高度的同源性。

血清二胺氧化酶测定的临床应用进展

二胺氧化酶（diamine oxidase;DAO,E.C.1.4.3.6）是存在于哺乳动物小肠的黏膜或纤毛上皮细胞中催化二胺的细胞内酶,它可通过调节细胞内的离子平衡、影响传导通路、促进细胞修复,对肠黏膜具有保护作用[1]。小肠黏膜屏障功能衰竭时或肠黏膜细胞坏死时血清DOA升高,因此,血液中的DOA活性可反映肠道损伤状态[2,3]。

大肠杆菌中一种新类型的超广谱β-内酰胺酶

出现于北京协和医院的一耐头孢噻甲羧肟的临床分离菌株大肠杆菌(E.coli 5518),含有一约7.5kb的耐药质粒,编码产生一种新类型的超广谱β-内酰胺酶(ESbla).除了头霉甲氧噻吩和亚胺硫霉素外,产酶菌株对所测定的多种β-内酰胺类药物都耐药.该菌株耐β-内酰胺类药物的特性可接合传递给E.coli JP559菌株,与之一起转移的还有耐氨基糖甙类和磺胺类药物的特性.β-内酰胺酶抑制剂棒酸能抑制此酶的活性.此ESbla基因既不与SHV-1也不与TEM-1的结构基因片段杂交.

运动提高血清酶活性的细胞机制

运动尤其是耐力运动能显著地提高血清酶的活性,这是许多研究者的共同结果。而且,不同的血清酶在各种不同方式的运动中所表现的活性提高的时相、幅度以及恢复的时间是不相同的。目前,有关血清酶研究普遍关注的问题是血清酶活性提高的机制问题。对于安静时组织细胞释放酶入血的机理至今并未完全清楚。但是,对某些组织器官的病变如心肌梗塞、肝细胞坏死、恶瘤、肌炎以及肌营养不良等因素明显影响血清酶水平的认识,无疑可以推测在这些情况下。

用于质谱分析的细胞总蛋白三种酶切方法比较

目的比较无去污剂的细胞总蛋白三种酶切样品制备方法。方法采用细胞吸入胶内酶切法、蛋白吸入胶内酶切法及超滤管辅助溶液酶切法对细胞总蛋白进行酶切,再用液质联用技术对三种酶切方法制备的多肽样品进行蛋白鉴定。结果通过液质联用技术鉴定,细胞吸入胶内酶切法制备的样品获得3835个蛋白,蛋白吸入胶内酶切法制备的样品获得2340个蛋白,超滤管辅助溶液酶切法制备的样品获得4248个蛋白。韦恩图分析显示,不同酶切方法得到的蛋白种类存在差异。对细胞吸入胶内酶切法和超滤管辅助溶液酶切法所获得的蛋白进行基因本体(geneontology,GO)分析发现,细胞吸入胶内酶切法能获得更多膜结合蛋白。结论三种无去污剂酶切方法,避免了去污剂的种种弊端,其中超滤管辅助溶液酶切法和细胞吸入胶内酶切法更优。

一种改进的凝胶分离后蛋白质溶液酶解方法

报道了改进的凝胶电泳分离后蛋白质溶液酶解方法。将凝胶分离后的蛋白转移到PVDF膜上,直接用碳酸氢铵中和从膜上的蛋白洗脱溶液至弱碱性,并在此溶液中直接进行蛋白酶解。方法避免了胶内杂质对质谱鉴定蛋白质的干扰。用标准蛋白进行了验证,并在此基础上鉴定了中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞系中的16个蛋白点。与已报道的方法比较,本方法蛋白回收率提高到90%左右;与传统的胶内酶解方法比较,本方法具操作简单,实验流程较短;涉及的试剂较胶内酶解少,因此带来的杂质影响小;在蛋白转印以后还可与许多其它实验方法相结合,比如免疫印迹等优点。

7种中药对乳源产β-内酰胺酶葡萄球菌的抑菌作用

用煎煮法制备石榴皮等7种中药原液对分自乳源的产β-内酰胺酶葡萄球菌,采用平板稀释培养法进行了抑菌效果的测定,结果表明:6种中药对产β-内酰胺酶葡萄球菌均有不同程度的抑菌作用,其中石榴皮、大黄抑菌效果最好,最小抑菌浓度为3.90 mg/mL;其次是黄芩、黄连,最小抑菌浓度分别为15.62 mg/mL、31.25 mg/mL;连翘、茵陈的抑菌作用较弱,最小抑菌浓度均为250.00 mg/mL;杜仲对产β-内酶胺酶葡萄球菌没有抑菌作用。