人肝再生增强因子融合蛋白表达载体的构建

目的 :克隆人肝再生增强因子的cDNA并构建谷胱甘肽巯基转移酶 -人肝再生增强因子 (GST -hALR)融合蛋白表达载体。方法 :根据人肝再生增强因子核苷酸序列 ,从人胎肝cDNA文库中扩增到hALRcDNA ,亚克隆于pUC18载体 ,核苷酸序列测定证实为hALR ;将hALRcDNA亚克隆于 pGEX - 4T质粒 ,转化大肠杆菌JM10 9,筛选阳性克隆酶切鉴定。结果 :重组阳性克隆经酶切鉴定证实重组片段已正确插入相应酶切位点 ,片段与PCR扩增片段大小相同 ,碱基序列正确。结论 :GST -hALR融合蛋白表达载体的成功构建 。

重组人肝再生增强因子在体外能刺激HTC肝癌细胞DNA合成

在成功克隆人肝再生增强因子（hALR）CDNA的基础上，本研究将人ALR编码区cDNA亚克隆于真核瞬间表达质粒pCDNAⅠ，构建了真核表达质粒pCDNAⅠ－hALR，转染cos-7细胞后，表达产物生物活性检测表明：真核表达的hALR在体外能刺激HTC肝癌细胞增殖，这一体外活性的确定为重组人ALR的纯化提供了简洁、可靠的检测方法。

重组人肝再生增强因子可预防免疫损伤性肝纤维化的形成

观察重组人肝再生增强因子（ｒｈＡＬＲ）对免疫损伤性肝纤维化的预防作用。建立人血白蛋白免疫损伤性大鼠肝纤维化模型。在造模的同时予ｒｈＡＬＲ腹腔注射。观察大鼠存活率，血清ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＬＤＨ水平，肝组织胶原蛋白含量及肝脏病理学改变。结果：ｒｈＡＬＲ可提高人血白蛋白免疫损伤性肝纤维化大鼠存活率；降低肝纤维化大鼠的ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＬＤＨ水平；病理检查显示ｒｈＡＬＲ有明显减轻大鼠肝纤维化形成的作用；肝组织胶原蛋白含量的测定也表明ｒｈＡＬＲ预防组大鼠肝组织胶原蛋白含量明显低于模型组及阴性对照组。结论：重组人肝再生增强因子可预防免疫损伤性肝纤维化的形成。

阻断肝再生增强因子的表达对人肝癌细胞株HepG2增殖的抑制作用

背景与目的:前期研究中已发现人肝再生增强因子(humanaugmenterofliverregeneration,hALR)在肝癌细胞中呈高表达,在正常肝细胞中几乎不表达,并在体外能刺激肝癌细胞株增殖,而对正常肝细胞无影响。本研究通过运用hALR的siRNA和hALR单克隆抗体阻断人肝癌细胞株HepG2表达,探讨hALR对细胞增殖的影响。方法:设计、构建siRNA表达质粒pSIALR-A及其阴性对照质粒pSIALR-B。将构建的pSIALR-A和pSIALR-B分别转染HepG2细胞。荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,以计算转染效率。转染48h后,免疫细胞化学及RT-PCR法检测HepG2细胞中hALR的表达。用3H-TdR掺入法检测hALR的siRNA和特异性单克隆抗体对HepG2细胞增殖的影响。结果:HepG2细胞中有hALR的表达。成功构建了针对hALR基因编码区的siRNA表达质粒pSIALR-A。转染入细胞后发现,pSIALR-A能明显抑制hALR的表达(mRNA的表达量减少83%),而随机序列的siRNA却无此作用。hALR的siRNA在体外能显著抑制人肝癌细胞株HepG2增殖,分别转染质粒pSIALR-A和pSIALR-B后HepG2细胞的cpm值为67687±6548和104807±5713(P<0.05)。抗hALR单克隆抗体特异性地阻断hALR的作用后,可部分抑制肿瘤细胞自主性生长(P<0.05)。结论:HepG2细胞高表达hALR;针对hALR的siRNA能显著、特异性地抑制hALR表达,进而抑制HepG2细胞的生长。抗hALR单克隆抗体也能部分抑制HepG2细胞自主性生长。

肝部分切除后肝再生增强因子信使核糖核酸(mRNA)表达增强

肝再生增强因子（ALR）是一种新的肝增殖刺激因子。本研究选择70％肝部分切除（PH）大鼠为模型，观察了PH后残存肝组织胞浆液促肝细胞增殖活性与ALR特异mRNA表达动态变化的关系。发现正常肝组织几无ALRmRNA表达，其肝胞质液也无促肝细胞增殖活性；70％PH后12h肝组织AthmRNA表达明显增加，并于术后24h达高峰，肝胞质液活性也于术后24h内达高峰，这种mRNA表达一效应的时间关系提示：ALR可能是一种重要的生理性肝再生调控因子。

人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达

目的从人胎肝cDNA文库中克隆出人肝再生增强因子(human augmenter of liver,regeneration,hALR),并实现hALR在毕赤酵母中的表达方法利用PCR从胎肝cDNA文库中扩增出与文献报道序列一致的ALR cDNA,亚克隆到pPIC9K的α因子下游并置于AOX1启动子控制下,构建成含有ALR基因的酵母表达载体转化酵母细胞后,挑选出能在浓度为4.0g·L^(-1)的G418平板上生长的His^+的重组酵母,利用PCR鉴定是否插入了hALR基因.重组酵母的表达在甲醇培养中进行,并利用SDS-PAGE分析hALR的表达.结果 PCR从胎肝cDNA文库中扩增出与文献报道序列一致的ALR cDNA,实现了其在酵母中的整和表达结论 hALR在毕赤酵母中的表达是可行的.

IPTG诱导浓度对重组人肝再生增强因子基因表达的影响

以人肝再生增强因子(humanaugmenterofliverregeneration,hALR)基因与含有T7启动子的融合表达载体pET28a(+)相连的重组子(pET-A)作为研究对象,转化大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG作为诱导剂,分析比较不同IPTG诱导浓度对于表达产物的影响,以确定最佳的IPTG诱导浓度。结果表明,当IPTG终浓度为1.0mmol·L-1时,hALR表达量最大。这为IPTG作为诱导剂最终应用于重组基因工程药物的工业化生产提供了可靠的实验依据。

重组大鼠再生增强因子救治急性肝衰竭的实验研究

肝再生增强因子是一种新的肝细胞增殖刺激因子。在本实验利用我们自行表达的重组大鼠肝再生增强因子，观察了其对四氯化碳诱导的急性肝功能衰竭大鼠的救治作用。初步结果表明：重组肝再生增强因子能够显著提高中毒大鼠的存活率，降低中毒大鼠外周血ＡＬＴ，ＡＳＴ的水平。提示重组肝再生增强因子可能应用临床治疗严重肝病。

肝再生增强因子对大鼠脾单个核细胞增殖及IL-2产生能力的影响

目的:通过体外实验探讨rALR对脾脏单个核细胞是否具有直接的免疫调控作用和作用特点。方法:以3H-TdR掺入法检测脾脏单个核细胞在不同处理情况下的增殖状况:①不同剂量的rALR与5μg/ml ConA同时加入;②5μg/ml ConA预刺激脾脏单个核细胞10和32小时后,再加入30μg/ml rALR;③30μg/ml rALR预处理脾脏单个核细胞至30小时,再加5μg/ml ConA刺激。以环孢霉素A作为阳性对照,以转空质粒的酵母表达上清提取物作为阴性对照。以放免法检测培养上清中IL-2分泌情况。结果:不同剂量的rALR与ConA同时加入时,能以剂量依赖方式明显抑制ConA对脾脏单个核细胞的促增殖作用。ConA预刺激脾脏单个核细胞10、32小时后,再给予30μg/ml rALR仍可明显抑制脾脏单个核细胞的增殖,但用30μg/ml rALR预处理脾脏单个核细胞至30小时,并不影响脾脏单个核细胞对ConA刺激的反应能力。ConA+rALR(30μg/ml)组的IL-2分泌在24小时明显低于ConA组。结论:rALR对ConA活化的脾脏单个核细胞增殖有明显的抑制作用,而对未活化的脾脏单个核细胞则无明显影响,提示未经抗原激活的免疫细胞可能不表达ALR受体。

大鼠肝再生增强因子基因组DNA的克隆化与序列分析

根据大鼠肝再生增强因子 (Augmenterofliverregeneration ,ALR)cDNA序列设计特异性引物 ,采用多聚酶链反应 (PCR)法自Wistar大鼠基因组DNA中扩增出大鼠ALR基因组DNA ,全长为 15 0 8nbp ,结构为 3个外显子和 2个内含子 ,外显子长度分别为 18bp、197bp和 16 3bp ,各编码 6个、6 4个和 5 5个氨基酸残基 ,长度与小鼠、人类ALR的外显子一致。

肝再生增强因子的cDNA克隆、表达及表达产物的生物活性研究

以肝部分切除后再生肝组织为起始材料，利用RT-PCR扩增出大鼠肝再生增强因子（ALR），亚克隆于pGEM-T载体，核苷酸序列测定证实为大鼠ALR；将ALRcDNA亚克隆于pBV220质粒，构建了原核表达栽体，并获高效表达菌株，特异表达蛋白占细菌总蛋白的15％，原核表达的ALR在体外缺乏促进大鼠原代培养肝细胞及SMMC-7721肝癌细胞DNA合成的活性，但在体内1／3肝部分切除模型中可刺激肝细胞DNA合成；ALR在生物学活性方面与肝脏刺激物（HSS）存在一定差别，ALR和HSS应是两种不同的活性因子．ALR还具有促肝损伤修复的作用，对其深入研究可能为临床治疗严重肝病提供有效的药物.

同种肝细胞移植细胞排斥反应机理及肝再生增强因子的作用

目的探讨同种异体肝细胞腹腔内移植治疗急性肝衰竭大鼠的细胞排斥反应机制及肝再生增强因子(ALR)的免疫作用。方法采用D-氨基半乳糖诱导大鼠急性肝衰竭(ALF),诱导后24h,随机分成5组。Ⅰ组:注射生理盐水;Ⅱ组:单纯移植肝细胞;Ⅲ组:肝细胞移植联合CsA;Ⅳ组:肝细胞移植联合ALR;Ⅴ组:注射ALR;肝细胞和药物均腹腔内注射。观察大鼠的存活率、组织学改变、移植肝细胞存活情况,检测大网膜CD4、CD8、CD68。结果Ⅳ组存活率显著高于Ⅰ组(66.7%vs0%,P=0.001),余组间无差异。Ⅳ组移植肝细胞存活时间更长。d1-2大网膜CD68阳性率Ⅱ组高于Ⅰ、Ⅳ组;CD4、CD8阳性率Ⅰ、Ⅱ组均高于Ⅳ、Ⅴ组,且Ⅱ组CD4阳性率高于Ⅲ组。d14大网膜CD4、CD8、CD68阳性率各组间无差异,但Ⅳ组CD4、CD8、CD68阳性率d1-2均低于d14的,Ⅱ组CD68阳性率d1-2高于d14的。结论同种肝细胞腹腔内移植联合ALR能提高ALF大鼠的存活率,同种肝细胞移植能引起CD4、CD8、CD68介导的细胞免疫,ALR能有效的抑制同种异体细胞免疫,促进移植肝细胞存活和增殖。

肝再生增强因子对外原性抗原引起机体免疫应答影响的研究

目的研究rALR对HBsAg及BSA免疫大鼠产生抗体、细胞因子和对脾脏细胞增殖的影响。方法甲醇诱导表达rALR,测定活性并进行以下研究。①rALR对HBsAg免疫的影响:实验分为:生理盐水、HBsAg20μg/只、HBsAg20μg+rALR100μg/kg、HBsAg20μg+rALR25μg/kg、HBsAg20μg+pPIC9K表达上清、HBsAg20μg+CsA10mg/kg,共6组;②rALR对BSA免疫的影响:实验分为:生理盐水、BSA25μg/只、BSA25μg+rALR100μg/kg、BSA25μg+pPIC9K表达上清、BSA25μg+CsA10mg/kg,共5组。以上均皮下注射免疫大鼠,1次/周×4次,ELISA检测血清中相应抗体、IL-2和IFN-γ。③rALR对大鼠脾细胞增殖的影响:Wistar大鼠先皮下注射HBsAg(20μg/只)1次,2周后处死,分离脾单核细胞,种板,再加HBsAg1μg/孔和/或相应处理因素(rALR、空质粒表达产物等),48h后加3H-TdR,12h后收集细胞,检测cpm值。结果rALR100μg/kg+HBsAg组的8只动物中,有2只出现抗HBs的抗体,空质粒对照组和单用HBs Ag组8只动物均出现抗HBs。rALR100μg/kg+BSA组的8只动物中,有3只出现抗BSA抗体,空质粒对照组和单用BSA组8只动物均出现抗BSA的抗体。rALR100μg/kg能明显抑制细胞因子IL-2及IFN-γ的产生。rALR4μg体外能明显抑制脾细胞的增殖。结论rALR能抑制HBsAg和BSA诱导大鼠产生相应抗体及IL-2、IFN-γ的产生;体外能抑制经体内致敏的脾细胞的增殖,说明rALR有免疫抑制作用。

调节性T细胞在肝再生增强因子免疫抑制机制中的作用研究

目的观察人肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)对体外活化的单个核细胞中调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的增殖、分化及抑制性细胞因子TGF-β1、IL-10表达水平的影响,探讨ALR的免疫抑制机制。方法梯度离心分离正常人外周血单个核细胞(human peripheral blood monoclear cells,PBMCs),分为对照组(Control组)、ConA刺激组(ConA组)和人ALR(hALR)干预组(ConA+hALR组)。ConA组和ConA+hALR组分别给予ConA(5μg/mL)和hALR(30μg/mL)处理,对照组不处理。各组作用60 h后,2-对磺酸基苯基-3-(4,5-二甲基噻唑)-5-(3-羧甲氧基苯基)-二氢四唑嗡盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,inner salt,MTS]检测各组细胞增殖情况,流式细胞术检测各组CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞比例和细胞周期变化,Real-time PCR检测各组FoxP3 mRNA的表达,ELISA检测各组上清中细胞因子TGF-β1、IL-10浓度。结果 hALR能明显抑制ConA活化的PBMCs的增殖(P<0.01);与ConA组和Control组相比,hALR能显著增加CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞占CD4+T细胞的比例(P<0.01)和FoxP3 mRNA的表达(P<0.01),并且hALR能够解除ConA引起的Treg细胞周期G2/M期的阻滞(P<0.01)。此外,与ConA组和Control组相比,ConA+hALR组上清中TGF-β1和IL-10的浓度明显升高(P<0.01)。结论hALR可以通过诱导Treg细胞的增殖、分化以及促进TGF-β1和IL-10的产生,从而达到免疫抑制的作用。

肝再生增强因子研究进展

肝再生增强因子是新近克隆的蛋白质因子 ,能特异地刺激肝源细胞的增殖 ,并对CCl4 所引起的急性肝衰竭有救治作用。本文综述了肝再生增强因子的发现、基因克隆及组织分布等。目前已开始了该因子的基因工程产品研制 。

不同剂量不同载体不同途径的肝再生增强因子重组质粒抗大鼠肝纤维化疗效比较

目的筛选肝再生增强因子重组质粒基因治疗时较优的载体、途径和剂量及三者的最佳组合。方法制备肝纤维化大鼠模型,L9(33)正交设计分组,用3种不同的载体(裸基因、脂质体、多聚物)携带不同量(50、100、200μg/kg)的肝再生增强因子重组质粒,采用3种给药途径(肌肉注射、静脉注射、腹腔注射)对模型大鼠进行干预,通过肝组织病理学、肝纤4项等指标来判断疗效并进行对照。结果剂量因素:200μg/kg组纤维化半定量计分和肝纤4项综合得分明显低于50μg/kg组和100μg/kg组,但50μg/kg组和100μg/kg组的结果无显著性差异。载体因素:裸基因组、脂质体组和多聚赖氨酸组3组之间的纤维化半定量计分均无显著性差异。脂质体组和多聚赖氨酸组的肝纤4项综合得分均明显低于裸基因组。途径因素:肌肉注射组、静脉注射组和腹腔注射组3组之间的纤维化半定量计分均无显著性差异。腹腔注射组的肝纤4项综合得分明显高于肌肉注射组和静脉注射组。结论200μg/kg的肝再生增强因子重组质粒的抗大鼠免疫性肝纤维化的疗效优于100μg/kg和50μg/kg;由脂质体携带DNA和由多聚物携带DNA的疗效明显优于裸DNA。肌肉注射和静脉注射的疗效明显优于腹腔注射。由脂质体或多聚物携带、静脉或肌肉注射200μg/kg的肝再生增强因子重组质粒,能取得较好的抗大鼠免疫性肝纤维化的疗效。

肝再生增强因子抑制肝非实质细胞TGF-β_1表达的意义

目的探讨肝再生增强因子(ALR)促进受损肝细胞增殖的机制。方法采用免疫组化方法检测ALR对肝星状细胞和Kupffer细胞(KC)中TGF-β1表达的影响,Westernblot法检测ALR对肝星状细胞表达TGF-β1的影响,细胞增殖试验(MTT法)观察经ALR刺激的大鼠肝星状细胞条件培养液(ICCM)、KC条件培养液(KCCM+)对受损肝细胞增殖的影响以及ALR对TGF-β1抑制受损肝细胞增殖的作用。结果经ALR刺激后肝星状细胞和KC中TGF-β1免疫反应阳性信号减弱,Westernblot显示ALR可抑制肝星状细胞表达TGF-β1。受损肝细胞经ICCM和KCCM刺激后增殖明显。ALR可拮抗TGF-β1对受损肝细胞增殖的抑制作用。结论ALR可能通过抑制肝星状细胞和KC表达TGF-β1来促进受损肝细胞增殖。

肝再生增强因子在急性肾衰大鼠模型肾组织中的表达及意义

目的 探讨在庆大霉素所致急性肾衰大鼠肾组织中肝再生增强因子 (ALR)的表达部位、表达量变化及其与肾小管上皮细胞增生的关系。方法 建立由庆大霉素所致的中毒性急性肾衰大鼠模型 ,采用免疫组织化学方法检测实验第 4、6、8、12、16、2 1天肾组织中肝再生增强因子的表达和分布情况以及小管上皮细胞增生程度。结果 ALR在正常肾组织内主要表达于髓质区的髓襻、远曲小管和集合管 ;在实验第 4天除了在上述部位表达增强外 ,在皮质区损伤和再生的近端小管上皮细胞有弱表达 ,第 8天在上述部位表达最强 ,第 12天在皮、髓质区表达开始下降 ,至 2 1d几乎恢复到正常水平 ;在正常及肾衰大鼠肾小球内未见ALR表达。对照组肾小管上皮细胞增生指数 (PI)为 0 .6 % ,实验组第 4、6、8、12、16、2 1天的PI分别为 10 .4 %、17.4 %、34.2 %、19.2 %、8.4 %、3.8%。皮质、髓质区ALR表达阳性的面积与小管上皮细胞PI成正相关 (r分别为 0 .913和 0 .95 4 ,P <0 .0 1)。结论 ALR在庆大霉素所致中毒性急性肾衰大鼠肾脏组织表达明显增强 ,且与肾小管上皮细胞增生程度成正相关。提示肝再生增强因子参与了中毒性急性肾衰的病理改变过程 ,其作用可能与肾小管上皮细胞再生有关。

肝细胞移植联合肝再生增强因子治疗大鼠急性肝功能衰竭的研究

目的探讨同种异体肝细胞腹腔移植联合肝再生增强因子(augmenter of liver regenration,ALR)对D-氨基半乳糖(D-gal)诱导的急性肝功能衰竭大鼠的治疗作用。方法采用D-gal诱导大鼠急性肝功能衰竭,诱导后24h,59只大鼠随机数字表法分成4组。Ⅰ组15只:腹腔注射生理盐水;Ⅱ组15只:经腹腔移植2×107肝细胞,以后腹腔注射生理盐水;Ⅲ组15只:经腹腔移植2×107肝细胞,同时腹腔注射ALR50μg.kg-1.d-1;Ⅳ组14只:腹腔注射ALR50μg.kg-1.d-1。观察大鼠的存活率、肝脏功能、移植肝细胞存活情况、病理变化。结果Ⅱ组、Ⅲ组大鼠存活率(46.7%、66.7%)显著高于Ⅰ组(0.0%)(P=0.006;P=0.0002),Ⅲ组(66.7%)与Ⅳ组(14.3%)有显著差异(P=0.008),其他组间无明显差异(P>0.05)。移植后第1、2天Ⅱ组腹水AST高于Ⅲ组(P=0.001),Ⅱ组第1、2天腹水ALT高于Ⅳ组,Ⅱ组、Ⅲ组第1、2天腹水TBil高于Ⅰ组(P<0.05)。Ⅲ组肝脏病理改变轻于其他组。Ⅲ组大鼠腹腔移植的肝细胞存活数多于Ⅱ组。结论同种异体肝细胞经腹腔移植联合ALR可明显改善D-gal诱导的肝衰竭大鼠的存活率,促进移植肝细胞存活和增殖,促进肝组织及功能恢复。

肝再生增强因子重组质粒对肝纤维化大鼠的实验治疗作用

目的 研究肝再生增强因子真核表达质粒对免疫性肝纤维化大鼠的治疗作用并探讨其分子机制。方法 制作猪血清诱导的免疫性肝纤维化大鼠模型,将成模大鼠随机分成模型组、秋水仙碱治疗组(Col)、ALR治疗1组(ALR1 )、ALR治疗2组(ALR2 ) ,分别给予生理盐水、秋水仙碱、pcDNA3 ALR重组质粒治疗。用药4周后处死大鼠,留取血标本和组织标本,免疫组织化学测定Ⅰ、Ⅲ型胶原、TIMP 1和ALR在肝组织的表达,RT PCR测定TIMP 1mRNA的表达。结果 两个ALR治疗组的肝纤维化分级明显改善。免疫组化结果显示,Ⅰ、Ⅲ型胶原和TIMP 1在肝组织的表达在两个ALR治疗组明显低于模型组,而ALR的表达要明显强于模型组。TIMP 1mRNA在两个ALR治疗组肝组织中的表达明显低于模型组。结论 ALR重组质粒对免疫性肝纤维化大鼠有改善作用,并可能通过抑制TIMP 1活性表达而促进肝细胞外基质降解。