动物克隆核再程序化有关机理的研究进展

近年来 ,动物克隆技术发展迅速 ,不断有新的克隆动物面世。面对克隆效率、克隆动物存活率低的客观事实 ,人们对克隆有关机制做了很多探讨。在移植核的再程序化过程中 ,某些胞浆因子如核质原等在解除已分化细胞核染色质的抑制中发挥了关键的作用 ,同时移植核发生印记基因及非印记基因的去甲基化和重新甲基化的现象 ,这种染色质抑制作用的解除及基因的甲基化现象与移植核的去分化有着密切的联系 ,但其具体机制还不清楚。核移植技术中 ,供核与受体胞质的协调和核再程序化的关系得到大量研究 ,目前普遍认为为了使核再程序化进行得更完全 ,MⅡ期卵母细胞质是适宜的受体 ,而处于G0期或G1期的体细胞核是合适的核供体。

皮肤源性再程序化神经干细胞的制备以及定向分化为神经细胞的体外研究

目的:研究制备皮肤源性再程序化神经干细胞以及诱导其定向分化为神经细胞的可行性。方法:体外培养大鼠皮肤来源前体细胞(skin-derived precursors,SKPs)并纯化、鉴定,用含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒载体系统作为基因转染工具,将第3代SKPs分3组:A组为慢病毒载体介导neurogenin2(Ngn2)基因转染的SKPs;B组为空载体慢病毒转染的SKPs;C组为未进行慢病毒介导基因转染的SKPs;7天后加入无生长因子含10%胎牛血清的诱导培养基诱导7天。光镜下观察比较各组细胞形态变化以及免疫荧光镜下研究各组SKPs诱导后定向分化为神经细胞的差异。结果:A组SKPs转基因后到第7天绿色荧光达到高峰,并可持续稳定表达绿色荧光至第8代;诱导7天后绝大部分细胞类似神经细胞,胞体呈梭形或椭圆形,有多个突起伸出;免疫荧光结果显示90.98%细胞表达微管相关蛋白-2(MAP-2),62.23%细胞表达神经元特异性蛋白NeuN。B组SKPs在空病毒转染7天以后有绿色荧光;诱导7天以后大多数细胞较诱导前无明显变化;免疫荧光结果显示,有34.35%的细胞表达MAP-2,无神经元特异性蛋白NeuN的表达。C组SKPs无绿色荧光;诱导7天以后大多数细胞较诱导前无明显变化;免疫荧光结果显示,29.54%的细胞表达MAP-2,无神经元特异性蛋白NeuN的表达。结论:慢病毒介导Ngn2基因转染SKPs可以制备出皮肤源性再程序化的神经干细胞,并提高其定向分化为神经细胞的能力。

核移植后的细胞核再程序化机制研究进展

目前动物克隆技术体系极待完善 ,其极低的成功率及克隆动物普遍存在的早衰、早夭现象是阻碍研究深入进行的首要问题 ,其突破的关键在于对核移植后的细胞核再程序化机制的阐明。从移植核在结构上的重塑、移植核与受体卵细胞质所处的细胞周期及其相互作用、重构胚与两性胚在分子水平的变化等多方面研究表明 :受体细胞质的环境对于细胞核的再程序化至关重要 ,处于有丝分裂各时期的细胞作为核供体一旦移植到卵母细胞后 ,移植核在卵质环境里将出现结构上的重塑和分子的再程序化 ;移植核与受体卵间细胞周期的相容性、重构胚的染色体倍性的正确与否 ,可能是决定重构胚发育率高低的重要因素 ;合子型基因激活是基因表达再程序化的关键事件之一 ;印记基因对于体细胞克隆动物移植核的再程序化过程可能起着非常独特的作用。

兔移核重构胚再程序化相关基因片段的分离与鉴定

用单个植入前胚胎mRNA差别显示方法 (SinglePreimplantationEmbryonicmRNADifferentialDisplayReversePolymeraseReaction ,SPEDDRT PCR) ,以家兔移核重构发育至 2细胞、8细胞时期的胚胎及囊胚作为起始材料。研究家兔移核重构胚再程序化相关基因的表达。获得了 2 5个与再程序化相关的基因片段 ,完成了对所有片段的克隆、序列分析 ,其中 5个反向Northern证实的片段在从MⅡ到囊胚的发育阶段中呈现特异性表达的特点。这项研究为再程序化相关基因全长的分离以及功能研究奠定了良好的基础。

再程序化脂肪源性干细胞的制备及体外定向分化为神经元的实验研究

目的制备再程序化脂肪源性干细胞以及探索诱导其定向分化为神经元的方法。方法体外培养脂肪来源干细胞(ADSCs),取纯化、鉴定过的第3代ADSCs接种于24孔板中并分A,B,C三组:A组为带有绿色荧光基因(GFP)的慢病毒载体介导Neurogenin2(Ngn2)基因转染的ADSCs,制备再程序化脂肪干细胞;B组为带有GFP的空载体病毒转染的ADSCs;C组为未进行慢病毒介导基因转染的ADSCs;转基因7d后加入含细胞生长因子诱导培养基诱导分化15d。光镜下观察各组细胞形态变化以及免疫荧光研究各组ADSCs诱导后定向分化为神经元的差异。结果与B组和C组相比,A组ADSCs转基因后再经诱导分化15d后绝大部分细胞类似神经元,胞体呈梭形或椭圆形,有两个或三个突起伸出,细胞表达神经丝蛋白NF、神经元特异性蛋白NeuN及神经元特异性烯醇化酯酶NSE比例大大提高。B组与C组的神经元分化效率,无显著差异,P>0.05。结论慢病毒介导Neurogenin2基因体外转染ADSCs可以制备出再程序化脂肪源性干细胞,诱导后具有更强的定向分化为神经元的能力。

再程序化星形胶质细胞的制备及体外定向分化为神经元的研究

目的探讨再程序化星形胶质细胞制备并在体外诱导其分化为神经元。方法在体外培养大鼠脑皮质来源星形胶质细胞(astrocyte),随后将提纯、鉴定过的第三代星形胶质细胞接种于12孔培养皿中,并分为A、B、C 3组。其中A组为带有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体介导neurogenin2(Ngn2)基因转染的星形胶质细胞,制备再程序化星形胶质细胞;B组为带有GFP基因的空载体病毒转染的星形胶质细胞;C组为未进行慢病毒介导基因转染的星形胶质细胞;转基因1周后加入含细胞生长因子诱导培养基诱导分化15 d,光镜下观察各组细胞形态变化以及定向神经元分化的差异。结果 A组星形胶质细胞转基因后再诱导15 d,很大部分细胞形态呈神经元样改变,胞体呈梭形或椭圆形,有多个突起伸出且突起较长,表达神经元核蛋白(Neu N)、神经丝蛋白(NF)及神经元特异性烯醇化酶(NSE)的比例大大提高,相比B组及C组,差异有统计学意义(均P<0.05);而B组与C组神经元分化比例的差异无统计学意义(P>0.05)。结论慢病毒介导Ngn2基因体外转染星形胶质细胞可制备出再程序化星形胶质细胞,诱导后具有更强的向神经元定向分化能力。

应用小鼠早期胚胎活性因子诱导小鼠成纤维细胞再程序化为多能干细胞的实验研究

目的:研究并建立应用早期胚胎活性因子诱导成体细胞再程序化的实验体系。方法:通过体外受精方法大量收集小鼠3.5 d囊胚,从小鼠囊胚中提取早期胚胎蛋白,加入到小鼠成纤维细胞培养体系中,诱导其再程序化为多能干细胞。对得到的多能干细胞采用PCR鉴定Oct3/4基因表达;在诱导多能干细胞分化为脂肪细胞和成骨细胞后,采用油红O及茜素红染色确定其多向分化潜能。结果:诱导再程序化后获得的多能干细胞能够长期传代培养,表达干细胞特异性基因Oct3/4,采用油红O及茜素红染色确定其具有向脂肪和成骨诱导分化潜能。结论:本研究成功应用小鼠囊胚活性因子诱导小鼠成纤维细胞再程序化生成小鼠多能干细胞。

线粒体对iPSC再程序化的影响

iPS技术的出现为研究疾病的发病机制、药物筛选以及再生医学提供了新的途径。尽管iPS技术取得了迅速的发展,但对于iPS重编程过程目前仍不清楚。线粒体是细胞的多种生理过程的重要参与者,而其与iPS再程序化过程有什么联系,起到什么样的作用仍有待研究。

再程序化脂肪干细胞体外定向神经分化效率和机制

目的探讨再程序化脂肪干细胞（adipose—derived stem cells，ADSCs）体外定向神经分化的效率和机制。方法体外培养大鼠ADSCs并纯化、鉴定，将第3代ADSCs分为三组：未进行慢病毒介导基因转染ADSCs组（空白组）；不含神经元生成素-2（neurogenin-2，Ngn2）基因慢病毒空载体转染ADSCs组（空病毒组）；慢病毒载体介导Ngn2基因转染ADSCs组（Ngn2组）；各组细胞均用含细胞生长因子的诱导培养基诱导15d。免疫荧光检测各组细胞神经元特异性蛋白（NeuN）阳性表达以观察神经元分化效率；Western blot检测各组细胞Mash1、Hes1、Dll1蛋白表达水平的差异，探索分化机制。结果诱导培养基诱导15d后，Ngn2组、空病毒组、空白组阳性表达NeuN分别为90．12％、45．34％、40．26％，各组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。Western blot结果显示，Ngn2组Dll1蛋白表达水平明显高于空病毒组和空白组（P〈0．01），Mashl、Hesl蛋白表达水平明显低于空病毒组和空白组（P〈0．01）；空病毒组和空白组Dll1、Mash1和Hes1蛋白表达差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论再程序化ADSCs诱导后神经元分化的比例较单纯ADSCs提高近99％，再程序化ADSCs定向分化神经元机制可能是通过上调Dll1蛋白水平，同时下调Mash1、Hes1蛋白水平，抑制notch信号通路，从而促进细胞的定向神经分化。

兔植入前移核胚中发育相关基因的差异表达分析

与早期胚胎发育相关的一些重要基因异常表达致使克隆胚细胞核的再程序化过程受阻,是导致动物克隆失败的重要原因.为了分离鉴定再程序化相关基因,我们改进了mRNA差异显示技术,成功地建立了单胚差示技术体系.以不同发育时期的兔克隆胚(MⅡ卵、2细胞、4细胞、8～ 16细胞克隆胚胎)为材料进行单胚差示,分离了 80个差异片段.经反向RNA印迹验证、亚克隆、序列分析及NCBIGenBank数据库检索,结果表明:A0 2 8片段与CstF3基因有 93%的同源性,在早期胚胎发育过程中的表达有阶段特异性,该基因在兔克隆胚的早期发育过程中起重要作用.RNA印迹显示:该基因在所检测的组织中,只在卵巢中有表达.

后生遗传修饰及其对动物克隆的影响

近年来 ,不断有新的哺乳动物和两栖类动物被成功克隆 ,但这并不能掩盖克隆效率过低和克隆动物异常的现实 ,为了解决这一问题 ,人们对克隆机理进行了大量研究。高度分化的体细胞核在去核的卵质中去分化和再程序化不完全是导致动物克隆失败的主要原因 ,而去分化和再程序化不完全主要是由于基因组去甲基化不充分和过早再甲基化引起克隆胚中甲基化水平比正常胚中偏高所至 ,这可引起一些重要基因的异常表达 ,尤其是印记基因。这些机制的研究对提高克隆效率有着重要意义。

动物克隆的机理与研究进展

对动物克隆的理论基础进行了探讨 ,综述了在动物克隆时 ,供体核的基因组再程序化的可能作用机制。对动物克隆尤其是哺乳动物克隆研究进展进行了深入的总结和分析。并对其应用前景作了展望。

动物克隆的机理及其潜在问题

目前动物克隆技术因应用低效和后代生长发育异常等缺陷而受到限制,问题的根源在于对动物克隆机理缺乏了解。文章对此进行了简要阐述,其中包括细胞周期、线粒体命运、X染色体失活以及供体核的基因组再程序化,并对克隆技术潜在的问题做出了说明。

动物克隆研究进展

动物克隆随着"多莉"羊的诞生而逐渐受到人们的关注。动物克隆的核心是细胞核的再程序化。从动物克隆的技术流程、理论基础以及应用领域等方面作一综合论述。

动物体细胞克隆机理的几个关键问题

动物体细胞克隆技术是目前生物技术领域研究的热点之一,其科学意义和应用价值重大,本文对动物体细胞克隆的理论基础进行了探讨,阐述了再程序化过程中Ca2+、MPF、DNA的甲基化重要作用,以及核质互作的机理。

鱼类核移植与重编程

鱼类核移植是动物克隆研究的一个重要领域,我国学者在上世纪60年代首创了鱼类的核移植研究。以斑马鱼为模式动物,进行核移植与再程序化研究具有独特的优势。文章总结了鱼类细胞核移植研究的历史、斑马鱼核移植研究概况、以及影响核移植胚胎发育的因素,特别是核移植胚胎基因组的表观遗传修饰,如基因组DNA甲基化及组蛋白乙酰化和甲基化等的研究,将有助于完善克隆技术并提高克隆的成功率,推动克隆技术的广泛开展和应用。

动物克隆的机理及其潜在问题

1克隆的含义克隆是指由一个细胞或个体以无性方式重复分裂或繁殖所形成的一群个体。克隆动物即动物的无性繁殖,就是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中,使后者不经精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育成个体,使得核供体的基因得到完全复制。2动物克隆技术研究现状2.1胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植是指用显微手术法将单个胚胎细胞导入去除染色质的成熟卵母细胞,电融合后发育成胚胎。

动物克隆的机理及其潜在问题

目前动物克隆技术因应用低效和后代生长发育异常等缺陷而受到限制,问题的根源在于对动物克隆机理缺乏了解。本文对此进行了简要阐述,其中包括细胞周期、线粒体命运、X染色体失活以及供体核的基因组再程序化,并对克隆技术潜在的问题做出了说明。

获得多能干细胞的方法和新进展

直接从病人体内获得多能干细胞是再生医学研究的最终目标之一。将体细胞转化为多能干细胞的再程序化方法已经被广泛研究。本文综述了将分化细胞再程序化为多能干细胞的四种方法:核移植、细胞融合、培养和限定性因子诱导。从分子和功能水平上论述了不同方法中细胞再程序化的鉴定标准。我们下一步研究目标应该着眼于从分子和生物学水平上彻底解密细胞再程序化的机制,以期为干细胞研究者进行更深入的研究提供借鉴。