再闷过程影响淡豆豉炮制工艺研究

目的优化淡豆豉的发酵炮制工艺,明确再闷过程是淡豆豉发酵炮制中不可缺少的重要环节。方法按《中国药典》2010年版制法结合古法炮制,以总异黄酮及大豆苷元和染料木素质量分数为考察指标,结合成品性状（色泽、气味、皱缩程度以及断面和硬度）为感官指标,优化炮制过程中再闷前（包括蒸煮时间、发酵温度、发酵时间）和再闷过程（包括再闷温度、再闷时间）的炮制工艺参数。结果优化的炮制工艺为黑大豆在吸尽药液后蒸煮1.5 h,（30±2）℃条件下发酵6~8 d至黄衣上遍;洗去黄衣后,置于容器内,用水密封,进入再闷过程：置于温度为（30±2）℃的培养箱内再闷12~15 d。再闷期间每3天倒出,翻动,稍晾干,反复4~5次,最后略蒸,干燥。经过再闷的淡豆豉其品质较未经再闷过程的淡豆豉具有明显优势,其成品具有芳香气味,色泽光亮,质地柔软,断面为棕黑色,表皮皱缩;总异黄酮及大豆苷元和染料木素质量分数也达到最高值。结论再闷过程是淡豆豉发酵炮制中不可缺少的重要环节,是影响淡豆豉主要化学成分量和成品性状改变的关键因素,优化后的淡豆豉炮制工艺将为指导淡豆豉规范化生产、研究淡豆豉的发酵炮制机制奠定基础。

淡豆豉炮制过程中不产毒黄曲霉菌的分布特征及其对产毒菌的拮抗作用

目的明确淡豆豉Sojae Semen Praeparatum炮制中不产毒黄曲霉菌Aspergillus flavus的分布特征及其拮抗能力。方法按实验室前期已建立的规范炮制工艺制备淡豆豉,获取淡豆豉炮制中9个不同时间点的样本,各样本用氯硝胺18%甘油培养基(DG-18)进行培养、分离纯化,经形态学初筛、分子生物学鉴定为黄曲霉菌。通过紫外荧光法初筛和超高效液相色谱-串联质谱法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)测定黄曲霉菌产毒能力,确定为不产毒黄曲霉菌(简称:不产毒菌)。用平板对峙法检测不产毒菌及其代谢产物对产毒黄曲霉菌标准株(产毒菌)生长的影响。结果从淡豆豉炮制过程中共筛选出21株不产毒菌,其中“黄衣上遍”过程中的第3、6天分别筛选出3、6株,“再闷”过程中的第3、6、9天分别筛选出2、7、3株,再闷第6天筛选到的不产毒菌最多。不产毒菌对产毒菌的生长抑制率在26.75%~36.69%,抑制效果最好的是F6-L8(指第1批在“黄衣上遍”阶段的发酵第6天样品中筛选到的第8株疑似黄曲霉菌),为36.69%,发酵上清液对产毒菌的抑制率在14.29%~43.23%,抑制效果最好的是Z3-X1(指第2批在“再闷”阶段的第3天样品中筛选到的第1株疑似黄曲霉菌),达43.23%。结论淡豆豉炮制过程中存在不产毒黄曲霉菌,且在炮制的不同时间点其数量变化呈现“上升-下降-再上升-再下降”的独特趋势,不产毒菌及其发酵液具有抑制产毒菌生长的作用。为进一步研究不产毒黄曲霉菌在淡豆豉炮制过程中的作用、黄曲霉毒素污染的生物防控提供实验依据。

PCR-DGGE技术研究淡豆豉炮制过程中微生物菌群的动态变化

目的采用PCR-变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术研究淡豆豉Sojae Semen Praeparatum炮制过程中微生物菌群的动态变化,为揭示其炮制机制奠定基础。方法运用PCR-DGGE技术研究淡豆豉炮制不同时间的样本中细菌、真菌菌群种类和数量的动态变化,通过非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)聚类分析各炮制时间点的菌系差异。结果发酵至"黄衣上遍"过程中细菌种类丰富,真菌以曲霉菌为主;再闷过程中细菌以乳杆菌为主,真菌以隐球菌为主。发酵第1天恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌占优势;发酵第3天嗜麦芽寡养单胞菌、鞘氨醇杆菌属和米曲霉为优势菌种;发酵第6天解淀粉芽孢杆菌、曲霉菌和丝孢酵母为优势菌种;再闷第3天以枯草芽孢杆菌、丝孢酵母和黑曲霉占优势;再闷第9天以枯草芽孢杆菌、那须乳杆菌、弧形乳杆菌和隐球菌为优势菌株;再闷第15天以枯草芽孢杆菌、弧形乳杆菌、隐球菌、丝孢酵母属和2株不可培养真菌为优势菌。整个炮制过程中,产酸克雷伯氏菌、枯草芽孢杆菌、弧形乳杆菌作为优势菌种始终参与。"黄衣上遍"阶段与再闷阶段的微生物群落结构差异大。发酵第3天与第6天的细菌、真菌群落结构相似度最高,分别达76.4%和66.1%;而发酵第3、6天与再闷第9天的细菌群落结构相似度均最低,仅为24.5%,发酵第3天与再闷第15天真菌群落结构相似度最低,仅11.2%。结论炮制过程中微生物群落结构的动态变化和独特的微生物种类可能决定了淡豆豉特有的性味、功能,同时也从微生物学角度印证了再闷的重要性。

淡豆豉炮制中γ-氨基丁酸含量测定及其抗抑郁作用研究

目的检测淡豆豉炮制过程中各样本γ-氨基丁酸(GABA)含量并研究其抗抑郁作用。方法应用柱前在线衍生-高效液相色谱技术测定原料黑大豆(H)、发酵第6天(F6)、再闷6 d(Z6)、再闷15 d(Z15)样本水煎液中GABA含量;将昆明种小鼠随机分成对照组、模型组、盐酸氟西汀(阳性对照,0.01 g/kg)组、GABA(0.0128 g/kg)组、H(1.52 g/kg)组、F6(1.52 g/kg)组、Z6(1.52 g/kg)组和Z15低、中、高剂量(0.76、1.52、3.04 g/kg)组,采用单笼饲养加慢性温和不可预知性应激(CUMS)制备小鼠抑郁模型,各组在造模同时开始ig给药,每日应激前1 h给药,连续28 d。检测各组小鼠体质量、糖水偏好、敞箱、悬尾、强迫游泳等行为学指标的变化。结果H和F6样本水煎液未检出GABA,Z6、Z15样本的GABA质量分数分别为5.559、8.421 mg/g。与对照组比较,模型组小鼠的体质量、糖水偏好、跨格数和直立数均显著减少(P<0.01),悬尾及游泳不动时间显著增加(P<0.05、0.01),表明CUMS抑郁模型制备成功。与模型组比较,盐酸氟西汀组、GABA组、Z6组和Z15高剂量组糖水偏爱度、敞箱实验跨格数和直立数均显著增加(P<0.05、0.01),Z15中剂量组糖水偏爱度和敞箱实验直立数显著增加(P<0.05、0.01);盐酸氟西汀组、GABA组、Z6组及Z15高、中剂量组悬尾实验的不动时间均显著减少(P<0.05、0.01);各组小鼠强迫游泳实验的不动时间均显著缩短(P<0.05、0.01)。结论发现淡豆豉炮制后期出现高含量GABA;淡豆豉显著改善小鼠的快感缺失、行为绝望等抑郁症状,具有良好的抗抑郁作用并与GABA含量可能有关。

淡豆豉炮制过程中黄曲霉毒素含量的动态变化规律分析

目的:检测淡豆豉炮制过程中不同时间点样本的黄曲霉毒素(AFTs)含量,明确AFTs的动态变化规律及其产生的关键时间点。方法:按实验室前期已建立的规范炮制工艺制备淡豆豉,获取淡豆豉炮制过程中不同时间点的样本;采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)检测各样本中4种AFTs[黄曲霉毒素B1(AFB1),AFB2,AFG1,AFG2]含量。结果:4种黄曲霉毒素在选定的质量浓度范围内与峰面积线性关系良好(R2均大于0.99),重复性相对标准偏差(RSD)0.4%~0.9%,精密度RSD0.7%~2.6%,稳定性RSD0.8%~1.74%,加样回收率介于95.09%~107.20%(RSD3.14%~12.71%);AFB1含量在淡豆豉整个炮制过程中呈先上升后下降的趋势,在“再闷”第6天时达最高值6.95μg·kg^(-1),再闷第12天后各样本均未检测出AFTs。结论:本研究建立了简单、快速、灵敏度高且适用于淡豆豉中4种AFTs检测的UPLC-MS/MS法;淡豆豉炮制过程中AFTs含量呈动态变化,表明淡豆豉炮制中生物拮抗作用自然存在,从安全性角度证实淡豆豉炮制中“再闷”环节的重要性和“再闷”时间的合理性。