农杆菌介导水稻转基因技术的原理与运用分析

农杆菌介导水稻转基因技术在近年来的水稻转基因研究中发挥了非常重要的作用,所以本文重点针对于农杆菌介导水稻转基因技术的原理以及运用情况进行了分析,结合自身的工作经验,提出了一些浅见,以供参考。

农杆菌介导水稻转基因技术的原理与应用研究进展

农杆菌介导转基因技术最近几年取得很大进展,为了推动我国水稻转基因研究工作,对农杆菌介导转基因的原理、实验研究过程和各种影响因素进行了综述。

农杆菌介导的籼型水稻恢复系R752成熟胚转基因技术体系的优化

采用农杆菌介导法,对籼型晚稻恢复系R752成熟胚的遗传转化体系进行了优化。结果表明:在MSS培养基上的愈伤诱导率要高于在CCS培养基上的;碳源麦芽糖对提高胚性愈伤诱导率的效果优于蔗糖的;在4种诱导培养基(MSM、MSS、CCM、CCS)与2种分化培养基(MSB、MSK)的8种组合中,以MSM-MSB组合获得的绿苗分化率最高,达28.97%;不同激素对绿苗分化率的影响大小表现为NAA>KT>6-BA,分化培养基的最佳激素配比为2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1 mg/L KT;3种农杆菌菌株的侵染效率表现为EHA105>LBA4404>GV3101。最终建立了R752的高效转基因技术体系,其平均转化效率达到10.98%。

农杆菌介导水稻幼胚转化获转基因植株

本研究以根癌农杆菌LBA4404(pTOK233)为供试菌株,以水稻幼胚为供试材料,对影响农杆菌介导基因的转化效率的因素进行了研究,确立了农杆菌介导的水稻高效转化体系。采用所确立的转化体系转化了Radon、中国91、024283个水稻品种(系)幼胚,结果表明,gusA基因的瞬时表达率均在70%左右,最高为76%;gusA基因稳定表达率均在20%以上,平均为23%。转基因植株的GUS活性检测及Southern杂交分析表明,外源基因已整合于水稻基因组中,进行了有效地表达,且能稳定地遗传给后代,外源基因在后代遗传符合孟德尔遗传规律。

通过根癌农杆菌介导的共转化获得具有蜡质基因反义片段的转基因水稻

在构建剔除潮霉素抗性基因的反义蜡质基因重组质粒p1 3W8的基础上 ,用分别携带p1 3W8质粒和有潮霉素抗性基因的pCAMBIA1 3 0 0质粒的根癌农杆菌 ,在不同处理条件下对粳稻 3个品种进行共转化。试验结果显示 ,共感染混合液中pCAMBIA1 3 0 0菌液比例高 ,抗性愈伤组织的转化频率也较高 ;抗性愈伤组织的PCR检测结果表明 ,潮霉素抗性基因的阳性检测率为 98% ,反义蜡质基因的阳性检测率为68%。在 1 0 5株转基因植株中 ,反义蜡质基因阳性株为 3 0株 ,占转基因植株的 2 8.6%。乙酰丁香酮处理组的平均转化频率略高于未处理组 ;在乙酰丁香酮的各种处理中 ,直接浸泡愈伤组织的转化频率稍高于其它处理方式。

根癌农杆菌介导的水稻转化及转基因R_1代植株表型特征

用根癌农杆菌介导的方法对２ 个粳稻品种和４ 个籼稻品种进行了转化。粳稻成熟胚和籼稻幼胚来源的愈伤组织用携带质粒ｐＧＩＨ 的农杆菌ＥＨＡ１０１ 感染，对所有品种均获得较高的愈伤转化频率（２０．８３ ％ ～６２ ．３２ ％ ） 。粳稻“申香粳４ 号”植株转化频率为１７ ．３９ ％ ，“秋丰”为９ ．２１％ 。４ 个品种籼稻中仅“超丰早１ 号”获得１ 株转化植株。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交分析、ＧＵＳ 染色、ＴＤＮＡ 整合边界序列分析等结果表明外源基因整合入植物基因组中。对Ｒ１ 代分析结果表明外源基因能遗传给后代，大多数株系的分离比符合３∶１ ，也有少数株系分离比异常。对转基因Ｒ１ 代水稻植株表型特征分析结果显示转化植株株高下降，每株分蘖数减少，每株籽粒数明显减少，部分植株播种至开花所需时间延迟。

利用农杆菌介导的共转化法获得转基因水稻

以水稻粳稻品种空育131、垦稻12为材料,用农杆菌共转化的方法将质粒p1300和p13W8导入受体材料。结果显示:两种混合共转化菌液按体积比1∶1时共转化效率最高,植株转化效率达4.08%和2.63%。将转化植株进行PCR鉴定,13株转基因植株均能检测到质粒p1300的信号,4株检测到质粒p13W8的信号,反义蜡质基因的阳性株占转基因植株总数的30.77%。

农杆菌介导的共转化法培育无选择标记转基因水稻的研究进展

植物基因工程可有效地改良农作物的品质、性状或产量,尤其是对水稻这样重要的粮食作物,进行该方面的研究意义重大。在遗传转化过程中,抗性标记基因是筛选转化体的有效手段,但也带来了生态环境及食品安全方面的潜在隐患。为培育无选择标记转基因水稻,可采用共转化无选择标记系统,此方法简单易行,可操作性强,尤其是农杆菌介导的共转化法,应用较为广泛。同时,对获得的转基因水稻,其生物安全性也是人们普遍关注的重大问题。本文对近几年应用农杆菌介导的共转化系统培育无选择标记转基因水稻的研究进展及优化方法进行了综述,结合转基因材料安全评价标准,对转基因植物的推广及应用前景进行了展望。

农杆菌介导将白叶枯病抗性基因Xa21导入水稻获得转基因植株

利用农杆菌介导的高效遗传转化系统 ,将白叶枯病抗性基因 Xa2 1转入黄淮稻区主栽品种豫粳 6号的胚性愈伤组织 ,获得转基因植株。GUS染色和 PCR分析证明 Xa2 1基因已整合到水稻基因组中。其自交 T1代植株经 GUS染色和白叶枯病接种鉴定呈现 3∶ 1分离。研究为培育抗白叶枯病水稻品种奠定了基础。

农杆菌介导将抗真菌r-硫堇蛋白Rs-afp1基因导入水稻获得转基因植株

利用农杆菌介导的高效遗传转化系统 ,将抗真菌r -硫堇蛋白Rs -afp1基因导入黄淮稻区主栽品种豫梗 6号的胚性愈伤组织 ,获得了 8株转基因植株 ,Gus染色和PCR分析表明 。

农杆菌介导的牡丹江8号高效转基因体系的建立

粳稻品种牡丹江 8号具有繁殖周期短、对多个白叶枯病和稻瘟病生理小种感病或高度感病的优点 ,因此 ,是水稻抗白叶枯病和抗稻瘟病基因克隆研究中候选基因功能验证的一个理想受体。本试验通过对农杆菌侵染参数的优化 ,建立了农杆菌介导的牡丹江 8号高效转基因操作体系。在 3次重复试验中 ,该转基因操作体系抗性愈伤转化率分别为 6 7.5 %、 75 .8%和 70 .0 % ,抗性植株转化率分别为 36 .2 %、 4 2 .1%和 37.9% ,具有较高的转基因效率和转基因稳定性 ;

农杆菌介导的苏云金杆菌抗虫基因cryIA(b)和cryIA(c)在水稻中的遗传转化及蛋白表达

通过农杆菌介导法用含有抗潮霉素和 Ｇ Ｕ Ｓ 基因的双元载体将杀虫结晶蛋白基因ｃｒｙ Ｉ Ａ（ ｂ） 和ｃｒｙ Ｉ Ａ（ｃ） 导入到籼、粳稻幼穗愈伤组织中，然后经过在含有不同浓度潮霉素的培养基上进行数次筛选，获得一批 Ｂｔ 转基因株。经 Ｐ Ｃ Ｒ、 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交及 Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹分析证实此二基因已整合进水稻中，饲虫试验结果表明，转基因株具有１００ ％ 杀虫率。

农杆菌介导法获得小麦转基因植株的研究

从 gus基因的瞬时表达入手 ,利用不同种类的农杆菌菌株感染小麦不同基因型和同一基因型的不同外植体 ,研究了农杆菌菌系、小麦基因型和外植体对转化效率的影响。从中优选出了对小麦愈伤组织感染力比较强的农杆菌菌系 AGL 0和 MOG10 1,以及高敏感受体基因型 Alondra和扬麦 15 8等。实验结果还表明 ,预培养 10～ 15天的幼胚愈伤组织具有较高的瞬时表达率和再生能力 ,是较好的转化受体。对愈伤组织与农杆菌共培养后的筛选程序进行了摸索 ,获得了 70多个 PPT(Phosphinothricin)抗性植株 ,经 PCR等分子检测分析 ,证明部分植株实现了外源基因的成功转化 ,为进一步的研究工作打下了基础。

根癌农杆菌介导获得稗草Ecppc转基因小麦的研究

采用携带pUbi-Ecppc质粒的3个根癌农杆菌菌株(LBA4404、EHA105和C58c1),对经过预培养10-12 d的春小麦品种扬麦158、Bobwhite和扬麦12的幼胚愈伤组织进行了遗传转化,对筛选中的抗生素浓度、菌液浓度、共培养温度和时间、受体基因型、菌株-质粒组合等影响转化的重要因素进行了研究。首次将单子叶野生C4植物稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(Ecppc)导入不同基因型小麦受体,并得到具有潮霉素(Hyg)抗性的转化植株。从816块共培养愈伤组织中转化得到34株抗性植株,其中14株PCR检测为阳性。扬麦158的转化效率达3.03%。Southern和RT-PCR分析表明,外源基因已整合到小麦基因组并得到正确的转录。生理学检测显示,转基因小麦植株的光合速率和PEPC活性都有所提高。说明Ubiqintin基因启动子控制的稗草PEPC cDNA基因在小麦中可以正确表达和起到一定的生理作用。这些工作为进一步探讨PEPC对小麦光合作用及其他生理过程的影响奠定了基础。

农杆菌介导抗虫CpTI基因的花生遗传转化及转基因植株的再生

通过农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)Ti质粒介导途径,将抗虫CpTI基因转入花生,经过诱导分化获得转基因再生植株。PCR检测及Southern杂交鉴定结果表明,外源CpTI基因已整合到大部分再生花生植株的基因组中。通过抗虫性检测试验,转基因花生具有一定的抗虫性。

农杆菌介导的细菌阿特拉津氯水解酶基因对水稻的遗传转化

研究构建了植物表达载体p1301-atzA,使来源于节杆菌(Arthrobacter sp.)AD1菌株的阿特拉津氯水解酶基因atzA受控于CaMV35s启动子下表达。用农杆菌介导法将植物表达载体p1301-atzA导入粳型保持系津稻107中,经潮霉素抗性筛选,得到可育的再生植株。转基因植株总DNA经PCR和Southern检测表明atzA基因已整合到水稻的基因组中。对转基因植株进行除草剂阿特拉津抗性检测,在喷施浓度为0.133％的阿特拉津溶液后,对照植株和敏感植株死亡,而转基因植株表现出对阿特拉津的抗性,保持正常生长,但不同转化株系的抗性表达水平不同。对转基因植株T,代进行的遗传分析表明,外源基因atzA能稳定遗传给后代,且大多数株系的分离比符合3:1。

农杆菌介导法将高赖氨酸蛋白基因sb401导入水稻

培育高赖氨酸的水稻品种是提高稻米营养品质的重要途径。本研究利用农杆菌介导法将水稻胚乳特异表达启动子PGlu驱动的马铃薯花粉特异水溶性蛋白基因sb401导入粳稻品种日本晴和籼稻恢复系501R的幼胚愈伤组织中,以期提高水稻胚乳中赖氨酸的含量。经PCR检测,从70株T0再生植株中筛选出18株转基因植株(日本晴13株,501R5株)。对转基因植株的Southernblotting分析表明,sb401基因已经转入并整合进了水稻基因组中。测定10株T0代转基因植株成熟种子的总蛋白含量和赖氨酸含量,结果表明,有8株的总蛋白含量,5株的赖氨酸含量皆提高了20%以上;其中,8号样品(日本晴转基因植株)的种子总蛋白含量和赖氨酸含量分别为10.5%和0.383%,与对照相比分别提高了32.74%和35.34%,表明sb401基因在大部分转基因植株中的翻译水平上得到了比较有效的表达。

利用根癌农杆菌法获得转基因水稻植株及其后代

在100μmol／L乙酰丁香酮（AS）等vir基因诱导分子存在的情况下，用含双元载体pBYT2的根癌农杆菌菌株EHA101同水稻（OrizasativaL．）台北309悬浮培养细胞共培养3天。经过2个月的连续筛选，共从364颗同根癌农杆菌共培养的悬浮培养细胞团中得到17个具有稳定潮霉素抗性和GUS表达的愈伤组织。对从8个转化组织中得到的10株可能的R0代转基因植株及其后代进行外源基因的整合和表达分析，Southern分析表明外源基因已稳定地整合进水稻基因组中并实现了有性遗传传递。杂交结果显示在其中一个转化系的植株中有5个拷贝的T－DNA整合，而其余的转化系则只整合了1个拷贝。转基因水稻细胞及植株中GUS活性的组织化学染色观察和荧光分析表明玉米ubiquitin基因启动子在水稻细胞中能高效启动gus报告基因的表达。ndPAGE－X－Gluc法检测表明转基因水稻细胞中表达的GUS蛋白比Sigma公司的标准GUS蛋白（SigmaCo．G0786）要小，而与来自大肠杆菌HB101（pBI1121）中的GUS蛋白大小相同。结果表明，根癌农杆菌可有效且可靠地介导外源基因转化水稻。

通过根瘤农杆菌介导法获得菊花转基因植株

以带叶茎段为外植体，通过根癌农杆菌介导法，将兔防御素NP－1基因导入菊花品种“001”中。经梯度卡那霉素（kanamycin，Km）筛选，获得了大量Km抗性植株，其中部分Km抗性植株经Southem杂交鉴定为转基因植株。从而成功地建立了菊花遗传转化系统，为菊花分子育种奠定了基础。