根癌农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化体系的优化

为进一步提高根癌农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化效率,本试验以紫花苜蓿(Medicago sativa L.)品种‘中苜1号’为试验材料,通过筛选高效再生的植株,以筛选出的植株叶片为外植体,并通过调节培养基激素配比,在农杆菌侵染过程中添加谷氨酰胺、进行冷处理等措施优化苜蓿由农杆菌介导的遗传转化体系。试验结果表明:转化过程中以嫩叶作为外植体,菌液和重悬液中添加150μmol·L^(-1)乙酰丁香酮,侵染过程中使用300μmol·L^(-1)的谷氨酰胺将瞬时转化效率从32%提高至92%,转化效率提高到31%。研究紫花苜蓿的遗传转化体系可为紫花苜蓿高效遗传改良及基因功能研究提供了技术支持。

发根农杆菌介导的甜瓜CRISPR/Cas9系统靶位点的检测

选取甜瓜栽培材料龙庆八号作为受体材料,构建CmCURT1A基因CRISPR/Cas9基因编辑载体,经发根农杆菌介导检测靶位点的编辑情况,为后续甜瓜遗传转化试验提供载体基础。以甜瓜CmCURT1A基因(ID:MELO3C006053.2)为靶基因构建双靶位点敲除载体,经发根农杆菌K599介导的简单遗传转化技术使甜瓜组织长出不定根,经PCR测序发现在不定根中分别存在65 bp、72 bp不同碱基片段的缺失。该方法成功进行了甜瓜CRISPR/Cas9载体靶位点敲除情况的检测,简单高效,实现了在甜瓜中基因编辑靶点的快速鉴定,为研究甜瓜基因功能和遗传改良奠定基础。

平邑甜茶发根农杆菌介导转化体系构建与优化

【目的】建立并优化平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd.)幼苗简单、高效、快速的发根农杆菌转化体系。【方法】以不同苗龄的平邑甜茶幼苗为材料,使用携带GFP及GUS过表达质粒的发根农杆菌K599,通过注射法、活化菌液浸染及菌株涂抹方法侵染平邑甜茶根颈部诱导毛状根,利用GFP荧光检测、GFP蛋白印迹检测、DNA检测和GUS染色方法进行转基因株系验证,同时对成功转化株系根、茎、叶组织的表达量进行分析,检测发根农杆菌在转化平邑甜茶株系中的迁移性。【结果】不同苗龄平邑甜茶幼苗诱导毛状根能力具有较大差异,其中三叶龄幼苗诱导毛状根率最高,为96%,五叶龄幼苗最高的毛状根诱导率为65%,以使用菌株涂抹方式转化植株的毛状根分布为最佳、毛状根诱导率为最高。发根农杆菌在成功转化株系中存在随机向地上部迁移的现象,并能够整合目的基因至叶片叶柄及部分主叶脉基因组中,但在培养30 d时无法通过蛋白印迹方式在蛋白水平上检测到蛋白信号。【结论】建立并优化了简单、高效的发根农杆菌介导的平邑甜茶转化体系,鉴定了发根农杆菌在转化株系中随机向地上部迁移规律,为发根农杆菌技术的进一步利用提供理论依据。

根癌农杆菌介导彩色马蹄莲遗传转化体系的建立及优化

【目的】建立及优化根癌农杆菌介导的彩色马蹄莲(Zantedeschia hybrida)遗传转化体系,为提高彩色马蹄莲遗传转化效率及培育彩色马蹄莲抗性品种提供理论参考依据。【方法】将不同外植体(茎基、叶、不定芽)和不同浓度噻苯隆(TDZ)(0.001、0.002和0.005 g/L)进行正交试验筛选外植体和丛生芽增殖培养基;液氮冻融法将pCAM BIA2301和pBI121质粒转入农杆菌LBA4404感受态细胞。以β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因作为农杆菌介导转化测定的报告基因,对彩色马蹄莲的丛生芽进行遗传转化,阳性苗经PCR扩增验证转化结果。通过不同硫酸卡那霉素(Kan)浓度(50、100和150 mg/L)、侵染时间(25、30和40 min)及共培养时间(2和3 d)3因素正交试验筛选最佳转化条件。【结果】外植体为不定芽的丛生芽诱导率极显著高于茎基和叶(P<0.01),当不定芽为外植体、TDZ浓度为0.002 mg/L时,丛生芽增殖倍数(5.12倍)显著高于0.001和0.005 mg/L TDZ处理(P<0.05),筛选出M6培养基+0.002 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖+6.25 g/L琼脂为丛生芽增殖培养基;影响阳性频率因素排序为:侵染时间>Kan浓度>共培养时间。当Kan浓度为50 mg/L、侵染时间25 min及共培养时间为3 d为最优侵染条件,此时,GUS+丛生芽出芽频率和PCR阳性频率最高,分别为54.0%和15.27%。【结论】成功优化彩色马蹄莲遗传转化体系,最佳外植体为不定芽,转化体系最佳组合为Kan浓度为50 mg/L、侵染时间为25 min及共培养时间为3 d。

农杆菌介导的黄瓜遗传转化体系优化研究

【目的】筛选适用于农杆菌介导的黄瓜遗传转化体系,为通过生物技术进行黄瓜新品种培育奠定基础。【方法】以华北型黄瓜品种‘9930’子叶为试材,探讨卡那霉素浓度(kanamycin, Kan)、预培养时间、预培养基添加乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)、分化培养基pH及生根培养基中添加不同外源物质对黄瓜遗传转化的影响。【结果】不定芽分化、生根阶段的Kan临界浓度为150 mg/L;不进行预培养的黄瓜不定芽诱导率最高,为77.17%;当分化培养基pH为5.6时不定芽诱导率最高,为75.26%;外植体在添加0.5 mg/L的IBA生根培养基上生根率达100%,根长也显著增加。【结论】在以黄瓜品种‘9930’子叶节为外植体的遗传转化体系中,150 mg/L Kan可作为不定芽分化和生根阶段的筛选选择压;不进行预培养更有利于其抗性芽诱导;适合不定芽诱导的分化培养基pH为5.6;0.5 mg/L的IBA为诱导外植体生根最佳激素浓度。

发根农杆菌介导的柑橘黄龙病抗性快速评价体系优化及应用

【目的】黄龙病(Huanglongbing,HLB)是一种毁灭性柑橘病害,主要由韧皮部杆菌属亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)侵染引起。本研究旨在探究侵染初期CLas在柑橘毛状根中的增长规律,优化发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导的黄龙病抗性快速评价体系并应用于抗菌肽的抗性评价。【方法】基于植物表达载体pGNGM1300,通过发根农杆菌K599介导的毛状根转化体系转化不同柑橘品种,筛选毛状根诱导快、转化率高的品种;接种CLas后,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)对毛状根中的CLas进行定期检测,揭示其增长规律;在优化黄龙病抗性评价体系的基础上,通过CLas和相关基因的(RT-)qPCR、胼胝质含量检测、显微结构观察和症状观察等开展抗菌肽的黄龙病抗性评价。【结果】供试的11个柑橘品种中,香橼(Citrus medica)的毛状根诱导最快(15 d)、诱导率最高(73.75%),并且毛状根中转基因阳性率高(53.54%)。qPCR定期监测结果显示,在接种后第20—30天(days post inoculation,dpi),CLas开始在根中定殖;在30—50 dpi,CLas含量呈显著上升的趋势;CLas含量在60—120 dpi时略有波动,但与50 dpi时差异不显著。抗菌肽MaSAMP(stable antimicrobial peptide)、HBD-4(homo sapiens defensin beta 4)和CB(cecropin B)的抗性评价结果分析显示,在50—120 dpi,MaSAMP和CB表达植株中CLas含量均低于对照,且差异显著,除90 dpi外HBD-4表达植株中CLas含量也显著低于对照。3种抗菌肽表达植株中的胼胝质含量均显著低于对照(60 dpi),韧皮部细胞壁增厚不明显,未出现明显的淀粉粒和胼胝体沉积,并且均未发现根部死亡等现象(90 dpi)。【结论】揭示了侵染早期CLas在柑橘毛状根中的增长规律;优化了发根农杆菌介导的黄龙病抗性快速评价体系;明确转基因过表达抗菌肽MaSAMP、HBD-4和CB可显著抑制CLas的增殖,减少胼胝质沉积,减轻黄龙病症状,具有用于黄龙病防控实践的潜力。

农杆菌介导辣椒遗传转化的影响因素

再生体系遗传转化是现代生物技术的一个重要手段,该技术转化基因稳定、成本低效益高。但基因依赖型和顽抗性植物辣椒对农杆菌不敏感,导致辣椒再生体系遗传转化效率低,且存在基因转移整合或目的基因脱靶等问题。为此,综述了农杆菌介导辣椒遗传转化的基因型、受体、外源添加物、发育调节因子、编辑器、接种物、预培养、侵染时间、共培养以及褐化等影响因素,以期降低辣椒遗传转化风险,提高辣椒再生体系遗传转化效率。

从一道选考题解析农杆菌转化法中的“三除”

从筛除对象、用于筛除的物质、影响筛除效果的因素等方面解析了农杆菌转化法中的“三除”:筛除未转化的农杆菌、筛除共培养的农杆菌、筛除未转化的受体细胞,为教师教学和学生深度学习提供参考。

农杆菌介导的桑树遗传转化研究进展

农杆菌介导的遗传转化法是目前植物应用最为广泛的转基因技术。介绍了农杆菌介导的植物遗传转化机理,分别对根癌农杆菌和发根农杆菌介导的桑树遗传转化发展状况、研究进展进行了综述,并对桑树遗传转化研究进行了展望,以期为桑树后基因组时代遗传转化研究提供参考。

发根农杆菌和ABT1对杉木扦插生根的影响

以杉木插穗为试材,研究了ABT1和A4发根农杆菌对其扦插生根的影响。结果表明:A4发根农杆菌能有效提高杉木扦插的不定根再生效率,扦插60 d后杉木插条的生根率表现为ABT1+A4(93.37%)>A4(72.93%)>ABT1(64.22%)>CK(46.32%);经ABT1+A4处理的杉木插条内源激素IAA、可溶性糖含量及生根数目、根系直径、体积、根表面积等根系参数均高于对照或者单一处理;用500 mg·kg^(-1) ABT1和0.5 OD值A4发根农杆菌菌液分别浸泡杉木插穗10 min和30 min,能显著缩短插条生根时间也能提高生根数目。

苜蓿组织培养及农杆菌介导的遗传转化研究进展

苜蓿是重要的豆科牧草,苜蓿品种的改良对畜牧业的发展有重要意义。转基因育种是利用现代生物技术改良作物性状的重要手段。而农杆菌介导的遗传转化被认为是最有效的转基因方法。对大多数植物,组织培养再生体系的建立是遗传转化的基础。本文通过在以往苜蓿组织培养及农杆菌介导的遗传转化相关研究的基础上,对这一领域的进展做了综述。

根癌农杆菌中DapB突变株功能的研究

在对根癌农杆菌中二氢吡啶二羧酸还原酶DapB蛋白序列分析的基础上,利用转座子诱变敲除dapB基因.结果发现,根癌农杆菌中的DapB序列具有典型的保守的二核苷酸结合域和底物结合域.dapB基因突变后,突变株的生长明显延迟,外加二氨基庚二酸可恢复突变株的生长;突变株可能通过在细胞膜中合成更多的蛋白质和提高细胞壁碳水化合物含量来提高细胞的韧性以对抗外界环境;与此同时,dapB基因突变影响到农杆菌对GABA的响应.以上结果说明根癌农杆菌中DapB蛋白是一个有功能活性的二氢吡啶二羧酸还原酶,与细胞的生长、细胞壁的合成以及细胞对GABA的响应有关.本研究为寻求新的抗生素靶位点以控制根癌农杆菌中冠瘿瘤奠定了基础.

发根农杆菌介导的细茎柱花草毛状根转化体系的建立

细茎柱花草(Stylosanthes gracilis)是圭亚那柱花草(S.guianensis)的野生近缘种,具有茎秆直立、种子落粒性低、抗旱能力较强等特点。为开发一种高效的细茎柱花草毛状根转化体系,本研究以细茎柱花草子叶节为外植体及4个发根农杆菌为供试菌种,探索菌液浓度、侵染时间、共培养时间对毛状根转化效率的影响。结果表明MSU440为诱导毛状根发生的最优菌株,诱导率为88.3%。其中,该菌株诱导毛状根产生的最佳条件为菌液浓度OD600=0.3、侵染时间为15 min、共培养4 d,转化效率达34.72%。同时,获得的转基因材料通过聚合酶链式反应(PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)分子鉴定方式,证实了外源基因已整合到细茎柱花草毛状根的基因组中。因此,本研究成功建立了一种细茎柱花草的毛状根转基因体系。

发根农杆菌介导的甘薯遗传转化体系优化

遗传转化体系对植物基因功能的验证具有重要意义,为在甘薯(Ipomoea batatas L.)中建立发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导的遗传转化体系,本研究采用3×3×5三因素试验设计研究发根农杆菌侵染时间、外植体类型、发根农杆菌菌株对甘薯毛状根诱导率的影响。确定合适的外植体类型、侵染时间,在此基础上采用5×5双因子设计,研究5种发根农杆菌菌株和甘薯品种(系)对甘薯发根诱导率的影响。用PCR技术检测诱导出的毛状根,证实了发根农杆菌Ri质粒的rolB基因已经整合到甘薯细胞基因组中。结果表明,发根农杆菌侵染时间、外植体类型、发根农杆菌菌株、甘薯品种均影响发根诱导率,且各因子间存在交互作用。最适宜发根的外植体为茎段,最佳侵染时间是20 min,‘徐薯22’适宜菌株为MSU440,‘泰中6号’适宜菌株为K599,‘1610’适宜菌株为C58C1,‘YS’适宜菌株为K599,‘灰薯’适宜菌株为C58C1。采用发根农杆菌菌株MSU440,以‘徐薯22’茎段为外植体、农杆菌侵染20 min,最高获得了79.63%的毛状根诱导率。构建过表达载体进行毛状根遗传转化,通过目的基因的PCR扩增发现甘薯毛状根的转基因效率为38.1%。建立了发根农杆菌介导的甘薯遗传转化体系,为甘薯进一步的转基因育种奠定基础。

农杆菌介导的籼稻9311和华占遗传转化体系的研究

【目的】水稻转基因技术是推动水稻分子生物学研究和精准育种的重要工具。农杆菌介导法是水稻遗传转化的主流方法。然而受基因型限制,典型籼稻的转化效率仍然偏低,需提高其转化效率。【方法】以顽拗型籼稻品种9311和华占为受体材料,研究了不同大量元素、微量元素、有机物和碳源的组合,植物激素浓度,侵染培养基,乙酰丁香酮(AS)浓度和光周期对遗传转化效率的影响。【结果】在成熟种子组织培养试验中,MS大量元素、B5微量元素、N6有机物和麦芽糖为9311最优组合,华占最优组合为MS大量元素、MS微量元素、MS有机物和麦芽糖。诱导培养基中添加0.5mg/L的BAP或1.5mg/L的KT可显著提高9311和华占的组织培养再生率,可达70.0%以上。在侵染过程中,添加100μmol/LAS的转化效率高于200μmol/LAS。光周期实验显示9311和华占宜采用不同的光周期策略,9311在全黑暗条件下进行愈伤诱导和筛选,在全光照条件下进行分化,转化效率最高,达6.0%~6.4%,而华占在12h光照/12h黑暗条件下进行诱导、筛选和分化,获得的转化效率最高(5.0%~7.5%)。【结论】本研究优化了顽拗型籼稻9311和华占的组织培养和遗传转化体系,该体系也可以应用于其他相关籼稻基因型的遗传转化。

农杆菌介导水稻遗传转化的影响因素及应用研究进展

在水稻遗传转化过程中,农杆菌介导转化法与其他方法相比优势较多,比如转入的外源DNA结构完整及表达比较稳定、操作简便、转化率高等,已被广泛应用于转基因技术中。本文对根癌农杆菌介导水稻遗传转化的原理、影响遗传转化的因素进行了综述,并探讨了农杆菌介导转化法的应用前景。

不同载体和农杆菌对苜蓿瞬时表达影响的研究

苜蓿(Medicago sativa)是重要的牧草类植物,为了在苜蓿中有效地实现外源基因的瞬时表达,该研究以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因,以本氏烟草(Nicotiana benthamiana)作为对比,研究了2种不同的表达载体(非复制型载体和基于菜豆黄矮病毒的复制型载体)、2种不同类型的根癌农杆菌菌株(Agrobacterium tumefa⁃ciens)(LBA4404和EHA105)对苜蓿叶片瞬时表达水平的影响。结果表明,LBA4404与复制型载体的组合(revector/LBA4404)可在苜蓿叶片中有效地实现GFP的瞬时表达。进一步地,研究了re-vector/LBA4404的浓度和侵染后时间对苜蓿叶片瞬时表达的影响。观察显示,随着re-vector/LBA4404菌悬液浓度或侵染后时间的增加,GFP在苜蓿叶片中的瞬时表达水平呈现出先升后降的趋势。菌悬液浓度为1.0(OD600)时,GFP瞬时表达水平最高;侵染后时间为5~7 d时,GFP瞬时表达水平达到峰值。相较于本氏烟草叶片,在苜蓿叶片中实现最高水平的瞬时转化需要更高浓度的农杆菌和更长的侵染后孵育的时间。

农杆菌介导法获得辣木PKM-1转双价抗虫基因(sck+Cry1-Ac)愈伤组织

[目的]辣木生产中鳞翅目害虫辣木瑙螟危害日益严重,为提高辣木抗虫性,使用农杆菌介导法将抗虫基因导入辣木,以期获得抗虫转基因转化子。[方法]利用内质网定位修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)和苏云金芽孢杆菌基因(Cry1-Ac)筛选标记基因nptⅡ;利用农杆菌EHA105介导遗传转化辣木PKM-1的叶片和茎段,以卡那霉素筛选获得抗性植株;采用PCR和NPTⅡImmunoStrip检测确定nptⅡ基因的整合与表达。[结果]辣木叶片和茎段无需预培养可直接进行农杆菌转化,最佳转化条件为:工程菌液OD_(600)值为0.2,侵染时间为2 min,共培养时间为2 d;乙酰丁香酮添加与否对获得抗性愈伤率的影响不明显;200 mg/L提门叮可有效抑制农杆菌生长;卡那霉素抗性愈伤组织PCR检测表明:标记基因nptⅡ已成功整合到辣木PKM-1基因组中;NPTⅡImmunoStrip检测表明NPTⅡ蛋白水平得以表达。[结论]获得了辣木PKM-1卡那霉素抗性愈伤组织,为辣木抗虫分子育种提供了材料。

发根农杆菌介导的闽楠遗传转化体系构建与优化

闽楠[Phoebe bournei(Hemsl.)Yang]为我国重要的珍贵树种。为建立闽楠遗传转化体系,以闽楠幼苗为材料,利用pCAMBIA1300-GFP质粒转化的发根农杆菌介导植株转化。在比较注射和菌液浸泡两种侵染方式侵染效率的基础上,进一步利用正交[L9(3^(3))]试验从菌株种类、菌液侵染浓度和侵染植株苗龄三个方面优化了遗传转化体系。另外,对不同光强影响闽楠毛状根诱导及转化率情况进行了分析。结果表明,注射法的毛状根诱导率和遗传转化率分别为80.0%、66.7%;而菌液浸泡法的诱导率和遗传转化率分别为41.2%、35.3%。正交试验中,影响闽楠毛状根诱导率和遗传转化率的主要因素为菌株种类。最大诱导率和转化效率分别达到了87.5%、70.6%。该体系的最优组合为:K599菌株在菌液浓度OD_(600)=1.2条件下注射侵染三叶期的闽楠幼苗。此外,较弱光强(50μmol·m^(-2)·s^(-1))的培养条件比较强光照(100μmol·m^(-2)·s^(-1))更有利于闽楠幼苗的生长和遗传转化。本研究创建并优化了一套高效、稳定的闽楠遗传转化体系,成功获得了具有转基因毛状根的闽楠植株,为闽楠重要基因挖掘、新种质创建和遗传改良奠定了基础。

农杆菌介导的玉木耳遗传转化体系的建立

以玉木耳菌丝球为受体,潮霉素(Hyg)为筛选标记,利用农杆菌介导法对玉木耳菌丝进行了遗传转化研究。潮霉素敏感性测试结果表明,玉木耳Hyg耐受浓度为30mg·L^(-1)。农杆菌介导的玉木耳菌丝最佳遗传转化体系为菌液浓度OD600=0.6~0.8,共培养时间2d,乙酰丁香酮(AS)浓度为100μmol·L^(-1);经潮霉素抗性筛选和GUS活性的组织化学分析,表明外源基因GUS已转入到玉木耳菌丝中,并获得表达。本实验成功地建立了稳定的农杆菌介导的玉木耳遗传转化体系。