Agroinoculation as a Simple Way to Deliver a Tobacco Mosaic Virus- Based Expression Vector

烟草花叶病毒(TMV)表达载体30B是一个目前广泛应用的植物病毒表达载体,但用其生产外源蛋白时,必须先将它体外转录成RNA,才能被用来接种宿主植物。由于RNA体外转录费用昂贵、操作复杂,因此限制了30B表达载体的进一步应用。针对这一不足,我们用农杆菌接种法(agroinoculation)接种该病毒载体,即将30B cDNA置于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子和终止子之间,再将整个表达框架插入到农杆菌T-DNA的左边界和右边界之内,构建成质粒p35S-30B,将转入该质粒的农杆菌注射到植物的叶片中,30B cDNA随T-DNA进入植物细胞后,被转录成可自我复制的RNA形式,进而发生系统侵染。为了检测此接种方式的可行性,绿色荧光蛋白(GFP)报告基因被克隆到p35S-30B中,构建成p35S-30B∶∶GFP,用含有该质粒的农杆菌进行注射操作。证实该病毒载体可通过简便的农杆菌接种法侵染Nicotiana benthamiana,在被接种植物的系统叶中,GFP的表达量可占植物总可溶蛋白的5.2％。