农杆菌浸润瞬时表达分析番木瓜miR162a的研究(英文)

农杆菌浸润瞬时表达方法不仅在蛋白互作、鉴定基因沉默抑制子及基因功能研究方面得到广泛应用,目前还应用在小RNA的研究中。在对植物microRNA的研究中,农杆菌浸润方法通过将将转基因导入农杆菌浸润本生烟瞬时表达,可以快速、稳定地对植物microRNA进行检测和鉴定,样品在几天内就可分析完成,比获得稳定遗传的转基因有优势。笔者借鉴国外拟南芥microRNA瞬时表达分析的方法,克隆了番木瓜的miR62a前体序列连接到双元表达载体pSuper1300上构建成35S::cpa-miR162a质粒,导入农杆菌GV3101后浸润本生烟,浸润后48 h提取本生烟叶片总RNA后通过miRNA northern blot检测到miR162a,而本生烟和番木瓜自身则无法检测到低丰度的miR162a。本文介绍的农杆菌浸润瞬时表达方法能够在体外加工产生成熟的miRNA,该技术有助于对microRNA的结构-功能的相关性及靶标验证进一步研究。

农杆菌介导的CMV侵染性克隆及2b缺失突变体构建

【目的】构建农杆菌介导的黄瓜花叶病毒(CMV)侵染性克隆,测试缺失CMV 2b基因后的侵染表型。【方法】首先将pHST40上的1x35S-MCS-HDVRZ-NOS转移到中间载体pBluescript SK Ⅱ上,用pRTL2上的2x35S替换中间载体上的1x35S增强子序列,然后将2x35S-MCS-HDVRZ-NOS转移到微型植物表达载体pCB301,构建适用于病毒侵染性克隆和农杆菌浸润的植物表达载体,在此基础上将CMV Fny株系的全长cDNA基因组构建到该植物表达载体的2x35S启动子和HDV核酶之间,通过农杆菌浸润在本氏烟中瞬时表达产生具有侵染活性的CMV基因组RNA,进一步缺失2b来测试该缺失突变体侵染植物的表型。【结果】构建了一个用于构建RNA病毒侵染性克隆的植物表达载体pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-NOS,将CMV Fny的3条基因组分别构建在这个植物表达载体上后,通过农杆菌浸润本氏烟可诱导产生曲叶、花叶和矮化等症状,进一步对2b进行缺失,表明该缺失突变体接种本氏烟早期具有微弱曲叶症状,中后期表现无症,RT-PCR检测表明CMV Fny 2b缺失突变体能够系统侵染本氏烟。【结论】在改造的微型植物表达载体pCB301-2x35S-MCS-HDVRZ-NOS上构建了CMV的侵染性克隆,构建的侵染性克隆通过农杆菌介导可快速高效侵染植物。2b对CMV Fny在本氏烟中的症状发展具有重要作用,但2b对其在本氏烟上的复制和系统侵染并不是必需。

dsRNA介导的PRSV-CP基因3′-端同源序列瞬时表达对番木瓜环斑病毒侵染的影响

体外合成我国番木瓜主产区环斑病毒外壳蛋白(PRSV-CP)基因3'-端278bp同源区段,构建包含278bp正义链、内含子(PDK内含子)及278bp反义链的RNA介导的植物表达载体p2301-CPU,直接转化根癌农杆菌EHA105。通过根癌农杆菌介导的瞬时表达法,研究同源dsRNA对番木瓜环斑病毒(PRSV)侵染的干扰作用。结果表明,瞬时表达的dsRNA能够特异地干扰PRSV侵染。

香石竹斑驳病毒云南分离物全基因组序列测定和侵染性克隆构建

香石竹斑驳病毒(Carnation mottle virus,CarMV)是危害香石竹的一种重要病毒,本研究通过构建农杆菌介导的CarMV侵染性克隆来进一步研究该病毒基因功能。首先获得CarMV云南分离物全长序列,与报道的上海分离物相似性达到94.78%;将CarMV全长cDNA基因序列构建到具有35S启动子的双元表达载体pCV-nGFP,通过农杆菌浸润到本氏烟中瞬时表达,本氏烟系统叶片RT-PCR能检测到CarMV。试验结果表明,本研究构建Car-MV侵染性克隆通过农杆菌介导可快速高效侵染植物,可以用于病毒基因功能研究;同时CarMV云南分离物全长序列测定结果表明其属于P164 K331组群。

以黄瓜花叶病毒为载体表达绿色荧光蛋白

为了构建基于黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的外源蛋白表达载体,实验在获得CMV的LS株系(CMV-LS)农杆菌侵染性克隆(pCB301-R1,R2和R3)的基础上,将CMV-LS基因组RNA3的外壳蛋白(coat protein,CP)基因置换成绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因,研究以CMV-LS为载体在本氏烟中表达GFP基因的情形。农杆菌浸润接种结果表明,以R1R2R3-gfp为载体在寄主中的GFP表达量远高于植物瞬时表达载体pCB301产生的GFP,番茄丛矮病毒基因沉默抑制子p19加入有助于CMV表达GFP,将移动蛋白(movement protein,MP)缺失C端的33个氨基酸残基而构建表达载体R1R2R3mpΔ33-gfp在寄主中的GFP含量大大增加。农杆菌菌液稀释接种的结果表明R1R2R3mpΔ33-gfp接种OD600值为0.01均能有效在本氏烟中表达产生GFP。

HC-Pro 3个参与抑制RNA沉默氨基酸位点的鉴定

马铃薯Y病毒属病毒编码的辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)是第一个被鉴定的RNA沉默抑制因子。本研究通过定点突变的方法获得了马铃薯A病毒(Potato virus A,PVA)HC-Pro的3个突变体,利用农杆菌共浸润的方法分析了这些突变对HC-Pro抑制RNA沉默活性的影响。与野生型HC-Pro处理相比,Phe6、Asn11缺失突变体的处理中绿色荧光减弱,而Ile250-Gly251-Asn252(IGN)基序中的Ile和Gly分别突变为Asp和Glu的处理中观察不到绿色荧光。该结果表明Phe6、Asn11和IGN2503个位点均参与调控HC-Pro的抑制RNA沉默活性。