川芎嗪对猪冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道的作用

本工作旨在研究川芎嗪对猪冠状动脉平滑肌细胞钾通道的作用,为阐明其扩张冠状动脉血管的机制提供实验依据。采用膜片钳细胞贴附式和内面向外式记录方式观察川芎嗪对猪冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(large-conductance Ca2+- activated potassium channels,BKCa channels)的作用,分别用蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)抑制剂H-89和蛋白激酶G (protein kinase G,PKG)抑制剂KT-5823处理细胞,再观察川芎嗪对BKCa通道作用的变化。结果表明在研究的0．73-8．07 mmol/L浓度范围,川芎嗪可以剂量依赖性地激活BKCa通道,使通道的开放概率从(0．01±0．003)增加到(0．03±0．01)-(．21± 0．18)(P<0．01,n=10),使通道平均关闭时间从(732．33±90．67)ms降低到(359．67±41．30)-(2．96±0．52)ms(P<0．01, n=10)。川芎嗪的这种激活作用在浴液游离钙离子浓度接近0 mmol/L时也存在。PKA的特异性抑制剂H-89(3 μmol/L)和 PKG的特异性抑制剂KT-5823(1 μmol/L)对川芎嗪激活BKCa通道的作用无影响。以上结果提示:川芎嗪能直接激活冠状动脉平滑肌BKCa通道,这种作用可能是川芎嗪扩张冠状动脉血管的一种重要机制。

丝裂原活化蛋白激酶在人冠状动脉平滑肌细胞向三维纤维蛋白胶迁移中的作用

目的:观察三维纤维蛋白(Fb)胶对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)的趋化作用及其信号转导机制。方法:采用胶原酶消化法培养HCASMC,倒置相差显微镜观察其向三维Fb胶中迁移的能力及ERK、p38、JNK信号通路对其迁移能力的影响。Western blot检测Fb对HCASMC p-ERK、p-p38和p-JNK表达的调控。结果:向Fb胶中迁移的HCASMC呈长梭型,细胞数量增加时形成环形管腔样结构。纤维蛋白原(Fg)浓度为0.8 g/L^6.4 g/L时,HCASMC向胶中迁移的数量呈浓度依赖性增加,并随培育时间的延长逐渐增多。用Western Blot分析显示Fb以时间依赖性方式诱导ERK、p38及JNK活化,三者的选择性抑制剂PD98059 50μmol/L、SB20358010μmol/L及SP600125 20μmol/L可分别抑制其活化,但对HCASMC向胶中迁移的抑制能力不尽相同。PD9805950μmol/L对HCASMC迁移无明显影响,而SB203580 10μmol/L和SP600125 20μmol/L均可抑制HCASMC向Fb胶迁移,且后者抑制作用更强。结论:Fb胶通过激活细胞JNK和p38(而不是ERK信号通路)促进HCASMC向Fb胶中迁移,这种机制可能在动脉粥样硬化血栓形成及再狭窄过程中发挥重要作用。

在inside-out膜片上caffeine对猪冠状动脉平滑肌细胞钙激活钾通道的调节作用及ryanodine的影响

目的:利用膜片钳技术,研究咖啡因对钙激活钾通道(calcium-activated potassium channel,KCa)的作用机制,及咖啡因存在时兰尼定(ryanodine)对KCa的影响以阐明冠状动脉平滑肌的调控机制。方法:采用急性酶分离方法,应用膜片钳单通道电流记录技术记录猪冠状动脉平滑肌钿胞上KCa电流活动。电流信号经放大、滤波及A/D、D/A转换后输入微机进行采样和储存。应用PCLAMP9.0软件系统进行数据采集及分析。结果:在内面向外式(inside-out)膜片下,咖啡因(0.1、0.5、1.0、5.0mmol/L)可浓度依赖性地增加通道开放概率,而对电流幅值无明显影响,开放概率增加是通过明显缩短平均关闭时间实现的(n=8,P<0.01);洗去药物后通道活性可以恢复到对照水平;5.0mmol/L咖啡因对KCa激活作用最大(P<0.01)。在细胞贴附式(cell-attached)膜片上,咖啡因激活KCa后,ryanodine(10-40μmol/L)浓度依赖性地抑制通道开放概率,开放时间缩短,关闭时间延长,对电流幅度无明显影响。结论:在inside-out膜片下,咖啡因能够直接激活猪冠状动脉平滑肌细胞KCa通道。在cell-atta-ched构型上,ryanodine可通过胞内一定的信号通路浓度依赖性间接抑制咖啡因对KCa激活。

炎症因子对类胰岛素样生长因子1沉默表达人冠状动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究炎症因子对类胰岛素样生长因子1(IGF1)沉默表达的人冠状动脉平滑肌细胞(hCASMCs)增殖和凋亡的影响。方法应用慢病毒RNA干扰技术沉默hCASMCs的IGF1表达。分别用未感染病毒载体的细胞和感染阴性对照病毒载体的hCASMCs作为空白对照和阴性对照。肿瘤坏死因子-α50 ng/ml与白细胞介素-1β40 ng/ml共同刺激细胞8 h。采用酶联免疫吸附试验检测细胞培养上清液中IGF1浓度,MTT法及流式细胞术检测细胞的增殖及凋亡。结果炎症因子刺激后,IGF1沉默表达的hCASMCs上清液中IGF1的浓度显著低于空白对照组和阴性对照组[(426.35±120.96)比(1 030.69±54.69)和(992.82±26.90)pg/ml,P=0.000];细胞的增殖活性显著低于两个对照组(0.302±0.011比0.401±0.028和0.393±0.017,F=37.628,P=0.000),凋亡率显著高于对照组[(10.57±0.99)%比(0.19±0.13)%和(1.31±0.30)%,P=0.001]。结论炎症因子可能具有抑制IGF1敲减后的hCASMCs增殖和促进凋亡的作用。

泽兰对人冠状动脉平滑肌细胞增殖的影响

目的研究中药泽兰对人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)增殖的影响。方法利用体外细胞实验,通过人碱性成纤维生长因子和人表皮生长因子刺激细胞增殖,随机分为空白组、不同浓度泽兰水提物(LLST)组(320μg/mL、640μg/mL、1 280μg/mL、2 560μg/mL、5120μg/mL)和不同浓度泽兰醇洗脱物(LLCX)组(40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL、640μg/mL)。采用MTT法和流式细胞术分别测定细胞OD值、G0/G1期、S期、G2/M期和apoptosis期细胞百分比,观察泽兰不同浓度药液对细胞增殖的影响。结果 MTT结果显示泽兰LLST和LLCX 10个剂量均可抑制细胞增殖(P<0.05)。细胞周期结果显示:泽兰LLST 320μg/mL、640μg/mL、1 280μg/mL浓度组和泽兰LLCX40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL浓度组的G0/G1期细胞百分比较空白组增高(P<0.05);S期细胞百分比较空白组降低(P<0.05)。抑制增殖作用的最佳药物浓度分别为1 240μg/mL和160μg/mL。结论中药泽兰具有抑制HCASMC增殖的活性。

UTP经PLC-IP_3信号通路调控猪冠状动脉平滑肌细胞自发性瞬时外向电流

本文采用全细胞穿孔膜片钳技术研究UTP对急性酶分离的猪冠状动脉平滑肌细胞(coronary artery smooth muscle cells,CASMCs)自发性瞬时外向电流(spontaneous transient outward currents, STOCs)的作用,探讨细胞内Ca2+释放在UTP产物三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate, IP3)调控STOCs过程中的作用机制。结果显示:(1)UTP(40 μmol/L)可明显激活CASMCs的STOCs,使其幅度和频率分别增加(57.54±5.34)% 和(77.46±8.42)% (P<0.01, n=38)。(2)磷脂酶C(phospholipase C, PLC)阻断剂U73122(5 μmol/L)可明显抑制STOCs的活性,使其幅度和频率分别降低(31.04±7.46)%和(41.65±16.59)%(P<0.05, n=10);细胞外再加入UTP 不能再次激活STOCs (n=7)。(3)L型电压依赖性钙通道(L-type voltage-dependent Ca2+ channels, L-VDCCs)阻断剂verapamil (20 μmol/L)和CdCl2(200 μmol/L)几乎不影响UTP对STOCs活性的调节(n=8)。 (4)1 μmol/L 的bisindolylmaleimide I [BisI,蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)的特异性阻断剂]可明显激活 STOCs,使其幅度和频率分别增加(65.44±24.66)%和(61.35±21.47)%(P<0.01,n=12),细胞外再加入UTP (40 μmol/L)可使STOCs的幅度及频率进一步明显增加(P<0.05,P<0.01,n=12),细胞外继续加入ryanodine (50 μmol/L)则可完全阻断STOCs。(5)UTP(40μmol/L)预处理细胞后,IP3受体(IP3 receptors, IP3Rs)阻断剂2-aminoethoxydiphenyl borate(2-APB,40μmol/L)可使STOCs的幅度降低(24.08±3.97)%(P<0.05, n=8),对其频率的影响较小(n=8) ;而80 μmol/L的2-APB则可明显抑制STOCs的活性,使其幅度和频率分别降低(31.43±6.34)%和(40.59±19.01)%(P<0.05, P<0.01, n=6),细胞外继续加入高浓度的ryanodine(50 μmol/L)可完全抑制STOCs(n=6)。用2-APB (40 μmol/L)或ryanodine(50 μmol/L)预处理细胞后,UTP(40 μmol/L)不能再次激活 STOCs。以上结果提示:UTP主要通过PLC-IP3信号通路激活急性酶分离的猪CASMCs的STOCs,IP3Rs和ryanodine受体(ryanodine receptors,RyRs)介导的细胞内Ca2+释放在此过程中发挥重要作用。

糖基化终末产物损伤冠状动脉平滑肌细胞K_v通道

目的研究糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)对大鼠冠状动脉平滑肌细胞电压门控性钾离子(voltage-gated K^+,K_v)通道电流的影响。方法分离大鼠冠状动脉平滑肌细胞,分为空白对照组、糖基化牛血清白蛋白(AGEbull serum albumin,AGE-BSA)组、AGE-BSA+抗AGE受体抗体(anti-receptor of AGEs immunoglobulin G,anti-RAGE Ig G)组进行干预。采用膜片钳技术检测各组细胞K_v通道电流,采用Western blotting、实时荧光定量PCR方法检测各组细胞K_v1.2和K_v1.5通道蛋白及mRNA的表达。结果 AGE-BSA直接干预冠状动脉平滑肌细胞明显抑制了平滑肌细胞的K_v电流达32.7%,并使K_v1.2和K_v1.5通道蛋白及mRNA的表达明显下调。而给予anti-RAGE Ig G预处理30 min后再加入AGE-BSA刺激,平滑肌细胞的K_v电流密度及K_v1.2和K_v1.5通道蛋白及mRNA的表达与空白对照组相比,差异无统计学意义。结论 AGEs通过结合RAGE损伤冠状动脉平滑肌细胞K_v通道。

猪冠状动脉平滑肌细胞的分离、培养及鉴定

目的，建立体外分离培养猪冠状动脉血平滑肌细胞（PCASMC）的技术方法并观察其生长特征．方法：酶联合消化法原代分离猪冠状动脉来源的CASMC，利用倒置显微镜观察细胞生长情况；免疫荧光染色法鉴定细胞；台盼蓝法、绘制生长曲线法测定冠状动脉PCASMC传代细胞的成活率和生长特征．结果：分离培养的细胞3d后呈梭形生长，7～8d后生长迅速可传代；第2代细胞在显微镜下观察3～5d即可见典型“峰-谷”状生长；免疫荧光染色显示胞浆内α-平滑肌肌动蛋白表达阳性，细胞成活率为97．5％；细胞生长曲线近似“s”形．结论：本研究建立了高效分离和培养PCASMC的方法，细胞均稳定地表达α-平滑肌肌动蛋白，为血管疾病的研究提供了理想的细胞模型．

高血压大鼠冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道的变化

目的研究在高血压背景下大电导钙激活钾(BK)通道的功能改变及其机制。方法用酶解消化方法分离12～16周龄自发性高血压大鼠(SHR)和WKY大鼠冠状动脉平滑肌细胞(CASMCS),采用膜片钳全细胞模式记录SHR和WKY大鼠CASMCSBK电流,SHR和WKY大鼠BKα亚基和β1亚基mRNA水平用实时定量取聚合酶链式反应和凝胶电泳测定,蛋白水平表达用免疫组化的方法测定。结果 SHR大鼠CASMCS(n=6)BK电流密度比WKY(n=7)高2.03±0.62(P<0.01);在mRNA水平,BKβ1亚基表达SHR组明显高于WKY组5.534±1.03倍(n=4,P<0.05),BKα亚基表达则无明显差异(1.266±0.12,n=4,P>0.05);BKβ1亚基和α亚基的表达SHR大鼠高于WKY大鼠。结论 SHR大鼠CASMCSBK电流密度比WKY大鼠增大,在mRNA和蛋白水平上BKβ1亚基表达也比WKY大鼠增强,这种变化可能是机体在高血压时自我调节的结果 。

络风宁0号方对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞和内皮细胞生长的影响

目的探讨络风宁0号方不同配比对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)和内皮细胞(HCAEC)生长的影响及剂量依赖关系,明确中药复合物抗再狭窄的有效性和可行性,为中药药物涂层支架的研发提供实验数据支持。方法用体外培养的HCASMC和HCAEC 3~5代,加入96孔细胞培养板,选择抑制HCASMC生长,而对HCAEC无抑制作用的浓度范围(0.2~3.13 mg/ml)作为最佳的水蛭素浓度与1μmol/L紫杉醇组成复合物干预两种细胞,培养48 h后用噻唑蓝比色试验(MTT法)测定各孔吸光值(A值),选择对HCASMC抑制程度最大,而对HCAEC抑制程度最小且与单用紫杉醇比较能最大程度减轻对HCAEC抑制作用的浓度作为络风宁0号方的最佳配比。结果在对HCAEC增殖的影响方面,复合药物组与单药紫杉醇组比较,差异无统计学意义(P>0.05),而对HCASMC的抑制率明显高于单药紫杉醇组(P<0.05),且1μmol/L紫杉醇+0.39 mg/ml水蛭素组可明显降低单药紫杉醇对HCAEC的抑制率。结论选择1μmol/L紫杉醇+0.39 mg/ml水蛭素作为络风宁0号方的最佳配比,可最大限度抑制HCASMC增殖的同时对HCAEC有最小的抑制作用,具备抗再狭窄的有效性和可行性,为新型中药药物涂层支架的研发提供新的思路。

水蛭素对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞和内皮细胞生长的影响

目的 探讨水蛭素对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞（HCASMC）和人冠状动脉内皮细胞（HCAEC）生长的影响及剂量依赖关系,明确水蛭素抗再狭窄的有效性和可行性。方法 用体外培养的HCASMC和HCAEC 3-5代,加入96孔细胞培养板,设置调零孔、对照孔、加药孔（6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.2、0.1、0.05、0.025 mg/ml不同浓度水蛭素共9组,每组6个复孔）,培养48 h后用噻唑蓝比色试验（MTT法）检测不同浓度水蛭素干预下两种细胞的活力和抑制率变化。结果 与对照组相比,低浓度（0.025-0.1 mg/ml）水蛭素在对HCASMC增殖的影响方面无统计学差异（P均〉0.05）,而中高浓度（0.2-6.25 mg/ml）的水蛭素抑制HCASMC增殖,差异有统计学意义（P均〈0.05）,且其抑制率随水蛭素浓度升高而增加。与对照组相比,0.025-3.13 mg/ml的水蛭素在对HCAEC增殖的影响差异无统计学意义（P均〉0.05）,但0.05-0.2 mg/ml的水蛭素对HCAEC有一定的促增殖作用;而高浓度（6.25 mg/ml）的水蛭素对HCAEC增殖的抑制增加,差异有统计学意义（P均〈0.05）,其抑制率达到44.6%。结论 中高浓度水蛭素可呈剂量依赖性抑制HCASMC的生长,低中浓度水蛭素对HCAEC无明显抑制作用,且能在抗血栓的同时保护HCAEC甚至促进HCAEC生长。

LPS对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞炎症因子表达的影响--对建立支架内再狭窄炎症细胞模型的探索

目的 探索LPS作用不同时间对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞（HCASMC）炎症因子表达的影响,为支架置入术后再狭窄炎症细胞活化模型的建立提供实验数据支持。方法 体外培养的HCASMC 3~5代,接种于6孔细胞培养板,用不同浓度（0.01,0.1,0.5,1.0,10）μg/ml的LPS作用不同时间（6 h,24 h,48 h）,通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞培养上清液中炎症因子白介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）以及肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达变化。结果 对照组只有少量的IL-1β分泌。加入不同浓度LPS刺激后,与对照组比较,干预6 h的各LPS浓度组IL-1β表达量无明显变化,差异无统计学意义（P均〉0.05）。而干预24 h或48 h的各LPS浓度组与对照组相比IL-1β表达量明显增加,差异有统计学意义（P均〈0.05）。对照组有少量IL-6分泌。加入不同浓度LPS刺激后,与对照组比较,0.5μg/ml浓度组LPS干预6 h、24 h、48 h均可显著诱导IL-6的表达增加,1μg/ml浓度组则在24 h、48 h刺激条件下表达增加,差异有统计学意义（P均〈0.05）。对照组有少量TNF-α的分泌,加入LPS干预后,TNF-α的变化趋势与IL-6相一致。结论 0.5μg/ml和1μg/ml浓度的LPS刺激24 h或48 h使HCASMC的IL-6、IL-1β和TNF-α表达增加,可作为构建HCASMC炎症活化模型的参考。

二十二碳六烯酸对大鼠冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活性钾通道的影响

目的探讨二十二碳六烯酸(DHA)对大鼠冠状动脉平滑肌细胞(CASMCs)上大电导钙激活性钾通道(BKCa)的影响。方法采用酶消化法获得大鼠CASMCs,用膜片钳技术分别记录0,10,20,40,60和80μmol/LDHA对大鼠CASMCs上BKCa通道动力学的影响。结果在不同浓度DHA作用下,IBKCa和BKCa尾电流均呈浓度依赖性增加。IBKCa和BKCa尾电流I-V曲线均上移,对IBKCa稳态激活曲线无影响。在指令电压+150 mV,不同浓度DHA作用下,IBKCa电流密度分别为68.24±22.75,72.40±24.49,120.44±37.96,237.48±53.22,323.60±74.83和370.61±88.16pA/pF(P<0.05,n=20)。DHA对IBKCa激活的药物半效浓度为36.22±2.17μmol/L。在测试电压+90 mV,不同浓度DHA作用下,BKCa尾电流密度分别为91.02±13.52,100.23±17.34,224.02±38.76,369.19±65.39,511.39±82.77和700.14±96.64 pA/pF(P<0.05,n=20)。结论 DHA对全细胞BKCa有激活作用,对稳态激活曲线无影响。DHA对BKCa通道的激活作用可能是其舒张血管机制之一。

脂多糖对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞生长的影响——对建立支架内再狭窄炎症细胞模型的探索

目的探讨不同浓度脂多糖（LPS）作用不同时间对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞（HCASMC）生长的影响,分析其应用于HCASMC的无毒性反应浓度范围,为开展介入术后再狭窄相关研究建立HCASMC炎症活化模型提供实验数据支持。方法体外培养的HCASMC 3-5代,加入96孔细胞培养板,用噻唑蓝比色实验（MTT法）检测不同浓度（0μg/ml,0.01μg/ml,0.1μg/ml,0.5μg/ml,1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,100μg/ml）LPS在不同作用时间（24 h,46 h,72 h）下对HCASMC活力影响,酶标仪492 nm处测定各组A值,细胞活力=（实验组A值-调零孔A值）/对照组A值。结果 LPS在低于100μg/ml浓度范围内,干预HCASMC时间短于48 h未出现细胞毒性,多表现为促细胞增殖效应,而干预时间大于48 h则显现出较为明显的细胞毒性,且细胞活力随LPS浓度的增大而减低;干预72 h后LPS浓度在0-0.01μg/ml范围内有促增殖作用,0.1-0.5μg/ml浓度则产生轻微的细胞抑制作用,但细胞毒性不明显,在1-100μg/ml浓度下HCASMC毒性反应逐渐出现,且HCASMC活力随LPS浓度的升高而减低。同一浓度水平的LPS随着作用时间延长,HCASMC的细胞活力逐步下降,且作用时间越长下降越明显。结论LPS在浓度0.1μg/ml以下未出现明显的细胞毒性,其中LPS浓度0.01μg/ml干预24 h,人冠状动脉平滑肌细胞增殖最显著,可作为建立炎症诱导人冠状动脉平滑肌细胞活化模型的最佳条件。

Cell-attached膜片上,咖啡因对猪冠状动脉平滑肌细胞K_(Ca)的调节作用

目的:研究咖啡因对猪冠状动脉平滑肌细胞KCa通道的调控机理,以期揭示胞内钙库RyR激活后,局部钙离子浓度升高和KCa的关系。方法:采用急性酶分离方法,应用膜片钳单通道电流记录技术记录大脑皮层神经元猪冠状动脉平滑肌细胞上KCa通道电流活动。电流信号经放大、滤波及A/D、D/A转换后输入微机进行采样和储存。实验数据应用CLAMP9.0软件系统进行数据采集及分析。结果:在cell-attached膜片上咖啡因对KCa通道有明显的作用,咖啡(0.1-5.0 mM)可以增加通道的开放概率(NPo),呈现出浓度依赖性,开放时间延长,关闭时间也随之缩短,而对电流幅值无明显影响,开放概率的增加是通过明显缩短平均关闭时间实现的(n=8,P<0.05);洗去药物后通道活性可以一定程度的恢复到对照水平,再加入一定浓度咖啡因(如1.0mM)可再次激活KCa,激活程度与洗脱前较接近。结论:在细胞贴附式构型上咖啡因浓度依赖性地激活KCa,有饱和性。可能是通过影响胞内信号转导过程而调控KCa活性。

IL-1β对人冠状动脉平滑肌细胞妊娠相关血浆蛋白A分泌的影响

目的探讨IL-1β对人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)分泌妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)的影响。方法培养HCASMC,至第5～7代时,分别加入20μg/L和0μg/L的IL-1β(0μg/L组为对照组),分别孵育2、4、8、24、36 h后,收集细胞培养上清液;采用IL-1β(0、5、20、4μg/L)刺激HCASMC 6 h后分别收集细胞和细胞培养上清液。用ELISA法检测细胞培养上清液内PAPP-A的表达量。结果IL-1β组PAPP-A表达量在2 h时开始增加,8、24和36 h时其浓度显著高于对照组(P均<0.05);随着IL-1β剂量增加,PAPP-A的表达量不断升高,其中20μg/L和40μg/L组的浓度均显著高于0μg/L组的浓度(P均<0.05)。结论IL-1β可使HCASMC分泌PAPP-A增加,并呈时间和剂量依赖性。

B族Ⅰ型清道夫受体过表达对血小板源性生长因子诱导的冠状动脉平滑肌细胞增殖和迁移的影响

目的探讨B族Ⅰ型清道夫受体(SR-BⅠ)在人冠状动脉平滑肌细胞(hCASMC)增殖和迁移过程中的作用及机制。方法常规培养hCASMC,根据处理方法将细胞分为空白对照组、5μg·L^(-1)血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)组、10μg·L^(-1)PDGF-BB组、20μg·L^(-1)PDGF-BB组、20μg·L^(-1)PDGF-BB+腺病毒绿色荧光蛋白(AdGFP)组(PDGF-BB+Ad-GFP组)、20μg·L^(-1)PDGF-BB+Ad-GFP-SR-BⅠ组(PDGF-BB+Ad-GFP-SR-BⅠ组)。采用噻唑兰法检测各组细胞增殖情况,Western blot法检测各组细胞中SR-BⅠ表达,Transwell法检测各组细胞迁移情况。结果空白对照组及5、10、20μg·L^(-1)PDGF-BB组细胞中SR-BⅠ相对表达量分别为1.00±0.05、0.76±0.08、0.52±0.06、0.30±0.05,5、10、20μg·L^(-1)PDGF-BB组细胞SR-BⅠ相对表达量均显著低于空白对照组(P<0.05),10、20μg·L^(-1)PDGF-BB组细胞SR-BⅠ相对表达量均显著低于5μg·L^(-1)PDGF-BB组(P<0.05),20μg·L^(-1)PDGF-BB组细胞SR-BⅠ相对表达量显著低于10μg·L^(-1)PDGF-BB组(P<0.05)。培养24、48、72 h时,5、10、20μg·L^(-1)PDGF-BB组及PDGF-BB+Ad-GFP组、PDGF-BB+Ad-GFP-SR-BⅠ组细胞增殖能力均显著高于空白对照组(P<0.05),10、20μg·L^(-1)PDGF-BB组及PDGF-BB+Ad-GFP组、PDGF-BB+Ad-GFP-SR-BⅠ组细胞增殖能力显著高于5μg·L^(-1)PDGF-BB组(P<0.05),20μg·L^(-1)PDGF-BB组、PDGF-BB+Ad-GFP组、PDGF-BB+Ad-GFP-SR-BⅠ组细胞增殖能力显著高于10μg·L^(-1)PDGF-BB组(P<0.05); PDGF-BB+Ad-GFP-SR-BⅠ组细胞增殖能力低于20μg·L^(-1)PDGF-BB组和PDGF-BB+Ad-GFP组(P<0.05); 20μg·L^(-1)PDGF-BB组与PDGF-BB+Ad-GFP组细胞增殖能力比较差异无统计学意义(P>0.05)。空白对照组、20μg·L^(-1)PDGF-BB组、PDGF-BB+Ad-GFP组及PDGFBB+Ad-GFP-SR-BⅠ组细胞迁移数分别为24.2±3.6、76.6±4.2、75.2±4.8和60.6±3.6,各组细胞迁移数比较差异有统计学意义(F=40.695,P<0.01); 20μg·L^(-1)PDGF-BB组、PDGF-BB+Ad-GFP组及PDGF-BB+Ad-GFP-SR-BⅠ组细胞迁移数显著高于空白对照组,PDGF-BB+Ad-GFP-SR-BⅠ组细胞迁移数显著低于20μg·L^(-1)PDGF-BB组、PDGF-BB+Ad-GFP组(P<0.05); 20μg·L^(-1)PDGF-BB组与PDGF-BB+Ad-GFP组细胞迁移数比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PDGF-BB能够促进h CASMC增殖和迁移,并减少SR-BⅠ表达,过表达SR-BⅠ能够抑制PDGFBB的作用,抑制h CASMC增殖和迁移。

不同浓度二十二碳六烯酸对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道的激活作用及其机制

目的:探讨不同浓度二十二碳六烯酸(DHA)对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾离子通道(BK通道)的激活作用及其机制。方法:酶消化法分离正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞。采用全细胞膜片钳实验技术记录在未孵育与孵育细胞色素P450环氧化酶抑制剂SKF525A并灌流不同浓度DHA条件下BK通道电流密度变化;采用单通道膜片钳实验技术记录灌流不同浓度DHA时BK单通道开放概率的变化。结果:0.01~1.00μmol/L(定义为低浓度)DHA激活BK通道的半效浓度(EC50)为(0.24±0.05)μmol/L,但经SKF525A孵育后激活作用消失;3.00~10.00μmol/L(定义为高浓度)DHA激活BK通道的EC50为(2.38±0.22)μmol/L,经SKF525A孵育后,激活作用仍存在,且EC50无明显变化。在电极外液钙离子浓度为1μmol/L和刺激电位60 m V条件下,DHA浓度为0、0.01、0.03、0.10、0.30、1.00μmol/L时,BK通道开放概率分别为(0.095 2±0.009 5)、(0.093 9±0.012 6)、(0.098 6±0.016 9)、(0.099 5±0.014 7)、(0.097 5±0.010 4)和(0.102 3±0.020 6)(P>0.05,n=5),提示低浓度DHA不能激活BK单通道;继续增加DHA浓度,当浓度为3、10μmol/L时,BK单通道开放概率分别为(0.700 3±0.013 2)和(0.892 7±0.052 3)(P<0.05,n=5),提示高浓度DHA呈浓度依赖性激活BK单通道,EC50为(3.37±0.10)μmol/L。结论:不同浓度DHA激活BK通道的机制不同,低浓度DHA通过细胞色素P450环氧化酶途径激活BK通道,高浓度DHA可能通过与BK通道结合后直接激活。

辛伐他汀对氧化型低密度脂蛋白诱导的猪冠状动脉平滑肌细胞增殖和迁移的影响

目的观察辛伐他汀对氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)诱导的猪冠状动脉平滑肌细胞(SMC)增殖和迁移的影响。方法采用体外猪冠状动脉SMC培养技术,以3H-TdR的参入量表示冠状动脉的SMCDNA合成情况,应用划线方法测定冠状动脉SMC的迁移距离,观察辛伐他汀对OX-LDL诱导的冠状动脉SMC增殖和迁移的影响。结果浓度为10-8~10-5mol/L的辛伐他汀可使猪冠状动脉SMC的3H-TdR参入量减少,与对照组相比差异具有统计学意义;且药物浓度越高,参入量越少。10-8~10-5mol/L辛伐他汀均可使猪冠状动脉SMC的迁移距离减少,与对照组相比差异具有统计学意义。结论辛伐他汀可剂量依赖性地抑制OX-LDL诱导的猪冠状动脉SMC的增殖和迁移。

PKC在UTP调节猪冠状动脉平滑肌细胞BK_(Ca)通道中的作用

目的:研究UTP对急性酶分离的猪冠状动脉平滑肌细胞上BKCa通道的作用,探讨PKC在其过程中的作用机制。方法:应用cell-attached技术记录急性酶分离的猪冠状动脉平滑肌细胞上BKCa电流。用pCLAMP10.0软件系统进行数据采集及分析。结果:在cell-attached膜片上,80μMUTP可明显激活BKCa通道(P<0.05,n=21)。PLC抑制剂U73122可抑制UTP对BKCa的激活作用(P<0.05,n=5)。PKC激动剂PMA(10nM),可使BKCa通道开放概率明显降低(P<0.05,n=9)。UTP(80μM)预处理细胞之后,PKC特异性抑制剂Bis-Ⅰ(1μM),可使BKCa通道开放概率进一步增加(P<0.05,n=9)。结论:在cell-attached膜片上,UTP经由PLC信使转导通路激活猪冠脉平滑肌细胞BKCa通道;PKC对此过程具有干预作用。