人冠状病毒NL63核壳蛋白和棘突蛋白的表达及其在血清学检测中的初步应用

目的:重组表达人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)的核壳蛋白(N蛋白)及棘突蛋白(S蛋白),用于检测血清中的相应抗体。方法:用原核表达系统表达HCoV-NL63的N蛋白,建立检测N抗体的Werstern印迹法;用真核表达系统表达HCoV-NL63的S蛋白,建立检测S抗体的间接免疫荧光(IFA)法。结果:经Werstern印迹检测,重组S蛋白和N蛋白表达正确;初步建立了N蛋白纯化方法。利用建立的检测方法,检测了100份正常成人血清,总阳性率为81%。其中S抗体阳性率为66%,N抗体阳性率为38%,S抗体和N抗体均为阳性的占总数的22%,双抗体均为阴性的占总数的19%;S抗体的检出率明显高于N抗体。结论:重组HCoV-NL63N蛋白及S蛋白表达成功;S抗体和N抗体共同检测可获得较好的检测结果,减少漏检。

NL63冠状病毒木瓜样蛋白酶去泛素化酶活性和对宿主抗病毒天然免疫反应调节作用

引起人类呼吸道感染的冠状病毒已多达5种.冠状病毒与宿主相互作用决定了其致病性和免疫特性.冠状病毒感染后宿主会立即启动抗病毒天然免疫反应,而人类冠状病毒往往会编码特定蛋白逃逸或抑制宿主的天然免疫反应.NL63冠状病毒是一种新型人类冠状病毒,其非结构蛋白nsp3编码2个木瓜样蛋白酶(PLP)核心结构域PLP1和PLP2.前期研究发现,人类冠状病毒PLP2是一种病毒编码的去泛素化酶(DUB),但是对其DUB特性和功能还不清楚.研究发现,NL63冠状病毒PLP1和PLP2两个核心结构域中只有PLP2具有DUB活性,而且,PLP2的DUB活性对K48和K63连接的多聚泛素化修饰不表现明显特异性.同时,蛋白酶活性催化位点C1678和H1836突变后对其DUB活性有明显抑制作用,而蛋白酶活性催化位点D1849突变后对DUB活性无影响.其次,PLP2而非PLP1核心结构域能够明显抑制仙台病毒和重要信号蛋白(RIG-I、ERIS/STING/MITA)激活的干扰素表达,表明PLP2是一种冠状病毒编码的干扰素拮抗剂,而且PLP2的干扰素拮抗作用不完全依赖其蛋白酶活性.机制研究表明,PLP2能够与干扰素表达通路中的重要调节蛋白RIG-I和ERIS发生相互作用,通过对RIG-I和ERIS的去泛素化负调控宿主抗病毒天然免疫反应.此外,PLP2除利用DUB活性抑制干扰素表达外,很可能存在不依赖自身催化活性的其他组分共同抑制干扰素的产生.以上研究对阐明人类新发冠状病毒免疫和致病机理以及抗病毒药物研发具有重要参考价值。

2020年广东省深圳市一起由人冠状病毒NL63引起的上呼吸道感染聚集性疫情流行病学分析

目的分析一起由人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)感染引起的上呼吸道感染聚集性疫情的流行病学特点,为今后针对冠状病毒的预防控制提供依据。方法对2020年广东省深圳市一起由HCoV-NL63感染引起的上呼吸道感染聚集性疫情进行现场流行病学调查,并采用描述性流行病学方法进行分析。结果2020年8月24—29日,某看守所A、B两个监仓120名在押人员中,出现上呼吸道感染症状病例43例,发病高峰在27—29日。A、B监仓罹患率分别为55.0%(33/60)、16.7%(10/60),差异有统计学意义。两个监仓检出HCoV-NL63病毒阳性者43例,感染率为35.8%(43/120),其中A仓为51.7%(31/60),B仓为20.0%(12/60),差异有统计学意义。两个监仓的隐性感染率为16.7%(20/120),其中A仓为20.0%(12/60),B仓为13.3%(8/60)。病例临床症状以咽痛、咳嗽、流涕等为主。50~59岁年龄组人群的罹患率和感染率较高,但各年龄组差异无统计学意义。结论HCoV-NL63在密集环境人群中易引起上呼吸道感染暴发,需加强此类场所HCoV-NL63等人冠状病毒的防控。

表达人冠状病毒NL63棘突蛋白不同片段的重组痘苗病毒的制备与表达分析

HCoV-NL63是新近发现的人冠状病毒,对其外膜糖蛋白-棘突蛋白的表达及功能的研究仍有待深入。本研究利用天坛株痘苗病毒载体,克隆构建可表达HCoV-NL63棘突蛋白四个片段(N端棘突蛋白:S1;C端棘突蛋白:S2;受体结合区大片段:RL;受体结合区小片段:RS)的重组痘苗病毒(vJSC1175-S1;vJSC1175-S2;vJSC1175-RL;vJSC1175-RS),酶切测序证实表达载体构建正确,免疫荧光分析(IFA)各重组痘苗病毒中棘突蛋白不同片段的表达与定位,Western-Blot分析表明各种重组蛋白表达正确。分析结果显示:4种重组蛋白均能有效表达,S1、RL及RS蛋白的荧光主要分布在细胞膜上,而S2蛋白的荧光则主要分布于细胞浆,各个片段的分子量大小与文献报道相同,并可进行正确的翻译修饰(糖基化)。本研究首次采用痘苗病毒天坛株载体构建制备了表达HCoV-NL63棘突蛋白不同片段的重组痘苗病毒,为进一步分析人冠状病毒HCoV-NL63棘突蛋白的结构功能及探索其抗原性和免疫原性奠定了基础。

两种新型人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1的研究进展

人类冠状病毒NL63(HCoV-NL63)和HCoV-HKU1是近年新发现的两种与呼吸道疾病有关的病毒。二者均属于单股正链RNA,分属于冠状病毒1群和2群。HCoV-NL63感染有季节性,主要在冬春季,会加重哮喘患者的症状,与喉气管炎和川崎病有关。HCoV-HKU1发病高峰在晚秋、冬季发病率低,感染患儿惊厥、热性癫痫的发生率相对较高。目前HCoV-NL63和HCoV-HKU1感染的检测方法多用普通聚合酶链反应、荧光定量聚合酶链反应等。

人类冠状病毒NL63的研究进展

人类冠状病毒NL63（human coronavirus NL63，HCoV-NL63）是2004年荷兰学者首先报道发现的一种与呼吸道疾病有关的新的人冠状病毒。感染后可以引起上、下呼吸道感染，在儿童及免疫力低下的人群中的感染率较高。

急性呼吸道感染患儿人冠状病毒NL63检测与分析

目的建立人冠状病毒NL63(human coronavirus NL63)的实时荧光定量PCR(real-time fluorescentquantitative PCR,FQ-PCR)方法,了解呼吸道疾病患儿感染人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)的情况。方法收集2008年10月至2009年4月因急性呼吸道感染(ARTI)而就诊于福建医科大学省立临床医学院患儿的咽拭子、鼻咽抽吸物、痰标本共151份,设计多聚酶蛋白1a基因的引物和Taqman探针,扩增1a基因片段,并将其克隆到PMD18-T载体上,构建质粒标准品,建立FQ-PCR检测方法,进行敏感性、特异性试验。扩增核衣壳蛋白N基因,对其序列进行初步分析。结果所建立的FQ-PCR方法特异性好,线性范围为101～1010copies/μL,变异系数小于5%。151份临床标本中共检测到2份HCoV-NL63阳性,阳性率为1.3%(2/151)。结论采用FQ-PCR方法可以检测急性呼吸道疾病患儿感染HCoV-NL63的情况。

五株人冠状病毒NL63的基因型鉴定及S1 domain基因特征分析

为阐明我国部分地区人冠状病毒(Human coronavirus,HCoV)NL63基因特征,本研究对2013年陕西省、2018年河南省和湖南省送检的5株HCoV-NL63核酸检测阳性的呼吸道样本进行HCoV-NL63基因型别鉴定及S1 do-main基因特征分析。通过对HCoV-NL63棘突蛋白(Spike glycoprotein,S)基因的S1 domain区域进行基因扩增和序列测定,同时结合GenBank数据库下载的1983～2018年其他国家74条HCoV-NL63代表株序列和2007～2010年中国流行的12条HCoV-NL63代表株序列,构建基因亲缘性关系树,并对S蛋白的S1 domain区域进行核苷酸序列比对分析。结果提示全球HCoV-NL63流行株可划分为A和B两个基因型;A基因型可进一步划分为A0,A1,A2和A3四个基因亚型,其中本研究将GenBank中2008年中国流行的2株HCoV-NL63毒株划分为新基因亚型(A3);B基因型可进一步划分为B0,B1和B2三个基因亚型。A和B基因型的HCoV-NL63代表株序列在地域分布上无明显差异,但A基因型不同基因亚型的HCoV-NL63序列在年代分布上呈现出一定的时间进化趋势。在我国A和B基因型HCoV-NL63均已被检测到,但主要以A基因型流行为主,且主要集中在A1和A2基因亚型。不同基因型HCoV-NL63序列在S1 domain区域核苷酸和氨基酸序列上存在特征性差异。本研究通过对五株HCoV-NL63基因型鉴定及S1 domain基因特征分析,初步阐明了我国部分地区流行的HCoV-NL63基因型/基因亚型分布情况及基因特征,丰富了我国本土流行的HCoV-NL63基因数据库,为我国HCoV-NL63分子流行病学研究及分子检测和监测技术的改进和验证提供了基础基因数据。

人冠状病毒NL63的研究进展

患者感染人冠状病毒NL63后病情较轻,且关于该病毒的研究相对较少,因此临床医师对其缺乏完整认知。但人冠状病毒NL63在全球广泛流行,在儿童及免疫功能低下人群中更为常见。本研究对人冠状病毒NL63的病原学、流行病学、致病机制、临床特征和治疗进行介绍,以期帮助临床医师更好地认识该病毒。

人冠状病毒HCoV—NL63的研究进展

类冠状病毒NL63（human coronavirus NL63，HCoV—NL63）是2004年荷兰学者首先发现报道的一种与呼吸道疾病有关的新型人冠状病毒。感染后可以引起上、下呼吸道感染，在儿童及免疫力低下的人群中的感染率较高。该文对HCoV—NL63的病毒学、流行病学、临床特征、细胞受体、病原学检测和可能的抗病毒治疗作一综述。

清远地区急性呼吸道感染儿童人冠状病毒检测分析

目的了解清远地区急性呼吸道感染婴幼儿人冠状病毒HCoV-229E、HCoV-0C43、HCoV—HKUI和HCoV—NL63的感染情况和流行特征。方法收集0～6周岁急性呼吸道感染患儿鼻咽拭子标本，采用多重荧光PCR方法分别检测标本中的人冠状病毒HCoV-229E、HCoV-0C43、HCoV-HKUI和HCoV—NL63。结果共采集鼻咽拭子标本318份，检出人冠状病毒阳性数为36份，总阳性率为11.32％，人冠状病毒HCoV-229E、HCoV-0C43、HCoV—BKUI和HCoV—NL63阳性率分别为2．83％、2．52％、1．89％和4．09％。男性组人冠状病毒阳性率为9．74％，女性组人冠状病毒阳性率为13．82％，不同性别4种人冠状病毒阳性率差异无统计学意义。0～5周岁年龄组均有检出人冠状病毒，但6周岁年龄组没有检出人冠状病毒。结论清远市地区急性呼吸道感染婴幼儿患者中存在感染人冠状病毒HCoV-229E、HCoV-0C43、HCoV～HKU1和Hcov—NL63的情况。

人冠状病毒HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光RT-PCR检测方法的研究

目的建立一种快速、灵敏、高效的人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)和NL63(HCoV-NL63)双重实时荧光RTPCR检测方法。方法根据GENBANK数据库中HCoV-HKU1和HCoV-NL63的基因序列,利用BIOEDIT5.0软件进行序列比对分析,选择基因组的保守序列,并借助引物设计生物信息学软件,设计筛选出一套针对HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光PCR扩增的引物。从特异性、最低检测限、重复性等方面进行评估,建立了HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光PCR检测方法。结果分别以HCoV-HKU1和HCoV-NL63质粒为模板,HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光PCR方法的最低检测量分别为4.96×102 copies/ml和4.96×102 copies/ml。该方法针对其他病原微生物及人类基因组无反应信号,特异性好。4个梯度稀释质粒样本的4次重复检测Ct值变异系数均<5%,重复性好。结论 HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光RT-PCR方法准确性好、灵敏度高、稳定性好,在临床鉴别诊断和口岸冠状病毒的监测中具有很好的应用前景。

2010-2012年广州地区人冠状病毒分子进化分析

目的 了解2010-2012年广州地区发热呼吸道感染患者的人冠状病毒各亚型分子进化情况.方法 采用RT-PCR法扩增HCoV-OC43、HCoV-229E和HCoV-NL63阳性标本的NP、RdRp和S基因部分片段,构建载体后进行测序,利用Bio-edit、Mega4.0、Clustal1.83等生物信息学软件对测序成功的基因序列进行比对和分析,建立HCoV-OC43、HCoV-229E和HCoV-NL63不同基因区域的分子进化树.结果 2010-2012年期间,HCoV-OC43、HCoV-229E和HCoV-NL63亚型在广州均未检测到重大变异株或重组株.HCoV-OC43与Belgium和中国香港来源流行株亲缘关系较近（GenBank登录号JN129834和AY903460）;HCoV-229E与Amsterdam来源的病毒株亲缘关系最近（GenBank登录号JX503060）;HCoV-NL63与中国北京和Amsterdam来源的流行株亲缘关系较近（GenBank登录号JX104161和DQ445911）.各亚型NP和RDRp为保守基因,S基因变异较大.结论 2010-2012年期间,广州至少存在3种HCoV-OC43、HCoV-229E和HCoV-NL63流行株,没有发现重大变异株或重组株.各亚型NP和RDRp均为保守基因,可用于病毒的检测,S基因变异较大,适用于对分子变异规律的研究.

六重荧光RT-PCR快速检测A、B型流感等呼吸道病毒方法的建立

目的利用六重荧光RT-PCR法建立起一种快速检测A、B型流感病毒/人偏肺病毒/NL63型、HKU1型和OC43型冠状病毒的方法。方法根据A、B型流感病毒/人偏肺病毒/NL63型、HKU1型和OC43型冠状病毒的保守序列,设计相应的引物和Taqman探针,利用一步法RT-PCR试剂盒优化反应体系后,采用十倍稀释体外转录RNA检验建立体系的灵敏度和重复性,并建立相对定量的标准曲线;利用具有多种相似临床症状的呼吸道病毒检验建立体系的特异性。结果 A、B型流感病毒/人偏肺病毒/NL63型、HKU1型和OC43型冠状病毒的检测灵敏度为100 copies/μL,标准曲线的相关系数都在99%以上,重复性良好,特异性实验未发现有非特异性扩增。结论本研究建立的六重荧光RT-PCR技术可以快速、准确地检测A、B型流感病毒/人偏肺病毒/NL63型、HKU1型和OC43型冠状病毒等六种呼吸道病毒。