新型冠状病毒S蛋白RBD肽段的原核表达与纯化

目的:利用原核系统对新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)肽段进行克隆、表达和纯化,制备高纯度的RBD肽。方法:在RBD肽段N端加入肠激酶位点序列(DDDDK),对应的核酸序列参照原核系统表达偏好进行全基因合成,构建pET-DsbC-RBD融合表达载体,通过原核表达和亲和纯化获得DsbC-RBD融合蛋白,用肠激酶对融合蛋白进行酶切和二次亲和纯化,获得高纯度新冠病毒S蛋白RBD肽。结果:构建了pET-DsbC-RBD表达载体,融合蛋白DsbC-RBD在大肠杆菌中实现了高效表达,经亲和层析纯化,重组融合蛋白DsbC-RBD相对分子质量为58×103,纯度约90%。用肠激酶对融合蛋白进行酶切,酶切效率近100%,通过二次亲和纯化获得了RBD肽,相对分子质量为25×103,纯度92%以上。结论:利用原核表达系统获得可溶性DsbC-RBD融合蛋白,采用亲和纯化和肠激酶酶切联用的方法制备获得高纯度的新冠病毒S蛋白RBD肽,为后续抗体制备和抗病毒药物筛选奠定了基础。

基于ACE2和适配体CoV2-RBD-1C构建的比色传感方法用于新型冠状病毒S蛋白的检测

目的基于血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)和适配体CoV2-RBD-1C,结合DNA自组装技术,构建了一种简单、廉价和灵敏的比色传感方法,用于新型冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)的检测。方法通过ACE2特异性捕获新型冠状病毒S蛋白,再利用适配体CoV2-RBD-1C将固定探针T固定于S蛋白上,接着,探针T启动X1、X2和L探针的交联聚合形成具有大量DNA双链的DNA纳米枝。最后,利用DNA纳米枝嵌插大量的SYBR Green I(SG)作为信号分子,催化氧化显色底物四甲基联苯胺(tetramethyl benzidine,TMB),实现S蛋白可视化检测。结果成功构建了一种基于ACE2和适配体CoV2-RBD-1C的可视化比色传感方法,其吸光度与S蛋白浓度在5~100ng/mL范围内成正比,检测限(S/N=3)为4.3053ng/mL,具有较高的灵敏度和选择性,已成功用于商业化新型冠状假病毒S蛋白的检测。结论成功构建的可视化比色传感方法,具有廉价、简单、灵敏、便携化、微型化等优点,有望用于新型冠状病毒肺炎(COVID-19)病人的大规模筛查和新冠环境监测。

基于分子对接技术筛选新型冠状病毒S蛋白-血管紧张素转化酶2小分子抑制剂

目的采用分子对接技术筛选新型冠状病毒S蛋白与血管紧张素转化酶2(ACE2)小分子抑制剂。方法化合物库采用Selleck中国天然产物库(目录号L1400,2054种天然产物)。新型冠状病毒S蛋白与ACE2蛋白共晶采用周强研究员课题组发表结果(PDB:6M17)。采用DiscoveryStudio软件进行分子对接。结果通过虚拟氨基酸突变实验确定了关键氨基酸,并在此基础上确定了结合空腔,进而从天然化合物库中筛选出11个具有潜在抑制新型冠状病毒S蛋白与ACE2作用的化合物:毛地黄皂苷、灰毡毛忍冬皂苷甲、连翘酯苷B、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙、常春藤苷D、桔梗皂苷D、松果菊苷、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、异绿原酸C。结论从天然产物库中筛选出潜在的新型冠状病毒S蛋白-ACE2小分子抑制剂,为抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)药物研究及处方筛选提供参考。

抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体的筛选、表达和鉴定

目的筛选特异性抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体序列,表达纯化重组抗SARS-CoV-2纳米抗体,评估其特性及应用潜能。方法基于前期构建的天然噬菌体纳米抗体展示库,以生物素化SARS-CoV-2 S蛋白受体结合结构域抗原为靶点,利用生物素-链霉亲和素液相筛选法、噬菌体-ELISA和测序筛选抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体序列;构建重组抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体表达载体,IPTG诱导表达并纯化,采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA分析其特征及应用潜能。结果成功获得2条抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体序列,并构建了相应原核表达菌;成功表达纯化重组抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体,其与SARS-CoV-2 S蛋白可特异性结合。结论筛选及表达的重组抗SARS-CoV-2 S蛋白纳米抗体为其应用于SARS-CoV-2检测和治疗及相关研究提供基础。

新型冠状病毒(2019-nCoV)相关研究进展

自2019年12月底,湖北武汉暴发新型冠状病毒(2019-nCoV)感染疫情,截至2020年2月20日全国发现感染病例累计7万余例,2019-nCoV传播速度快,影响大。为尽快了解2019-nCoV感染的发生、发展进程,本文对2019-nCoV相关研究进行综述,以进一步了解其致病机制,科学、合理的采取诊疗措施,积极预防和控制疫情。