冬凌草甲素对脑缺血再灌注模型AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路调控研究

目的探讨冬凌草甲素(ORI)通过调控AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路介导的线粒体功能,减轻局灶性脑缺血再灌注(CIR)损伤。方法随机将PC12细胞分为5组:Control组,细胞正常培养不做处理;氧-葡萄糖剥夺和再灌注组(OGD/R组),使用PC12细胞建立氧-葡萄糖剥夺和再灌注模型;氧-葡萄糖剥夺和再灌注组+ORI(OGD/R+Orbicin),PC12细胞建立氧-葡萄糖剥夺和再灌注模型前使用ORI预处理PC12细胞4h;氧-葡萄糖剥夺和再灌注组+ORI+化合物C组(OGD/R+Orbicin+CC),氧-葡萄糖剥夺和再灌注前加入化合物C(3μmol·L^(-1)6h)以抑制AMPK信号传导,同时使用ORI预处理PC12细胞4h;氧-葡萄糖剥夺和再灌注组+ORI+si-SIRT1组(OGD/R+Orbicin+si-SIRT1),在氧-葡萄糖剥夺和再灌注前,使用ORI预处理PC12细胞4h,并将si-SIRT1转染至PC12细胞中,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)测定法评估PC12细胞的细胞活力,酶联免疫法定量乳酸脱氢酶(LDH)释放量,丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)和过氧化氢酶(CAT)活性,实时定量聚合酶链式反应(PCR)测定AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)、沉寂信息调节因子(SIRT1)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助因子1-α(PGC-1α)mRNA水平,蛋白印迹(Western blot)分析胱天蛋白酶3(caspase-3)、活化半胱胺酸蛋白酶蛋白-3(cleave-caspase-3)、AMPK、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、SIRT1、PGC-1α、核呼吸因子1(NRF1)、线粒体转录因子A(TFAM)、叉头框蛋白O1(FOXO1)的蛋白表达情况。结果在PC12细胞的OGD/R模型中,ORI降低NO、MDA水平和LDH泄漏释放水平,通过上调SOD、ATP和CAT酶活性提高抗氧化能力,上调了AMPK、SIRT1和PGC-1αmRNA的表达,抑制cleave-caspase-3的蛋白表达,上调p-AMPK、SIRT1、PGC-1α、NRF1、TFAM和FOXO1蛋白表达。然而,这些作用分别被化合物C(一种特异性AMPK抑制剂)和si-SIRT1消除。结论ORI可以通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路改善线粒体能量代谢和减少氧化应激来减轻局灶性CIR损伤。

冬凌草素诱导非小细胞肺癌细胞凋亡的作用及机制研究

研究冬凌草素对非小细胞肺癌(A549、H1299)细胞增殖、凋亡及自噬效用,并明确其潜在的作用机制。使用不同浓度冬凌草素分别干预A549、H1299细胞,采用CCK8(cell counting kit-8)检测细胞活性,筛选最佳的药效浓度;以10、50μg/mL冬凌草素及顺铂5μg/mL分别干预A549、H1299细胞24 h,流式细胞计数观察冬凌草素对A549、H1299细胞凋亡的影响,蛋白质印迹(Western blot,WB)检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3剪切体(Cleaved-Caspase3)、B淋巴细胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase9)、微管相关蛋白轻链3I(microtubule-associated protein light chain 3 isoform I,LC3I)、微管相关蛋白轻链3II(microtubule-associated protein light chain 3 isoform II,LC3II)、Bax、p62、Beclin-1表达;A549细胞过表达Beclin-1并用50μg/mL冬凌草素干预,WB检测Beclin-1相关蛋白。冬凌草素浓度依赖性抑制A549及H1299细胞增殖(P<0.05),IC 50值分别为38.2、46.6μg/mL;冬凌草素可增强A549、H1299细胞中Bax、Cleaved-Caspase3、Caspase3、Caspase9、p62蛋白表达(P<0.05);抑制A549、H1299细胞中LC3-I、LC3-II、Beclin-1蛋白表达(P<0.05);冬凌草素能减少过表达Beclin-1非小细胞肺癌细胞中Beclin-1、LC3-II、p62蛋白表达(P<0.05)。冬凌草素可抑制非小细胞肺癌细胞体外活性,可能与其抑制Beclin-1蛋白表达减少自噬而诱发细胞凋亡有关。

冬凌草甲素对人软骨肉瘤SW-1353细胞迁移和侵袭能力的影响

为探究冬凌草甲素对人软骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力的影响,体外培养人软骨肉瘤SW-1353细胞,将试验分别设为对照组(不做干预),1.25、2.50、5.00μmol/L冬凌草甲素组(1.25、2.50、5.00μmol/L冬凌草甲素)和阳性药物组(6μmol/L阿霉素),检测人软骨肉瘤SW-1353细胞的活力、迁移率、侵袭能力、上皮-间质转化(EMT)蛋白表达量。结果显示:与对照组比较,5.00μmol/L冬凌草甲素组和阳性药物组人软骨肉瘤SW-1353细胞活力降低(P<0.05);1.25、2.50、5.00μmol/L冬凌草甲素组和阳性药物组迁移率及侵袭能力降低,且浓度越高变化越显著(P<0.05)。冬凌草甲素能够通过升高E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达、降低波形蛋白(vimentin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)的表达量进而抑制EMT进程,且浓度越高变化越显著(P<0.05)。冬凌草甲素可显著抑制人软骨肉瘤SW-1353细胞的迁移和侵袭,或是通过介导EMT实现的,这为人软骨肉瘤细胞的生物学研究提供了理论基础。

冬凌草甲素介导Sirt1信号轴抑制溃疡性结肠炎的机制研究

目的:利用葡聚糖硫酸钠盐(DSS)构建小鼠溃疡性结肠炎(UC)模型,探讨冬凌草甲素(Ori)通过介导Sirt1信号通路缓解UC的作用及分子机制,寻找治疗UC的新药。方法:60只BALB/c小鼠随机分为正常组(NC)、模型组(DSS)、DSS+美沙拉嗪缓释颗粒组(AC)、DSS+低剂量Ori组(Ori-L)、DSS+中剂量Ori组(Ori-M)和DSS+高剂量Ori组(Ori-H),每组10只。除NC组外,其余各组小鼠自由饮用3%DSS水溶液7 d,造模成功后,Ori-L组、Ori-M组和Ori-H组分别灌胃50、100、150 mg/kg Ori混悬液,NC组及DSS组自由饮用蒸馏水,AC组灌胃美沙拉嗪缓释颗粒100 mg/kg,连续治疗10 d。记录小鼠体质量变化并进行疾病活动指数(DAI)评分;治疗结束后,ELISA检测血清IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;摘取完整结肠组织,测量长度,进行HE染色,实时荧光定量PCR和Western blot检测各组结肠组织Sirt1、NF-κB和p53表达。结果:造模成功后,与NC组相比,其余5组小鼠出现体质量下降、DAI评分升高以及结肠长度缩短现象,Sirt1表达受到明显抑制,NF-κB和p53表达显著升高,且伴有明显炎症病理学特征。相较于DSS组,Ori-L、Ori-M和Ori-H以及AC组小鼠实验期间体质量减轻幅度较小,DAI评分显示其疾病活动较低,且结肠长度缩短程度相对较小,Sirt1表达受抑制程度较低,NF-κB和p53表达上升幅度相对较小,AC组结果证明Ori对UC有治疗效果。结论:Ori能改善小鼠UC,其作用可能与调控Sirt1信号有关。

冬凌草甲素对人软骨肉瘤SW-1353细胞的增殖和凋亡的影响及其机制探究

目的探究冬凌草甲素对人软骨肉瘤细胞增殖、凋亡及p38 MAPK信号通路的调控作用。方法体外培养人软骨肉瘤SW-1353细胞,分为对照组(等量体积DMSO溶剂),5、10、15μmol/L冬凌草甲素组(5、10、15μmol/L冬凌草甲素)、10μmol/L冬凌草甲素+抑制剂组(10μmol/L冬凌草甲素+20μmol/L p38 MAPK通路抑制剂SB203580)和阳性药物组(6μmol/L阿霉素)。用倒置显微镜、活细胞计数(CCK-8)、5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)、Hoechst 33258染色、RT-qPCR及蛋白免疫印迹(WB)法对细胞形态、增殖活性、增殖率、凋亡情况、相关因子表达水平进行分析。结果与对照组比较,实验组、10μmol/L冬凌草甲素+抑制剂组和阳性药物组SW-1353细胞增殖活性、增殖率、cyclin D1及p-p38 MAPK表达水平显著降低,而细胞凋亡数量和caspase-3表达水平增加,且浓度越高变化越显著(P<0.05),与10μmol/L冬凌草甲素组相比,抑制剂的加入使各指标变化更显著。结论冬凌草甲素可通过抑制p38 MAPK通路抑制人软骨肉瘤SW-1353细胞的增殖诱其凋亡。

复方冬凌草含片微生物限度检查方法学研究

目的建立适用于复方冬凌草含片的微生物限度检查方法,以保证其质量和安全性。这个方法要能测量需氧菌的数量、霉菌和酵母菌的数量,并且限制菌中的肠道埃希菌。方法根据《中华人民共和国药典(2020年版)》第四部分中通用规则1107的规定,本研究对该方法的适应性和回收效率进行了评估和测试。试验中,本研究采用常规法和稀释法,对复方冬凌草含片样品进行菌落计数。结果复方冬凌草含片具有显著的抑菌作用。利用标准方法进行测试,结果显示,复方冬凌草对各种细菌如青色链状真菌(pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)及白色念珠菌(candida albicans)等有良好的抑制作用。同时,对黑色发霉体与酿酒酵母也有较好的控制能力。然而通过降低浓度的方法检测时,无论是需要空气的微生物还是发酵类生物都呈现出了较低水平,即低于或接近于0.5的比例值上限。在控制菌检查中,采用常规法检出了阳性菌。结论成功地建立了一种适用于复方冬凌草含片微生物限度检查的稀释法。该方法能可靠地评估复方冬凌草含片的微生物质量,并为其合规生产提供了可行的检测方案。

冬凌草甲素调节JAK2/STAT3/SOCS-1信号通路对糖耐量异常大鼠胰岛素抵抗的影响

目的探讨冬凌草甲素(Oridonin,Ori)对糖耐量异常(impaired glucose tolerance,IGT)大鼠胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)的影响及作用机制。方法采用高脂饮食喂养联合链脲佐菌素注射法构建IGT大鼠IR模型,大鼠分为正常组(CT组)、IGT模型组(IGT组)、Ori组(10 mg·kg^(-1)·d^(-1))、Ori+Colivelin(COL)组(10 mg·kg^(-1)·d^(-1)Ori+2 mg/kg COL),每组6只。血糖检测仪测定空腹血糖(FPG)、葡萄糖耐量试验(OGTT)2 h血糖(2 hPG),ELISA试剂盒测定空腹胰岛素(FINS)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),血液自动分析仪测定血清胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平,HE染色观察肝脏病理形态,Western blot验证附睾脂肪磷酸化(p)-激活Janus激活激酶2(JAK2)、JAK2、p-信号转导和转录激活因子3(STAT3)、STAT3、p-细胞因子信号传导抑制蛋白1(SOCS-1)、SOCS-1蛋白表达。结果与CT组比较,IGT组大鼠肝脏细胞肿胀,胞浆内可见大量大小不一的脂肪空泡,细胞核被脂肪空泡挤压偏位,且发生炎性细胞浸润,FPG、2hPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、MCP-1、TNF-α以及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、p-SOCS-1/SOCS-1蛋白表达水平升高,血清HDL-C水平下降(P<0.05);与IGT组相比,Ori组大鼠肝脏细胞胞浆内脂肪滴及空泡数量明显减少,细胞肿胀有所缓解,未见炎性细胞浸润,FPG、2hPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、MCP-1、TNF-α以及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、p-SOCS-1/SOCS-1蛋白表达水平下降,血清HDL-C水平升高(P<0.05);与Ori组相比,Ori+COL组大鼠肝脏脂肪变状况加剧,细胞肿大,血清FPG、2hPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、MCP-1、TNF-α以及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、p-SOCS-1/SOCS-1蛋白表达水平升高,血清HDL-C水平下降(P<0.05)。结论Ori对IGT大鼠IR的缓解作用可能与抑制JAK2/STAT3/SOCS-1信号通路激活有关。

冬凌草甲素介导Notch信号通路对多发性骨髓瘤细胞生长水平、凋亡率及异常转化情况研究

目的探究冬凌草甲素介导Notch信号通路对多发性骨髓瘤细胞生长水平、凋亡率及异常转化情况。方法选取U266细胞、RPMI8226细胞和KAS-6/1细胞,采用CCK8法检测细胞生长水平,采用酶标仪492 nm处检测光密度检测物厚度D值测定细胞的生长抑制率,随后采用流式细胞仪检测RPMI8226细胞和U266细胞的凋亡情况,最后对所检测细胞进行异常转化的观察。结果研究组U266细胞、RPMI8226细胞和KAS-6/1细胞的生长水平均明显低于对照组(P<0.05)。研究组干预后Notch 1-siRNA与核因子κB(NF-κB)-siRNA表达水平变化明显优于对照组(P<0.05)。研究组RPMI8226细胞、U266细胞凋亡率明显优于对照组(P<0.05)。研究组异常转染、异常克隆、异常增生的发生率明显低于对照组(P<0.05)。结论冬凌草甲素能够明显抑制多发性骨髓瘤U266细胞、RPMI8226细胞、KAS-6/1细胞体外生长,有效激活Notch信号通路调节诱导肿瘤细胞凋亡过程,值得临床推广应用。

冬凌草甲素调节HMGB1/TLR4信号通路对急性牙髓炎大鼠的改善作用

目的探讨冬凌草甲素调节高迁移率族蛋白B1(HMGB1)/Toll样受体4(TLR4)信号通路对急性牙髓炎大鼠的改善作用。方法将SD大鼠分为冬凌草甲素高剂量组(20 mg/kg)、冬凌草甲素低剂量组(10 mg/kg)、冬凌草甲素高剂量+rHMGB1组(20 mg/kg冬凌草甲素+8μg/kg rHMGB1)、模型组、对照组,每组10只。记录大鼠面部梳理时间以评估疼痛行为学变化;酶联免疫吸附法(ELISA)检测肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-8、IL-10、趋化因子(CX3CL1)、血红素加氧酶-1(HO-1)水平;检测牙髓组织超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠牙髓组织病理学改变;RT-qPCR检测HMGB1 mRNA和TLR4 mRNA表达;Western blotting检测HMGB1、TLR4、核转录因子-κB(NF-κB)、p-NF-κB、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白水平。结果与模型组相比,冬凌草甲素低、高剂量组大鼠面部梳理时间、血清IL-1β、TNF-α、IL-8、CX3CL1、HO-1水平、牙髓组织MDA含量、HMGB1 mRNA和TLR4 mRNA表达、HMGB1、TLR4、p-NF-κB/NF-κB、Bax蛋白表达降低,血清IL-10水平、牙髓组织SOD活性、Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05);重组蛋白rHMGB1可部分逆转冬凌草甲素对急性牙髓炎大鼠的改善作用(P<0.05)。结论冬凌草甲素可能通过抑制HMGB1/TLR4信号通路降低急性牙髓炎大鼠炎症反应、氧化应激,抑制组织细胞凋亡,减轻牙髓组织损伤,缓解牙髓炎。

冬凌草及冬凌草甲素对类风湿关节炎血瘀证小鼠炎症模型的影响

目的研究中药冬凌草(Rabdosia Rubescens,RR)及其主要活性成分冬凌草甲素(Oridonin,ORI)对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)血瘀证小鼠炎症模型的炎症影响,为RA血瘀证提供新的治疗药物。方法将C57BL/6雌性小鼠随机分为对照组(Control组)、模型组(Model组)、低浓度RR组(L-RR组)、高浓度RR组(H-RR组)、低浓度ORI组(L-ORI组)、高浓度ORI组(H-ORI组),每组6只。除Control组外,其余5组小鼠双侧后肢足垫内注射1次10μL乳化的完全弗氏佐剂,背部皮下注射0.1 mg/kg盐酸肾上腺素注射液2 h后,置于4℃冷水中游泳5 min,1次/d,连续7 d。L-RR组、H-RR组灌胃240、480 mg/(kg·d)的RR溶液,L-ORI组、H-ORI组腹腔注射20、40 mg/(kg·d)的ORI溶液,1次/d,连续14 d。每3天测量小鼠后足足掌的厚度;治疗14 d后,称量小鼠体质量,评估关节炎指数评分,ELISA法检测足趾血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-6浓度,HE染色、番红固绿染色检测踝关节组织破坏程度。结果各组间体质量差异均无统计学意义(P>0.05)。与Contorl组比较,Model组关节肿胀、关节炎症细胞浸润、滑膜增生、软骨被破坏,后足足掌厚度、关节炎指数评分及TNF-α、IL-6、IL-1β、VEGFA浓度均增加(P<0.05)。与Model组比较,L-RR组、H-RR组、L-ORI组、H-ORI组关节肿胀症状减轻;H-RR组、L-ORI组、H-ORI组第22天后足足掌厚度降低(P<0.05);H-RR组、H-ORI组的关节炎指数评分降低(P<0.05);H-RR组、L-ORI组、H-ORI组TNF-α、IL-6、IL-1β浓度降低(P<0.05);H-RR组、L-ORI组、H-ORI组VEGFA浓度降低(P<0.05);L-RR组、H-RR组、L-ORI组、H-ORI组的踝关节组织中炎症细胞浸润、滑膜增生及软骨破坏均减少。结论RR、ORI可改善血瘀证RA小鼠模型关节肿胀、后足足掌厚度,降低关节炎指数评分及炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β和VEGFA的浓度,并能减少踝关节组织中炎症细胞浸润、滑膜增生及软骨破坏,说明RR及其主要活性成分ORI具有治疗RA血瘀证炎症模型的作用,VEGFA可能作为RA血瘀证疗效评估的指标。

冬凌草体细胞胚诱导及其组织细胞学观察

为建立冬凌草(Isodon rubescens)体细胞胚发生体系,更好地发挥在中医药学中的价值,促进资源稳定和利用,以冬凌草叶片为外植体,脱分化形成胚性愈伤组织,进一步增殖,诱导发育出体细胞胚,结合石蜡切片技术对冬凌草胚性愈伤组织及各阶段体胚进行组织细胞学观察,并探讨激素对植株再生的影响。结果表明:在B5+1.0 mg·L^(-1)2,4-D培养基中,叶片可脱分化形成淡黄色、颗粒状的胚性愈伤组织;在MS+1.0 mg·L^(-1)2,4-D+0.2 mg·L^(-1)6-BA培养基中,胚性愈伤组织增殖效果最好,净增殖量最大可达2.81 g;在体胚诱导中,最佳培养基为MS+1.5 mg·L^(-1) TDZ+0.2 mg·L^(-1) NAA,诱导率最高为91.33%;在MS+0.5 mg·L^(-1)6-BA+0.5 mg·L^(-1) IBA培养基中,表面含体细胞胚的胚性愈伤组织可分化出小植株;在组织细胞学观察中,胚性愈伤组织呈淡黄色或黄白色颗粒状,细胞核大且明显,其内部观察到外起源和内起源2种体胚发生方式,后期可发育为球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶形胚或成簇状胚结构,内含淀粉粒。该研究成功建立了冬凌草间接体胚发生体系,为优化冬凌草胚性愈伤组织的“质”与“量”奠定基础,也为其分子育种及体胚技术研究提供了理论依据。

冬凌草甲素对人瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞生物学行为的影响及作用机制

目的探讨冬凌草甲素(ORI)对人瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞(HKF)的影响及作用机制。方法CCK-8法检测ORI对HKF的增殖活性的影响,实验分为对照组和实验组,细胞划痕和transwell实验检测HKF的迁移和侵袭能力,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测ORI对HKF的细胞外基质形成相关mRNA和纤维连接蛋白1(FN1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)、COLⅢ表达的影响。实验分为对照组、模型组和转化生长因子(TGF)-β1+ORI组,用RT-qPCR和Western blot检测ORI对HKF内TGF-β1诱导的相关mRNA和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、Smad2、Smad3、磷酸化Smad2蛋白(p-Smad2)、p-Smad3表达的影响。结果CCK-8显示随着ORI浓度增加,HKF细胞抑制率逐渐增加;与对照组比较,实验组细胞24 h迁移面积、侵袭细胞数显著下降,FN1、α-SMA、COL I、COLⅢ表达水平显著下降(P<0.05);与对照组相比,模型组NLRP3、ASC、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3表达显著升高(P<0.05);与模型组相比,TGF-β1+ORI组NLRP3、ASC、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3表达显著下降(P<0.05)。结论ORI通过阻断TGF-β1/Smad信号通路和NLRP3介导的炎症反应,抑制HKF的增殖、迁移和侵袭能力以及细胞外基质的形成和沉积。

冬凌草甲素对食管鳞状细胞癌细胞内谷胱甘肽代谢网络影响的研究

目的探究冬凌草甲素(ORI)对人食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞KYSE-150内谷胱甘肽代谢网络(GMN)中13个主要代谢物的影响,包括半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(HCys)、谷胱甘肽(GSH)、甲硫氨酸(Met)、S-腺苷高半胱氨酸(SAH)、胱硫醚(Cysta)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酰半胱氨酸(GC)、半胱氨酰甘氨酸(CG)、O-乙酰丝氨酸(OAS)和丝氨酸(Ser)。方法首先,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测ORI对人ESCC细胞KYSE-150活性的影响,以半抑制浓度(IC50)作为后续细胞培养的干预浓度。将KYSE-150细胞按照不同的培养时间分为0 h、12 h、24 h、36 h组,以0 h组作为对照(空白培养液),12 h、24 h、36 h组采用含ORI的培养液(12.5μmol/L)对细胞进行相应时间的干预。然后,采用超声提取法提取细胞中的内容物,利用液相色谱-质谱(LC-MS)法直接检测ORI与GMN中巯基代谢物结合形成的缀合物,利用LC-MS结合化学衍生的方法检测13个目标GMN代谢物。最后,通过活性氧(ROS)检测试剂盒检测细胞提取物中ROS水平。结果①ORI对人ESCC细胞KYSE-150有明显的抑制作用,IC50值为12.5μmol/L。②与0 h组相比,ORI干预后的3组KYSE-150细胞内GMN中的大部分代谢物(CG、GSH、GC、Cly、Glu、SAH、Cys、OAS和Cysta),尤其是含巯基的代谢物(CG、GSH、GC和Cys),浓度呈现先升高后下降的趋势。③在细胞提取物中检测到ORI与Cys、HCys、GSH这3个巯基内源性代谢物反应生成的缀合物。④ORI干预后KYSE-150细胞内ROS水平持续升高。结论ORI可能通过影响KYSE-150细胞内GMN中代谢物水平引起ROS的蓄积,进而降低细胞对抗脂质过氧化和氧化应激的能力。

冬凌草药渣固体发酵工艺条件优化

为筛选出冬凌草药渣固体发酵工艺的最适条件,研究不同接种量、不同料液比、不同发酵时间、不同发酵温度处理下酵母菌、乳酸菌固体发酵工艺对冬凌草药渣中齐墩果酸、熊果酸、粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、钙、粗灰分、赖氨酸含量变化的影响,并对其进行相关性和主成分分析。结果表明,酵母菌固体发酵最优条件:接种量6%、料液比1∶1.2、发酵时间3 d、发酵温度28℃。此条件下,粗蛋白、粗脂肪、钙、粗灰分、齐墩果酸、熊果酸含量分别相较于发酵前提高0.93%、23.08%、13.89%、19.74%、15.00%、16.22%,粗纤维含量相较于发酵前减少1.19%。齐墩果酸含量与熊果酸含量相关性达到0.86,呈极显著正相关,粗蛋白含量与钙、粗灰分、赖氨酸含量相关性分别达到0.95、0.97、0.90,呈极显著正相关。乳酸菌固体发酵最优条件:接种量6%、料液比1∶1.2、发酵时间6 d、发酵温度28℃。此条件下,粗蛋白、粗脂肪、钙、粗灰分、赖氨酸含量分别相较于发酵前提高33.02%、23.08%、74.07%、51.32%、21.21%,粗纤维含量相较于发酵前减少24.76%。粗蛋白含量与赖氨酸含量相关性达到0.77,呈极显著正相关。综上,酵母菌和乳酸菌固体发酵方法均可使冬凌草药渣的营养价值得到提高。

利用网络药理学和分子对接技术分析“猫爪草-冬凌草”对肝癌的治疗作用机制

目的利用网络药理学和分子对接技术对猫爪草与冬凌草进行分析,探讨其治疗原发性肝癌的作用机制。方法基于对中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)与传统中药百科全书(ETCM)数据库的检索,掌握有关药物的有效成分与其作用靶点,借助有机小分子生物活性数据库(PubChem)以及小分子药物预测作用靶点平台(Swiss Target Prediction)的支持下,收集一系列肝癌的靶点。参照蛋白互作数据库(STRING)进行药物与肝癌的蛋白互作(PPI)网络的构建。在将网络系统应用于探索药物的抗癌过程和作用机理的同时,结合Cytoscope 3.9.1软件成功构建“成分-靶点-通路”体系,并借助Metascape功能实现对共同靶点和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路的富集处理。此外,利用分子模拟软件AutoDock展开活性成分与关键靶点间分子对接情况的探究,获取所需的系列研究成果。结果筛选出冬凌草与猫爪草的有效活性成分分别有23、9个;两味药的药物靶点总共1020个,共同交集靶点299个;药物和肿瘤疾病共有26个常见靶点。KEGG通路的富集显示,药物靶点涉及的通路主要有癌症通路、脂质与动脉粥样硬化通路、PI3K-Akt信号通路等。结论猫爪草与冬凌草相须配伍,具有多成分、多靶点、多通路的作用特点,能协同发挥抗肝癌作用,为后续机制研究提供了切实可行的参考依据。

基于冬凌草全长转录组的TIFY基因家族鉴定与表达分析

【目的】TIFY蛋白是茉莉酸(JA)信号通路的关键调节因子,在植物生长发育、非生物胁迫以及次生代谢产物的积累中具有显著的调控作用,揭示冬凌草(Isodon rubescens)的TIFY基因可为冬凌草的抗逆性改良育种和次生代谢产物合成研究提供理论依据。【方法】基于冬凌草三代全长转录组序列,通过生物信息学方法对冬凌草TIFY基因家族进行鉴定和分析,并采用RT-qPCR技术分析其在不同组织中的表达特性。【结果】(1)成功从冬凌草中鉴定出12个TIFY家族基因成员;(2)理化性质分析表明,其氨基酸长度124~378 aa,分子量13924.89~39692.38 Da,等电点5.05~9.69;除IrTIFY10蛋白为稳定蛋白,其他均为不稳定蛋白;IrTIFYs蛋白的亚细胞定位均在细胞核,均为亲水性蛋白,且不含信号肽。(3)结构分析表明,IrTIFY家族蛋白成员无跨膜结构,二级结构中含量最多的结构类型为无规则卷曲;且含有多个磷酸化位点。(4)密码子偏好性分析结果表明,IrTIFY基因家族密码子偏好性较弱,稍倾向于使用以A或U结尾的密码子。(5)启动子元件分析表明冬凌草TIFY家族成员中存在多个光响应元件、激素响应元件和逆境响应元件等,但不同成员之间的元件存在差异。(6)进化树分析表明,冬凌草TIFY家族12个成员分为PPD(IrTIFY2)、ZML(IrTIFY3/8/10)、TIFY(IrTIFY7/12)和JAZ(IrTIFY1/4/5/6/9/11)4个亚家族,进化上与同为唇形科的丹参(Salvia miltiorrhiza)亲缘关系最近。(7)RT-qPCR分析结果显示冬凌草TIFY家族12个成员在不同组织中的表达量均表现为叶>茎>根,且大部分成员存在显著差异。【结论】TIFY基因家族在冬凌草的生长发育过程中可能发挥重要的调控作用,并且可能参与调控冬凌草次生代谢产物的合成,为进一步深入研究冬凌草TIFY基因家族的功能奠定基础和提供了思路。

冬凌草甲素对海马CA1星形胶质细胞P2X7受体电流的影响

目的:探索冬凌草甲素是否对海马CA1星形胶质细胞P2X7受体电流有影响。方法:采用Autodock软件对冬凌草甲素与P2X7蛋白进行分子对接;采用全细胞膜片钳记录冬凌草甲素对海马CA1星形胶质细胞P2X7受体激动剂Bz-ATP激发电流的影响。结果:冬凌草甲素与P2X7蛋白的结合能为-5.86 kcal/mol,可与P2X7蛋白的Lys592残基形成氢键,与Tyr550残基形成疏水作用;Bz-ATP能激发海马CA1区星形胶质细胞的电流反应,且1000μmol/L Bz-ATP激发的电流反应较强;10μmol/L冬凌草甲素溶液孵育1 h后,海马CA1区星形胶质细胞对谷氨酸能受体激动剂NMDA和AMPA溶液的电流反应无明显变化;对Bz-ATP的电流反应降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:冬凌草甲素可与P2X7蛋白对接形成稳定的复合物,具有较好的亲和力;冬凌草甲素可抑制海马CA1星形胶质细胞P2X7受体电流。

冬凌草甲素对人鼻咽癌HONE-1细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的:探讨冬凌草甲素对人鼻咽癌HONE-1细胞增殖、迁移、上皮-间质转化(EMT)和凋亡的影响,阐明其相关抗肿瘤机制。方法:鼻咽癌HONE-1细胞经不同浓度(0、5、10、20、40、80和160 mg·L^(-1))冬凌草甲素处理48 h后,采用CCK-8法检测各组细胞增殖抑制率,确定后续实验的用药浓度。HONE-1细胞分为对照组、3 mg·L^(-1)冬凌草甲素组和6 mg·L^(-1)冬凌草甲素组,培养24和48 h后,采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性,5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)法检测各组细胞中EdU阳性细胞率,克隆形成实验检测各组细胞中克隆形成数,Transwell小室实验和细胞划痕实验检测各组细胞中迁移细胞数和划痕愈合率,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)和细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)mRNA表达水平,Western blotting法检测各组细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)和多腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP1)蛋白表达水平。结果:CCK-8法确定冬凌草甲素48 h半数抑制浓度(IC50)为12.18 mg·L^(-1),以1/4 IC50和1/2 IC50值为后续实验用药浓度。与对照组比较,24和48 h时3和6 mg·L^(-1)冬凌草甲素组细胞增殖活性降低(P<0.05或P<0.01),EdU阳性细胞率降低(P<0.05或P<0.01),细胞中克隆形成数和迁移细胞数减少(P<0.05或P<0.01),划痕愈合率降低(P<0.05或P<0.01),细胞中CDK1和CDK4 mRNA表达水平降低(P<0.05或P<0.01),E-cadherin、Caspase-3和PARP1蛋白表达水平升高(P<0.05或P<0.01),Vimentin蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:冬凌草甲素可通过抑制细胞周期相关蛋白的表达及EMT,进而抑制人鼻咽癌HONE-1细胞增殖、克隆形成和迁移能力,促进细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。

冬凌草甲素调节Hippo/YAP信号通路对骨质疏松大鼠成骨细胞凋亡的影响

目的:探讨冬凌草甲素(Ori)调节Hippo/Yes相关蛋白(YAP)信号通路对骨质疏松(OP)大鼠成骨细胞凋亡的影响。方法:随机选取10只大鼠为假手术组仅分离但不切除卵巢,其余大鼠通过切除双侧卵巢建立OP模型,将造模成功的大鼠随机分为OP组、不同剂量Ori(5mg/kg Ori、10mg/kg Ori、20mg/kg Ori)组、20mg/kg Ori+Hippo/YAP激活剂-Verteporfin(10mg/kg)组。干预后,收集腹主动脉血液,ELISA检测血清中骨钙素(BGP)、碱性磷酸酶(ALP)水平;分离股骨组织,双能X射线骨密度仪检测股骨矿含量、骨密度;HE检测股骨组织形态学变化;TUNEL检测成骨细胞凋亡变化;Western blot检测YAP、转录共激活因子PDZ结合基序(TAZ)蛋白表达。结果:假手术组大鼠股骨结构变化不明显,与假手术组相比,OP组股骨组织形态发生明显改变,BGP、ALP水平、股骨组织矿含量、骨密度、YAP、TAZ蛋白表达显著降低(P<0.05),成骨细胞凋亡率显著增加(P<0.05);与OP组相比,5mg/kg Ori组、10mg/kg Ori组、20mg/kg Ori组股骨组织形态得到改善,BGP、ALP水平、股骨组织矿含量、骨密度、YAP、TAZ蛋白表达显著增加(P<0.05),成骨细胞凋亡率显著降低(P<0.05),不同剂量Ori间具有统计差异(P<0.05);与20mg/kg Ori组相比,20mg/kg Ori+Verteporfin组股骨组织形态变化加重,BGP、ALP水平、股骨组织矿含量、骨密度、YAP、TAZ蛋白表达显著降低(P<0.05),成骨细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。结论:Ori调节Hippo/YAP信号通路减少OP大鼠成骨细胞凋亡,减轻OP大鼠症状。

冬凌草甲素荧光碳量子点的制备及其在生物成像中的应用

碳量子点具有独特的荧光性质,是一种优良的光致发光材料。由于其良好的生物相容性,在生物医学成像领域得到了广泛的应用。然而,具有抗肿瘤活性的碳量子点却少有报道。冬凌草甲素(ORI)是一种抗癌药物,对多种类型的肿瘤细胞都有明显的抑制作用。本研究采用一种简单的溶剂一步水热法合成了具有荧光和抗肿瘤活性的ORI-CDs,并用透射电子显微镜、傅里叶变换红外光谱和X射线单晶衍射以及拉曼光谱对其进行了表征。光学性质的研究表明,ORI-CDs表现出优秀的光致发光性能。此外,我们观察了ORI-CDs的抗肿瘤活性和体内外荧光成像性能。我们的结果表明,ORI-CDs既可以作为生物成像材料,也可以作为抗肿瘤药物,这表明它们在未来的临床应用中具有巨大的潜力。