2D NMR方法研究抗癌药物冬凌草乙素的结构与谱线归属

用异核化学位移相关谱、远程异核化学位移相关谱和同核化学位移相关谱等现代核磁共振技术对抗癌中草药冬凌草中分离出的抗癌、抗菌有效成分冬凌草乙素分子的^(13)C和~1H化学位移进行了完全归属,为冬凌草乙素分子溶液中的三维空间结构研究提供了可靠的结构参数。

冬凌草乙素诱导GBC-SD细胞的凋亡及对Bcl-2、p53、Fas/APO-1、C-myc表达的影响

目的 探讨冬凌草乙素对人胆囊癌GBC SD细胞增殖抑制和诱导调亡的机制。方法 不同浓度的冬凌草乙素处理GBC SD细胞后 ,用MTT法检测GBC SD细胞的存活率 ,通过倒置显微镜、扫描电子显微镜、流式细胞仪、荧光分光光度计观察和分析凋亡细胞 ,用免疫组织化学法和流式细胞仪检测细胞内Bcl 2、p5 3、Fas/APO 1、C myc的表达。结果 冬凌草乙素浓度依赖性地抑制GBC SD细胞增殖及诱导其凋亡 ;药物作用 2 4h后 ,细胞内Bcl 2、p5 3、Fas/APO 1、C myc的表达有不同程度的下调 ;Caspase 3活性与凋亡程度相关。结论 冬凌草乙素抑制GBC SD细胞的增殖和诱导其凋亡与Bcl 2、p5 3、Fas/APO 1、C

高效液相色谱法测定冬凌草中冬凌草甲素及冬凌草乙素的含量

目的 :建立冬凌草的质量控制方法。方法 :高效液相色谱法同时对冬凌草中冬凌草甲素、冬凌草乙素进行了含量测定。采用 C1 8柱 ,以甲醇 -水 (5 5∶ 4 5 )为流动相 ,检测波长 2 38nm。结果 :冬凌草甲素的浓度在 0 .15 2～ 1.5 2 μg/ ml,冬凌草乙素的浓度在 0 .2～ 2 μg/ ml范围内 ,线性关系良好 (冬凌草甲素 r=0 .9998,n=5 ;冬凌草乙素 r=0 .9992 ,n=5 ) ,平均回收率冬凌草甲素为 99.1% ,RSD为 0 .4 % ;冬凌草乙素为 98.0 % ,RSD为 0 .6 %。结论 :该法准确、灵敏、可靠 ,可用于冬凌草的质量控制。

大鼠灌胃冬凌草乙素的药代动力学研究

建立冬凌草乙素血药浓度的高效液相色谱测定方法,并探讨其在大鼠体内的药代动力学特点.大鼠灌胃冬凌草乙素20 mg/kg后,于不同时间点采血,利用HPLC测定血药浓度,并求算药动学参数.冬凌草乙素在50～5 000μg/L浓度范围内线性关系良好(r=0.998 1),样品在血浆中的绝对回收率大于80%,日内、日间的RSD均小于15%,灌胃后其主要动力学参数AUC0-t,AUCt-∞,ke,T1/2,CL/F,Cmax,Tmax分别为(9.85±2.89)mg.h/L,(11.81±3.45)mg.h/L,(0.11±0.04)h-1,(3.52±1.16)h,(1.08±0.10)L/(kg.h),(3.07±2.30)μg/L,(0.67±0.33)h.所建立的定量分析方法精密、准确、选择性强,可用于冬凌草乙素在大鼠体内的药动学研究.根据药动学参数,可以得知冬凌草乙素在大鼠体内消除较快,不易蓄积.

[~3H]冬凌草乙素在小鼠体内的吸收、分布和排泄

采用液体闪烁计数技术研究[~3H]冬凌草乙素在小鼠体内的吸收、分布和排泄。给小鼠经口灌胃(ig)或尾静脉注射(iv)[~3H]冬凌草乙素后,很快被吸收并广泛分布到各组织中。其中以肺、胆囊和肝脏中放射性为最高;其次为肠、胃、胰腺等,肌肉、胸腺和骨中含量最少。iv[~3H]冬凌草乙素3.7×10~7Bq(1.23mg)/kg24h放射性自粪和尿中排泄占总注入量的58.3%。血中放射性—时间曲线表明药代动力学模型似符合二室开放模型。其各时相半衰期分别为T 1/2α=17.9min,T 1?2β=12.7h,其它动力学参数分别为K_(12)=1.38h^(-1),K_(21)=0.84h^(-1),K_(10)=0.15V_c=1.4L kg,V_d=3.9 L kg;ig[~3H]冬凌草乙素3.7×10~7Bq(1.23mg)kg,很快被吸收,其血中放射性—时间曲线似符合二室开放模型,其药代动力学参数分别为T_1 2Ka=17.0min,T_1 2K_e=11.3h.K_a=2.48h^(-1).K_e=0.001min^(-1).以ig和iv[~3H]冬凌草乙素血中放射性—时间曲线下面积计算生物利用度(F)为65%。

冬凌草乙素-β-环糊精包合物的研究

采用沉淀法制备出了冬凌草乙素－β－环糊精包含物，通过差示扫描量热法、薄层层析及比旋光度的测定得以证实．测定了紫外吸收光谱，用连续递变法测定了包合物组成的摩尔比．

冬凌草乙素联合放疗对肺癌A549细胞凋亡的协同作用及miR-16-5p/WEE1信号轴的影响

目的:探讨冬凌草乙素联合放疗对肺癌A549细胞凋亡的协同作用及微小RNA-16-5p(miR-16-5p)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(WEE1)信号轴的影响。方法:设A549细胞组、放疗组(6 Gy·min^(-1)的固定剂量率发射,照射孵育24 h)、冬凌草乙素组(20 mg·L^(-1))、放疗+冬凌草乙素组(冬凌草乙素浓度为20 mg·L^(-1),并以6 Gy·min^(-1)的固定剂量率发射,照射孵育24 h);培养结束后,CCK-8法测定细胞增殖水平,Transwell腔室系统测定细胞侵袭水平,流式细胞仪测定细胞凋亡水平,实时荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白免疫印迹法测定细胞miR-16-5p、WEE1 mRNA和蛋白水平。结果:与A549细胞组比较,放疗组、冬凌草乙素组、放疗+冬凌草乙素组光密度(OD)值、存活率、穿膜数、WEE1 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05),凋亡率、miR-16-5p表达显著升高(P<0.05);与放疗组、冬凌草乙素组比较,放疗+冬凌草乙素组OD值、存活率、穿膜数、WEE1 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05),凋亡率、miR-16-5p表达显著升高(P<0.05)。结论:冬凌草乙素联合放疗对肺癌A549细胞凋亡具有协同作用,其机制可能与冬凌草乙素促进miR-16-5p的表达进而抑制WEE1表达有关。

冬凌草甲素和冬凌草乙素与谷胱苷肽的迈克尔加成反应

采用紫外光谱动力学方法测定了抗肿瘤对映贝壳杉烯二萜冬凌草甲素和冬凌草乙素与谷胱苷肽迈克尔加成反应的级数、速率常数和平衡常数.结果表明,冬凌草甲素和冬凌草乙素与与谷胱苷肽迈克尔加成反应符合二级动力学方程,25℃下的速率常数分别为16.196 0L·(mol·s)-1和7.480 5L·(mol·s)-1,平衡常数分别为177.98L/mol和85.60L/mol.冬凌草甲素与谷胱苷肽迈克尔加成反应速率和反应程度均比冬凌草乙素的大得多,反应活性更好.对映贝壳杉烯二萜通过与机体发生迈克尔加成反应而产生抗肿瘤作用;因此,冬凌草甲素可能比冬凌草乙素具有更好的抗肿瘤活性.

冬凌草乙素对U937细胞的生长抑制作用及β-catenin表达水平的影响

目的:探讨冬凌草乙素对U937细胞的生长抑制作用及其作用机制。方法:以不同浓度的冬凌草乙素作用于体外培养的U937细胞,MTT法检测细胞生长抑制率,应用hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡;采用RT-PCR对细胞凋亡前后β-catenin的表达水平进行检测。结果:冬凌草乙素可显著抑制细胞的生长及诱导细胞发生凋亡,呈现出明显的量-效与时-效关系。在冬凌草乙素抑制细胞增殖过程中β-catenin的表达水平显著下降。结论:冬凌草乙素能抑制U937细胞的生长并诱导细胞发生凋亡,降低β-catenin的表达水平可能是其重要作用机制之一。这为冬凌草乙素抗白血病的进一步研究提供了有力的实验依据。

冬凌草乙素的电子结构与抗癌活性

采用ＭＮＤＯ方法，在ＶＡＸ８３５０计算机上，对冬凌草乙素进行量子化学计算。给出了分子轨道及其能级、电荷密度、键级。结果表明：抗癌活性区α亚甲基环戊酮结构中的部分原子组成了易接受电子的πＬＵＭＯ轨道。

冬凌草乙素通过Wnt/β-catenin信号通路对裸鼠K562细胞移植瘤的抑制作用

目的探讨单体化合物冬凌草乙素抑制K562细胞裸鼠皮下移植瘤的作用效果及可能的作用机制。方法建立K562皮下移植瘤裸鼠动物模型20只,将其随机分为模型对照组、冬凌草乙素低、高剂量(40、80 mg/kg)组、阳性对照组(羟基脲120 mg/kg),每组5只,腹腔连续给药18 d。每周测量各组裸鼠体质量和肿瘤体积,给药结束后处死动物并迅速取出肿瘤分析其抑瘤率。比较各组肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡和坏死情况;比较各组肿瘤组织中β-链蛋白(β-caterin)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、c-myc癌基因的信使RNA表达水平及蛋白的表达情况。结果冬凌草乙素能明显抑制裸鼠肿瘤生长体积,呈剂量依赖性并具有统计学意义(P<0.01)。冬凌草乙素组肿瘤细胞出现明显的凋亡和坏死现象。与模型对照组相比,冬凌草乙素组肿瘤组织β-链蛋白、cyclin D1和c-myc信使RNA的表达下调(P均<0.05)。与模型对照组相比,冬凌草乙素各剂量组均能下调肿瘤组织中的β-链蛋白、cyclin D1和c-myc蛋白的表达(P均<0.05)。结论冬凌草乙素能够抑制K562细胞裸鼠移植瘤,其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号传导通路实现的。

HPLC法测定冬麦利咽口服液中冬凌草甲素和冬凌草乙素的含量

目的建立HPLC法测定冬麦利咽口服液中冬凌草甲素和乙素含量的方法。方法采用Symmetry?C185.0μm4.6×250(mm)色谱柱,流动相为甲醇-水(52:48);流速1.00ml/min;检测波长239nm。结果冬凌草甲素在1.004～20.08ug?ml-1范围内线性关系良好(r=0.9997),平均回收率为99.68%,RSD=0.44%(n=6)冬凌草乙素在1.013～20.26ug?ml-1范围内线性关系良好(r=0.9990),平均回收率为98.86%,RSD=1.14%(n=6)。结论本方法操作简便,专属性强,结果准确,可用于冬麦利咽口服液的质量控制。

超滤法测定冬凌草乙素的血浆蛋白结合率

目的:建立大鼠血浆中冬凌草乙素的高效液相色谱(HPLC)分析方法,测定冬凌草乙素的血浆蛋白结合率,为临床安全用药提供参考。方法:采用超滤法结合HPLC法测定冬凌草乙素与大鼠血浆蛋白的结合率。结果:当冬凌草乙素在大鼠血浆中浓度为100,600,3 200 ng·mL-1时,冬凌草乙素与大鼠血浆的蛋白结合率分别为(70.9±3.4)%,(71.0±3.0)%,(69.6±2.9)%。结论:冬凌草乙素与大鼠血浆蛋白具有中等强度的结合,并且在考察浓度范围内血浆蛋白结合率无浓度依赖性。

冬凌草乙素对白血病K562细胞的诱导凋亡作用及机制研究

目的：探讨冬凌草乙素（ponicidin,PON）对白血病K562细胞的诱导凋亡作用及其作用机制。方法：以不同浓度的PON（10~50μmol.L-1）作用于体外培养的K562细胞24,48,72 h,应用MTT法检测细胞生长抑制率,收集药物作用72h后的细胞Annexin V染色并通过流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率,瑞氏-姬姆萨染色观察细胞凋亡时的形态学变化。应用免疫印迹法（Western blot）检测caspase-3及其裂解底物多聚（ADP-核糖）聚合酶PARP的表达水平,并对MAPKs（mitogen-acti-vated protein kinase）信号转导通路相关蛋白（p-P38,p-ERK和p-JNK）以及PI3K（磷脂酰肌醇-3-激酶）/AKT信号通路中的p-AKT,p-P85蛋白的表达水平进行检测。结果：30μmol.L-1以上的PON可显著抑制细胞的生长,并呈现出明显的量-效与时-效关系,FCM检测结果表明,不同浓度的药物作用72 h后,随药物浓度的增加细胞凋亡率逐渐升高,50μmol.L-1的PON作用不同时间后在瑞氏-姬姆萨染色下可见典型的核浓缩及核碎裂等细胞凋亡现象。Western blot检测结果表明,药物作用48 h后caspase-3被活化出现17 kD的亚单位,同时PARP被裂解出现89 kD的亚单位片段。Western blot检测结果进一步显示药物作用48 h后MAPKs信号途径中p-P38,p-ERK和p-JNK蛋白的表达水平无明显变化,而PI3K/AKT信号通路中的p-AKT,p-P85蛋白的表达水平则随着药物浓度增加而逐渐下降。结论：PON可以通过诱导白血病K562细胞调亡而发挥体外抗白血病作用。PON对K562细胞的诱导凋亡作用机制与caspse-3的活化以及降低PI3K/AKT信号通路中p-AKT及p-P85蛋白的表达水平有关,而与MAPKs信号通路中的相关调节蛋白无关;这些研究结果为进一步研究冬凌草素的抗白血病作用提供了有力的实验依据和技术平台。

信阳冬凌草甲素和乙素β-环糊精包合物的研究

采用沉淀法制备信阳冬凌草甲素和乙素-β-环糊精包合物,通过差示扫描量热法、薄层层析法及比旋光度测定证明了包合物的形成。用连续递变法测定了包合物的组成摩尔比。通过标准曲线测定了包合物的溶解度。

TLC测定冬凌草叶中冬凌草甲、乙素的含量

目的：研究冬凌草叶中冬凌草甲、乙素的含量测定。方法：采用薄层扫描法进行测定。结果：冬凌草甲素浓度在９．５０μｇ～４７．５０μｇ之间线性关系良好，相关系数ｒ＝０．９９９，回收率为９８．５４％，测定的ＲＳＤ＝１．４１％。冬凌草乙素浓度在９．９８μｇ～４９．９０μｇ之间线性关系良好，相关系数ｒ＝０．９９９，回收率为９８．０７％，测定的ＲＳＤ＝１．３５％。结论：本法简便、准确、灵敏，重现性好，可用于冬凌草的质量控制。由本法测定结果表明，生长在济源太行山区８月份的冬凌草叶中冬凌草甲。

大鼠在体单向肠灌流模型研究冬凌草乙素的吸收动力学

为测定冬凌草乙素在大鼠体内的吸收参数,研究冬凌草乙素的吸收动力学。采用高效液相色谱串联质谱法结合大鼠在体单向肠灌流吸收模型,从药物吸收部位、质量浓度和灌流介质等方面研究冬凌草乙素的各肠段吸收特征并计算吸收参数。结果在pH 6.5的灌流介质中冬凌草乙素较为稳定,肠道酶对其代谢影响较小,吸收显著高于pH 8.0碱性条件（P〈0.05）;不同质量浓度的冬凌草乙素在相同肠段吸收速率常数（Ka）、表观通透系数（Papp）无显著性差异,不同质量浓度的冬凌草乙素在大鼠十二指肠、空肠、结肠吸收速率常数（Ka）、表观通透系数（Papp）无显著性差异,但与回肠吸收参数具有显著性差异,均显著低于回肠吸收参数（P〈0.05）。盐酸维拉帕米对冬凌草乙素各肠段吸收均无显著性影响。结果表明10~1 000μg·L-1冬凌草乙素在大鼠全肠道均有吸收,其中回肠为最佳吸收部位,吸收特征为被动转运的线性动力学过程,无吸收饱和现象,弱酸性环境易于冬凌草乙素的肠道吸收,冬凌草乙素不是P糖蛋白的底物。

HPLC法测定Beagle犬血浆中冬凌草乙素浓度及药动学研究

目的:建立一种简便、快速、专属性好、选择性强的HPLC分析方法,测定Beagle犬血浆中冬凌草乙素的浓度,研究其药动学行为。方法:采用HPLC法测定Beagle犬静脉注射给药后不同时间血浆中冬凌草乙素的浓度;Zorbax Eclipse XDB C18柱分离(150 mm×4.6 mm,5μm);流动相为甲醇-磷酸盐缓冲液(pH6.0)(34∶66);流速为1.0 mL.min-1,进样量为20μL;紫外检测波长为232 nm;以非那西丁为内标,乙酸乙酯-异丙醇(95∶5)作为萃取剂。结果:本方法测定冬凌草乙素在20.0～4 000 ng.mL-1浓度范围内呈良好的线性关系,定量下限达20.0 ng.mL-1。日内、日间精密度及准确度均符合生物样品分析要求,RSD均在15%以内,提取回收率大于85%。Beagle犬静脉注射给药后,主要药动学参数t1/2,AUC0～t,AUC0～∞,CL分别为6.47 h,2 294 ng.h.mL-1,2 818 ng.h.mL-1,0.192 mL.kg-1.h-1。结论:本分析方法操作简便、专属性强、可行性高,可用于冬凌草乙素在Beagle犬体内的药动学研究。冬凌草乙素在Beagle犬体内呈二室模型,吸收迅速,消除相对较快。

冬凌草乙素与牛血清白蛋白相互作用及其机制研究

建立冬凌草乙素药物浓度的液相色谱-串联质谱分析方法,研究其与牛血清白蛋白(BSA)的结合情况以分析冬凌草乙素的血清蛋白结合机制。采用超滤法结合LC-MS/MS测定冬凌草乙素与牛血清白蛋白的蛋白结合率及相关结合常数,以Scatchard方程计算冬凌草乙素与BSA的结合常数(Ka)和结合位点数(n),并对冬凌草乙素与BSA的结合机制进行分析探究。结果显示冬凌草乙素与牛血清白蛋白的平均结合率为57.2%,且结合类型主要为一类强结合,相关参数为结合常数2.54×104L·μg^(-1),结合位点的数目为n=0.75。冬凌草乙素与牛血清白蛋白的结合在考察浓度范围内无浓度依赖。该研究建立的方法灵敏度高、专属性强、操作简单,能够满足分析要求,结合常数的求算为临床药物相互作用以及药动学研究奠定了基础。

冬凌草叶中冬凌草甲、乙素的含量测定

采用薄层扫描法测定了冬凌草叶中冬凌草甲、乙素的含量.结果表明:线性范围内冬凌草甲素的相关系数r=0.999,回收率为98.54%,RSD=1.41%;冬凌草乙素的相关系数r=0.999,回收率为98.07%,RSD=1.35%.本研究表明,生长在济源太行山区8月份的冬凌草叶中冬凌草甲、乙素的含量相对最高.