冬虫夏草菌菌丝体中的氨基酸及其衍生物的代谢组学分析

为探究冬虫夏草菌(Ophiocordyceps sinensis)菌丝体氨基酸及其衍生物的差异性,采用超高效液相色谱串联质谱(Ultra performance liquid chromatography,tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)技术对3株冬虫夏草菌(玉树菌株XSH、达日菌株DR、贵德菌株LJ)菌丝体的氨基酸及其衍生物进行靶向定量检测,利用主成分分析(Principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal signal correction and partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)考察样品分类情况、筛选差异代谢物。结果表明,3株菌株菌丝体中均检测到72种氨基酸及其衍生物,发现除组氨酸外可合成蛋白质的19种氨基酸,菌株XSH的总氨基酸及必需氨基酸绝对含量均高于其他菌株。菌株XSH相比菌株DR和菌株LJ分别含有29种和28种差异氨基酸及其衍生物,菌株DR相比菌株LJ含有10种差异氨基酸及其衍生物,此外,3株菌株菌丝体含有3个共有的差异氨基酸及其衍生物,分别为高精氨酸、N-乙酰-L-谷氨酰胺、肌氨酸。京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析显示,差异氨基酸及其衍生物在精氨酸和脯氨酸代谢通路中更活跃,不同产区冬虫夏草菌株的氨基酸含量可能受精氨酸和脯氨酸代谢通路的影响。基于研究结果发现不同产区的冬虫夏草菌株的氨基酸及其衍生物存在较大的差异。

发酵冬虫夏草菌粉水分腺苷的近红外光谱定量分析及波段选择

研究发现基于800～2 500nm波段的近红外光谱可对发酵冬虫夏草菌粉中水分和腺苷进行良好的定量分析。选取了4 277.63～4 316.20cm-1,4 887.06～4 941.07cm-1,5 056.78～5 172.50cm-1和5 218.78～5 303.64cm-1四个特征波段;4 902.49～4 817.64cm-1和4 740.49～4 107.91cm-1两个特征波段,分别对水分和腺苷建立了偏最小二乘法(partial least-square,PLS)回归模型。采用全波段建模水分和腺苷的预测相关系数r分别为0.868 3和0.788 2,预测均方根误差RMSEP分别为0.001 999和0.000 134,剩余预测偏差RPD分别为1.974 4和1.640 7。而采用特征波段建模,其对水分和腺苷的预测相关系数r分别为0.869 1和0.829 0,预测均方根误差分别为0.001 934和0.001 250,剩余预测偏差分别为2.040 7和1.847 6。结果表明,采用对这两项指标特征波长建模后,不仅预测效果有不同程度的提高,还提高了建模速度,为检测仪器的开发提供了依据。

人工冬虫夏草菌液对大鼠肺纤维化早期抗氧化作用的研究

目的探讨人工冬虫夏草菌液(虫草菌液)对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化早期抗氧化的作用。方法 48只SD大鼠,随机分为6组:正常对照组,模型组,强的松治疗组,虫草菌液低剂量[1.5 g/(kg.d)]、中剂量[5 g/(kg.d)]、高剂量[10 g/(kg.d)]治疗组。采用气管内注射博莱霉素建立模型,次日起分别给予生理盐水、生理盐水、强的松、虫草菌液(低、中、高剂量)灌胃治疗,第14天处死动物,肺组织标本进行病理形态学观察及肺泡炎评分,肺组织免疫组化检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS),肺泡灌洗液(BALF)检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量。结果虫草菌液和强的松能够减轻肺组织肺泡炎,降低BLAF中TNF-α、MDA含量,提高GSH、SOD含量,下调肺组织iNOS蛋白表达水平。结论虫草菌液对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化早期肺泡炎有治疗作用,可能是通过下调TNF-α、iNOS等细胞因子的表达、减少脂质过氧化物的释放而达到抗氧化作用。

人工冬虫夏草菌液对博莱霉素致小鼠肺纤维化的保护作用

目的:研究人工冬虫夏草菌液(cordyceps sinensi)对博莱霉素(BLM)致肺纤维化小鼠的保护作用。方法:小鼠随机分为4组,模型组经鼻滴入博莱霉素5 mg.kg-1建立肺间质纤维化模型,人工冬虫夏草菌液预防治疗组于滴入BLM前48 h予人工冬虫夏草菌液灌胃,人工冬虫夏草菌液治疗组于滴入BLM后第14天给人工冬虫夏草菌液灌胃,并与正常小鼠进行对照。第28天收获其支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织,右肺行苏木精-伊红(HE)和Masson三色染色,并观察电镜下细胞超微结构的改变,左肺经酸解法检测肺组织羟脯氨酸(HYP)含量,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测BALF中转化生长因子-β(transforming growth factor-β1,TGF-β1),干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ),白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)的浓度。结果:虫草菌液干预组与模型组比较,小鼠肺系数明显下降(P<0.05);肺泡炎、纤维化程度均有改善(P<0.05),其中人工冬虫夏草菌液防治组改善最明显;肺HYP含量下降(P<0.05);BALF中TGF-β,IL-4含量亦明显下降(P<0.05);防治组可使IFN-γ含量升高(P<0.05)。结论:人工冬虫夏草菌液可以在某种程度上减轻BLM诱导的肺泡炎及肺纤维化程度,对肺纤维化有一定预防作用;其作用机制可能是通过抑制TGF-β1在肺组织中的表达,并调整Ⅰ型/Ⅱ型细胞因子平衡达到的。

冬虫夏草菌在寄主钩蝠蛾幼虫中的潜伏侵染过程研究

冬虫夏草是青藏高原的特色名贵药材,是冬虫夏草菌Ophiocordyceps sinensis寄生于钩蝠蛾幼虫后形成的虫生子囊真菌,其发生机理和侵染途径至今未知。本文利用real-time q PCR实时定量技术检测了寄主蒲氏钩蝠蛾Thitarodes pui幼虫表皮、脂肪体、血淋巴和肠壁等组织中冬虫夏草菌定殖量,分别建立了起始于表皮的侵染路径(R20.678)和起始于肠道的侵染路径(R20.271)两种Holt数学模型,经比较分析后,推论冬虫夏草菌随口腔摄食侵染寄主幼虫的方式具有一定合理性和可行性,揭示冬虫夏草菌可以通过进食途径实现其对钩蝠蛾幼虫的带菌生长、侵染和寄生,从而为深入阐释冬虫夏草菌与寄主钩蝠蛾幼虫相互作用关系提供重要参考。

冬虫夏草与青海冬虫夏草菌的药理比较(Ⅰ)

比较了冬虫夏草与人工发酵培养的青海冬虫夏草菌的药理作用。证明二者均有镇静、抗炎、激素样作用、降低血清胆固醇、提高血糖、扩张离体气管、兴奋离体回肠等作用;而无抗缺氧、抗疲劳、耐高温低温能力以及解毒保肝作用。毒性近似。

HPLC法测定冬虫夏草菌丝体及发酵液中核苷类成分

以百令胶囊及野生冬虫夏草作为对照品,优化了HPLC法测定冬虫夏草菌F4539指纹图谱的色谱条件,并计算其中4种核苷成分的含量。结果表明:采用YMC-Pack Pro C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,甲醇∶水(20∶80,体积比)为流动相,流速0.6 m L/min,检测波长为260 nm时,待测样品得到较好的基线分离;冬虫夏草菌F4539发酵菌丝体及发酵液中含有与野生冬虫夏草及百令胶囊相同的有效成分;4种核苷物质在2、4、6、8、10 mg/L的浓度梯度下,线性关系良好;通过定量计算,冬虫夏草菌F4539菌丝体及发酵液中的腺苷含量分别为0.094 mg/g和2.53 mg/g,百令胶囊中腺苷含量为1.45 mg/g。本研究对于冬虫夏草F4539的功效评价、发酵后处理及产业化开发提供了重要技术参数。

冬虫夏草与青海冬虫夏草菌的药理研究——Ⅱ.对免疫功能的影响

冬虫夏草与青海冬虫夏草菌经免疫药理实验表明:两者均有提高机体单核巨噬细胞系统吞噬功能的作用;对体液免疫有调节作用,可提高氢化可的松所致免疫抑制状态小鼠的血清溶血素及脾细胞免疫溶血活性,而对正常小鼠的体液免疫功能无影响;对T淋巴细胞转化有促进作用,对DNCB所致小鼠迟发型超敏反应有抑制作用。

冬虫夏草菌寄主小金蝠蛾人工饲养成虫生物学特性

小金蝠蛾是冬虫夏草菌的优良寄主之一,人工培育成虫能否正常交尾及产卵直接关系到种源的持续利用,是目前冬虫夏草人工培育产业的制约因子之一。本文通过对人工饲养小金蝠蛾两个世代(R1、R2)成虫的形态、羽化、交尾、产卵、寿命等生物学特征与其野生亲本进行比较,研究人工培育条件下小金蝠蛾成虫的交尾、产卵能力,为人工培育种源及种群的可持续利用提供依据。研究结果表明,人工饲养条件下小金蝠蛾成虫的平均体长、体重、含卵量、产卵量、寿命均为野生亲本>R1>R2,但在羽化、交尾、产卵等行为上野生亲本与R1、R2不存在明显差异;人工饲养两个世代幼虫的种群增长率分别为177.27%和117.56%,表明人工饲养条件下小金蝠蛾种群可实现持续利用。

发酵的冬虫夏草菌粉治疗慢性阻塞性肺疾病和间质性肺疾病随机对照试验的质量评价

目的评价人工冬虫夏草治疗慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)、间质性肺疾病(interstitial lung diseases,ILDs)随机和半随机对照试验的质量。方法计算机检索PubMed、Cochrane Library、中国生物医学文献数据库、中国知网CNKI数据库、万方数据库和维普中文期刊数据库,收集人工冬虫夏草治疗COPD和ILDs的随机对照试验和半随机对照试验。按照Cochrane协作网推荐的评价方法对纳入的研究进行方法学质量评价,按照随机对照试验报告统一标准(consolidated standards of reporting trials,CONSORT)清单进行研究报告质量评价,按照临床指南对纳入研究的疾病诊断标准、干预措施和严重程度评价及结局指标设定进行专业评价。结果检索相关文献,入组126篇文献,其中涉及COPD的研究112篇,涉及间质性肺疾病或矽肺合并COPD的研究14篇。入组文献的研究方法学质量(COPD正确率0%~35.7%;ILDs正确率9.1%~18.2%)和报告质量亟待提高。入选文献在诊断的确认(COPD合理率42.3%;ILDs合理率78.6%)、治疗方案设定(COPD合理率28.8%;ILDs合理率14.3%)和疗效评价指标及治疗终点设计(COPD合理率50%;ILDs合理率64.3%)上也有很大缺陷。结论由于研究质量较差,目前的证据不能证实联合使用发酵的虫草粉对改善COPD和ILDs的疗效有肯定作用,仍需要进一步研究以证实其临床价值。

冬虫夏草菌丝状菌源增殖培养的研究

冬虫夏草菌是珍稀濒危名贵中药材冬虫夏草的无性型菌种,是侵染蝠蛾幼虫的唯一菌种,其侵染后形成名贵中药材冬虫夏草。冬虫夏草菌在不同营养及条件下生长形态不同,主要有丝状体和菌球体两种生长形态。冬虫夏草菌丝状菌体能够侵染蝠蛾幼虫,有可能作为一种新的接种体被广泛应用;但丝状菌体对营养要求苛刻、生长缓慢、菌丝体得率低的特点,阻碍了冬虫夏草菌丝状菌体作为侵染蝠蛾幼虫的接种体的开发及应用,从而阻碍了冬虫夏草人工培殖产业化的进程。为了提高冬虫夏草菌丝状菌体的生物表达量,本文对营养及培养条件进行了优化研究,得出了最佳条件为:葡萄糖质量浓度40 g/L、酵母粉质量浓度65 g/L、培养温度17℃、MgSO_4质量浓度3 g/L、KH_2PO_4质量浓度1.5 g/L、培养时间12 d,按最优培养条件,冬虫夏草菌丝状菌体干重得率15.67 g/L,为下一步新的接种体的制备提供菌源保障。

冬虫夏草菌深层发酵及菌丝体活性成分测定方法探讨

本文介绍了冬虫夏草菌深层发酵及菌丝体生物活性成分(多糖、D-甘露醇、腺苷、氨基酸)测定方法。

冬虫夏草菌粉对肾缺血-再灌注损伤大鼠Klotho基因和免疫调节的影响

目的观察冬虫夏草菌粉对大鼠肾缺血-再灌注损伤动物模型Klotho基因和免疫调节的影响,探讨其可能的机制。方法 30只Wistar大鼠分为假手术组、模型组、实验组。模型组和实验组大鼠采用夹闭双肾动脉45 min后复灌方法造模,假手术组不夹闭双肾动脉作为对照。术后实验组给予10%冬虫夏草菌粉按2.0 m L/(kg·d)灌胃,假手术组和模型组则给予2.0 m L/(kg·d)生理盐水。灌胃治疗7 d后,检测尿磷(UP)含量、血清总蛋白(STP)、白蛋白(ALB)和肾功能3项[胱抑素C(Cys C)、肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)],RT-PCR法检测肾组织Klotho蛋白和Klotho-m RNA表达及肾组织匀浆中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果模型组肾组织匀浆中Klotho蛋白和Klotho-m RNA与假手术组比较下调(均P<0.05);模型组大鼠心室内血STP和ALB治疗后与假手术组比较差别不大(均P>0.05)。实验组Klotho蛋白、Klotho-m RNA、STP和ALB与模型组比较均升高(均P<0.05)。模型组心室内血清SOD与假手术组比较降低,而MDA升高(均P<0.05),LDH则差别不大(P>0.05)。实验组MDA与模型组比较降低,SOD活性增强(均P<0.05)。模型组Cys C、Scr、BUN和UP与假手术组比较均升高(均P<0.05)。实验组Cys C、Scr、BUN和UP与模型组比较均降低(均P<0.05)。结论冬虫夏草菌粉在抑制肾缺血-再灌注造成的脂质过氧化反应的同时,免疫力得以提升,并通过上调Klotho蛋白和lotho-m RNA达到抗衰老、增加UP排泄来减轻肾功能损害。

中国冬虫夏草菌液体发酵工艺初探

中国冬虫夏草((Cordyceps sinensis)的食用、药用价值较高,尤以青藏高原的冬虫夏草(以下简称虫草)质地最佳。我院虫草组经多年研究,于1983年首次完成了人工虫草菌的分离,培养及从子囊孢子→菌丝体→子座→子囊孢子的全过程,并获国家专利(专利号8510197·4)。人工虫草菌经毒理、药理、植化研究,证明与天然虫草化学组成、药理作用基本一致,可代替天然虫草生产虫草制品,以弥补自然资源的短缺,本文对人工虫草菌的液体发酵生产工艺进行了探索。

人工冬虫夏草菌液预防实验性肝纤维化的作用机制

目的观察人工冬虫夏草菌液预防治疗对肝纤维化大鼠几种主要致纤维化因子P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)、转化生长因子β(TGF-β)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、结缔组织生长因子(CTGF)和Ⅳ型胶原(CollagenⅣ)的影响,探讨人工冬虫夏草菌液预防肝纤维化的作用及可能的机制。方法选择雄性SD大鼠,随机分为3组(n=8),模型组用40%四氯化碳橄榄油溶液背部皮下注射造模,给药预防组在造模的同时给予人工冬虫夏草菌液进行预防治疗,正常对照组背部皮下注射生理盐水。8周后处死实验大鼠,肝脏取材,RT-PCR法检测3组大鼠肝脏组织P38MAPK、TGF-β、α-SMA、CTGF和CollagenⅣmRNA表达变化,用HE及天狼星红染色观察肝脏组织学变化。结果组织学染色发现,给药预防组肝组织结构改变明显轻于模型组,纤维组织沉积也明显轻于模型组;给药预防组大鼠肝组织中P38MAPK、TGF-β、α-SMA、CTGF和CollagenⅣmRNA表达均低于模型组(P<0.05)。结论人工冬虫夏草菌液能预防肝纤维化形成,能够降低几种主要致纤维化因子mRNA表达水平;P38MAPK信号通路可能参与冬虫夏草抗肝纤维化过程。

基于转录组的冬虫夏草菌微循环产孢研究

\为研究冬虫夏草菌(Ophiocordyceps sinensis)微循环产孢过程中的分子机理,采用高通量测序技术,对微循环产孢前后冬虫夏草菌的转录组进行研究。筛选获得差异表达基因6902个。Gene Ontology(GO)功能聚类分析表明,差异表达基因主要参与分子功能、胞内运输、核糖核蛋白复合体等生物学通路。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)功能富集分析结果表明,差异表达基因参与了核糖体、嘧啶代谢、蛋白酶体、嘌呤代谢、甘氨酸代谢等过程。Mmc、Mcb、MaH1、MaPP5、MaAGA、Pyk等候选基因不同程度的参与了冬虫夏草菌微循环产孢过程,其中Mcb家族基因可能起到关键作用。通过qRT-PCR验证差异表达基因,定量结果与转录组测序结果一致。本研究为进一步揭示冬虫夏草菌微循环产孢分子机制以及关键基因的调控提供了重要信息。

冬虫夏草菌液体发酵过程中酶活性的测定与分析

采用不同培养基人工培养冬虫夏草,并对其在发酵不同阶段低温活性物质———淀粉酶、糖化酶、中性及酸性蛋白酶的活力进行测定和分析。结果表明:①淀粉酶、糖化酶、中性及酸性蛋白酶的活力均随反应时间的延长而逐渐增加;②发酵12～54h,培养基Ⅱ中的淀粉酶、糖化酶、中性及酸性蛋白酶活力显著高于培养基Ⅰ;③发酵54～72h,培养基Ⅱ中的淀粉酶、糖化酶的活力仍然高于培养基Ⅰ,但培养基Ⅱ中的中性、酸性蛋白酶活力显著低于培养基Ⅰ。

冬虫夏草菌CS.SYSU-Ⅱ深层发酵条件的优化

以菌丝体干质量为评价指标,对冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis)CS.SYSU-Ⅱ在5 L发酵罐中的发酵条件进行优化。在单因素试验基础上,选取搅拌转速、通气量和装料系数,采用3因素3水平的正交设计试验,得出最佳发酵条件并验证,最后扩大至20 L发酵罐。结果表明,冬虫夏草菌CS.SYSU-Ⅱ在5 L发酵罐中培养6 d的最佳发酵条件为搅拌转速220 r/min、通气量2.0 vvm和装料系数60%,在此条件下进行验证试验,菌丝体干质量能达到(19.85±0.52)g/L。扩大至20 L发酵罐,可得菌丝体干质量为(16.78±0.06)g/L,发酵结果能达到5 L发酵罐的85%。通过比较摇床与5 L发酵罐的生长曲线,发现p H值能反映菌丝体干质量的变化趋势,可将p H值的变化规律作为发酵结束的判断依据。

冬虫夏草菌发酵溶氧条件的优化

目的:优化冬虫夏草菌发酵的溶氧条件。方法:在5 L机械搅拌发酵罐中培养冬虫夏草菌,以菌丝得率为响应值,对影响供氧的主要因素进行Box-Behnken响应面法优化,并对4种圆盘涡轮的搅拌效果进行对比。结果:最佳溶氧条件为:搅拌转速370 r/min,通气量6.5 L/min,罐压0.03 MPa;在此条件下虫草菌丝得率为9.21 g/L。4种圆盘涡轮促进供氧的顺序为:箭叶>斜直叶>弯叶>平直叶,以箭叶圆盘涡轮在响应面优化后的条件下发酵虫草菌丝得率最高,达9.65 g/L。结论:响应面法能较好地预测试验结果,优化后的条件更利于菌丝生长。

HPLC法测定冬虫夏草菌粉及含片中腺苷的含量

采用Kromasil—C18（4．6mm×250mm，5um）色谱柱，以0．05mol／L磷酸二氢钾-甲醇（90：10）为流动相，流速为1．0mL·min-1，检测波长260nm，柱温为35℃，建立HPLC法测定冬虫夏草菌粉及含片中腺苷的含量。实验结果表明，腺苷含量在0．005-0．2ug（r=0．9993）范围内呈良好的线性关系，平均回收率为101．19％，RSD=1．45％（n=3）。该方法准确可靠、结果稳定、重现性好，可有效控制制剂的质量。