冰核细菌表达冰核蛋白特性的研究

选用１００２５Ａ和ＱＦ－９５－Ｆ１９两株分离自杨树的冰核活性细菌，探讨了两株菌不同生长阶段与它们冰核活性表达的特性。实验结果显示，冰核活性细菌在ＭＰＤＡ培养液中表达冰核蛋白的特性及活性与细菌浓度、菌龄以及培养的环境条件相关，两株菌在表达冰核活性时对培养基的营养组分没有表现出特殊的要求。同时还进一步阐明了不同生长温度冰核活性细菌对冰核蛋白表达的影响。

冰核蛋白的结构及生冰核机理的研究进展

研究冰核蛋白的结构及具有冰核活性的特性,对于该蛋白质的开发应用具有重大意义。本文主要针对国内外对冰核蛋白的结构特别是其高级结构的研究以及冰核蛋白的高级结构的推测等方面进行了较为系统的论述。最后还对其特有的生物学功能所展现出的结构特征作了一下论述。

抗冻蛋白和冰核蛋白对植物抗冻性能的作用机制

植物抗冻蛋白是避免植物寒害冻害发生的重要物质,相对而言,极地的鱼类和昆虫的抗冻蛋白具有低热滞活性和高重结晶抑制活性的特征。冰核活性蛋白是由冰核活性细菌、真菌或昆虫合成的生物冰核剂,降温初期可提高水溶液的冰核形成的温度,温度过低时可降低水的过冷却点。比较分析了抗冻蛋白和冰核蛋白的生物学特性、蛋白特征及其对水分子固液两相间变化的调控机制,这对于揭示植物抗冻性能的复杂的作用机制和植物抗冻基因工程应用的研究有着重要的意义。

基于冰核蛋白的狂犬病毒糖蛋白细菌表面展示

为验证冰核蛋白表面展示系统的可行性与优越性,将编码狂犬病毒(Rabies virus,RV)主要免疫保护性抗原糖蛋白G基因片段融合到丁香假单胞菌冰核蛋白截断的N端,构建表面展示载体pET28a-INP-RVG。转化大肠埃希菌BL21(DE3)后16℃低温诱导表达,SDS-PAGE检测表明在约78 ku和56 ku处有明细的蛋白带出现,大小与理论值相符。完整细胞ELISA实验结果表明,重组蛋白在大肠埃希菌表面成功展示。为进一步研制基于沙门菌的多抗原表位展示性重组疫苗、新型狂犬病疫苗奠定基础。

冰核蛋白糖脂复合物的组装及其应用进展

本文根据近二十年来国内外在冰核活性蛋白方面研究的报道与成果,以真核生物细胞的GPI(Glycosylphatidylinositol,简称GPI)锚体系作为参考,主要针对冰核蛋白糖脂复合物的组成成分,在论证建立冰核蛋白糖脂复合物的组装过程的机制及表现出生物冰核活性所需的结构特征等方面进行了较为系统的综述,这对冰核蛋白的深入研究具有重要的意义。

基于分子对接研究小分子对冰核蛋白的微观抑制机理

使用分子模拟软件AutoDock研究了甘油和三聚甘油分子与北方假单胞菌的冰核蛋白(PbINP)模型之间的相互作用,以期阐释聚甘油对冰核细菌丁香假单胞菌冰核蛋白(INP)冰成核抑制行为的分子机理,以及该机理是否在INP类结构中具有普适性。模拟结果显示了配体分子与TXT(T表示苏氨酸,X表示其他残基)结冰模板和酪氨酸(TYR)阶梯结构之间的不同结合能力,并且在配体与TXT结冰模板的结合中发现有INP的其他残基参与结合。表明配体分子与INP的特异性结合可能适用于其他具有类似结构的INP。该结果为聚甘油作为冷冻保护材料的开发和进一步理解INP的结冰机理提供了有用的理论信息。

冰核蛋白和昆虫抗冻蛋白在虫体抗寒中的作用

为了冰核蛋白和昆虫抗冻蛋白共同维持虫体在寒冬中的动态平衡。尝试着从冰核蛋白和昆虫抗冻蛋白的结构和功能出发,阐述两者在虫体中的抗寒作用,有助于日后更为深入的研究。

冰核蛋白对冻结与消融速度影响研究

在冬季早期典型的边际天气条件下,环境温度较高,人工造雪的效率较低,水资源的消耗较高,使用生物冰核提高人工造雪效率技术已经被广泛采用,但是造价昂贵,不利于在国内大范围推广.通过筛选优化新的菌种,制备冰核蛋白,在不同温度下,添加不同浓度冰核蛋白进行冻融实验.发现添加该种冰核蛋白能够对相变速度产生影响:在-5℃时添加浓度为2.3×10^(-4)mg/mL或1.15×10^(-4)mg/mL的冰核蛋白溶液能够有效加快冻结速度,且成冰的透明度较好;添加冰核蛋白明显有助于减缓消融,使冰保持的时间更长.可见,筛选优化的冰核蛋白在初步试验中,能够在较高的环境温度下使水较快冻结且减缓消融速度,有利于降低成本并在未来滑雪场中大规模使用.

基于冰核蛋白的乳酸菌表面展示系统的构建

【目的】验证来源于丁香假单胞菌的冰核蛋白在乳酸乳球菌表面展示外源蛋白的可能性。【方法】以绿色荧光蛋白(Green Fluorescence Protein,GFP)基因gfp为报告基因,以冰核蛋白基因的N末端和NC端作为展示单元,构建乳酸菌表面展示载体pHZ101和pHZ102,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MG1363。【结果】荧光显微镜观察显示重组大肠杆菌和乳酸乳球菌均能检测到绿色荧光。Western blot结果表明GFP蛋白在重组大肠杆菌和乳酸乳球菌中均得到表达,并且INPN-GFP蛋白多数滞留于乳酸乳球菌细胞质内,而INPNC-GFP蛋白则大部分定位于乳酸乳球菌的细胞膜上。【结论】以上结果表明丁香假单胞菌的冰核蛋白能引导外源蛋白定位于乳酸乳球菌的细胞膜上,为乳酸菌表面展示系统的构建提供了新的方向。

利用冰核蛋白N-端结构域在大肠杆菌表面展示人存活蛋白

存活蛋白(survivin)是高度特异的广谱肿瘤相关抗原,利用冰核蛋白(ice nucleation protein,INP)表面展示系统研究在大肠杆菌细胞表面展示人存活蛋白的可行性。将人存活蛋白基因片段和报告基因Cherry融合到冰核蛋白N-端,构建表面展示载体p ET-INP-CHY-SUV并转化大肠杆菌BL21(DE3)。重组菌经IPTG诱导后可检测到红荧光,荧光强度在胰蛋白酶的作用下降低,完整细胞ELISA实验及免疫荧光实验可检测和观察到绿荧光,表明人存活蛋白在重组菌中得到表达,并且成功展示于细胞表面,为进一步研制新型的肿瘤DNA疫苗奠定基础。

基于黄单胞菌冰核蛋白N端的表面展示体系建立

为了建立一个自主、高效的细菌表面展示体系,利用野油菜黄单胞菌冰核蛋白N端结构域,将短小芽孢杆菌脂肪酶展示于大肠杆菌Rosetta 2(DE3)表面.采用细胞分级、脂肪酶活测定和His-tag In-gel stain分析等检测了重组蛋白的表达情况,并进一步检测了不同底物、温度、pH和有机溶剂对酶活稳定性的影响.结果显示融合蛋白在大肠杆菌细胞外膜成功展示,重组菌脂肪酶活为(74.6±4.5)U/g冻干细胞,展示水平为每个细胞表面19 267个脂肪酶分子;展示酶对中长链脂肪酸酯表现出较高的水解活性,最适pH为11.0,最适温度为40℃,且在40℃保温一周仍保持80%以上的酶活.本研究表明基于野油菜黄单胞菌冰核蛋白N端的展示体系是一种高效、稳定的细菌表面展示体系.

诱发枇杷霜冻害的冰核细菌拮抗菌分离与筛选

[目的]筛选出具有防除枇杷INA细菌的拮抗菌。[方法]从枇杷根际土壤中分离冰核细菌拮抗菌,对其进行抑菌圈、杀菌能力、破坏冰核活性蛋白能力测定。[结果]从不同海拔地区的根际土壤中共分离得到128个菌株,其中有拮抗效果的有55株,平皿拮抗效果强的有15株,再经拮抗系数比较得到9株强拮抗菌菌株,最后筛选出1株杀菌率达98%、破坏冰核蛋白能力达100%的拮抗菌BL-36。[结论]BL-36既有杀菌效果又有破坏冰核蛋白能力,是具有较好利用前景的防除诱发枇杷霜冻害冰核细菌、减轻枇杷霜冻害的生物防治材料。

冰核细菌的研究、应用现状和前景

冰核细菌是诱发和加重植物霜冻的重要因子 ,通过减少和控制冰核细菌 ,在进行霜冻防治研究方面 ,取得了一定效果。目前世界上已发现 4个属 2 3个种或变种的细菌具有成冰活性。细菌冰核是一类蛋白质 ,称冰蛋白 ,由细菌冰核基因编码 ,报道已有 11种冰核细菌的冰核基因被克隆并在大肠杆菌中得到表达。综述了冰核细菌生物学及分子生物学特性 ,以及冰核细菌在霜冻防除、人工降雨、食品冷藏保鲜。

两种主流载体蛋白在大肠杆菌表面展示抗体应用中的系统分析(英文)

抗体表面展示技术对于新抗体的筛选和抗体亲和力的成熟是非常重要的工具.目前,较为广泛应用的表面展示技术是噬菌体的表面展示和酵母的表面展示.大肠杆菌,以其培养简单和基因改造便捷,有望成为非常好的一种表面展示的宿主.但是,目前为止,大肠杆菌还没有被广泛地应用于抗体的表面展示技术中.主要的原因之一是在大肠杆菌外膜展示抗体的效率还不够高.作为外膜展示的载体,许多蛋白都被研究过,其中自转运蛋白(autotransporter,AT)和冰核蛋白(ice nucleation protein,INP)是人们研究最多的两种载体蛋白.还有一个原因是大肠杆菌作为宿主,在表达异源基因和展示异源蛋白过程中的存活率问题.在本研究中,系统地研究了Ag43β(一种自转运蛋白Antigen43的β结构域)和INPNC(去掉中间冗余序列的冰核蛋白的N端和C端)两种载体蛋白在强弱不同的三种启动子(T7、araBAD和lac)诱导表达的情况下,表达量、展示率、抗原亲和力以及宿主菌存活率的差异.我们发现,Ag43β展示的抗体在抗原亲和力上优于INPNC展示的抗体.在存活率方面,T7启动子诱导表达的存活率很低:用INPNC作为载体蛋白时只有0.0033%,用Ag43β作为载体蛋白时只有0.02%存活率.lac启动子诱导表达的存活率:用INPNC作为载体蛋白时为2.04%,用Ag43β作为载体蛋白时为13.27%.araBAD启动子诱导表达的存活率很高:用INPNC作为载体蛋白时为37.80%,用Ag43β作为载体蛋白时高达90.23%.但是araBAD诱导表达量和展示率都很低,所以其表现出的宿主高存活率意义有限.综合看来,由lac启动子驱动的、以Ag43β为载体蛋白的抗体表面展示系统是最好的选择.

冰核细菌Erwinia ananas 110冰核基因iceA的原核表达及冰核活性分析

为获得具有高冰核活性的基因工程菌,从冰核细菌Erwinia ananas 110扩增冰核基因iceA,将其克隆到pMD19–T载体上,转化大肠杆菌DH5α,单、双酶切鉴定并测序;阳性克隆目的片段亚克隆到表达载体pET–23a(+)上,转化大肠杆菌DH5α,单、双酶切鉴定重组质粒;阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,并经IPTG诱导表达。SDS–PAGE电泳检测表明,冰核基因iceA能够并以包涵体形式表达,相对分子质量约为180 000。冰核活性测定结果表明,重组菌BL21(DE3)pLysS/pET–ice的冰核活性与野生冰核细菌Erwinia ananas 110在–5、–4、–3、–2℃下无明显差别。

重组成冰核菌适用于冷冻食品加工

为了找到关闭成冰核蛋白表达的方法.以便防止作物霜冻,已经作了大量的工作。一些集群于普通食用作物表面的好气革兰氏阴性细菌在其(菌体)表面表达成冰核蛋白。任何物质结晶都需要一个起始点,水也不例外。这些革兰氏阴性细菌的膜蛋白就提供了这样的起始点。 人们希望关闭细菌的成冰核蛋白的表达,因为冰晶的形成每年都造成食用作物的极大损失。例如,丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)是多种常见作物和果树的病原体,它表达inaZ成冰核基因。

细胞表面展示有机磷水解酶的恶臭假单胞菌工程菌的构建及全细胞酶活性分析

利用丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)冰核基因的N-末端(inpn)作为锚定单元(anchoring mo-tif),通过与来自黄杆菌属(Flavobacteriumsp.)的有机磷水解酶基因opd构建融合基因inpn-opd,并连接于假单胞菌表达载体pYMBP,然后导入恶臭假单胞菌(P.putida)野生型菌株AB92019,获得了能在其细胞表面展示有机磷水解酶并具有全细胞酶催化活性的重组工程菌MMBL-opd。SDS-PAGE结果表明,融合基因能表达产生80 ku的蛋白质。重组菌MMBL-opd在无抗性LB固体培养基上能稳定生长,所携带的外源质粒的稳定性达到100%;在添加100μmol/L Co2+培养基上28℃培养48 h,表面展示的有机磷水解酶具有最高全细胞酶活性,为0.036 U/mg。用蛋白酶K消化处理重组菌表面蛋白可使其全细胞酶活降低92%。重组菌在PBS缓冲液中于4℃条件下保存30 d,仍能保持93%的全细胞酶活。

细菌表面展示技术研究新进展

细菌表面展示是将靶标蛋白质表达于细菌表面以更好地实现其功能的一种技术,它在重组细菌疫苗、生物燃料电池、全细胞催化剂和生物修复等多个领域均有广泛的应用.随着相关技术的发展,表面展示系统的各种性能被不断地改良,同时新的表面展示系统也陆续被开发和应用,使该技术得到持续的丰富和发展.本文重点关注近年研究得较多的细菌表面展示系统,主要对各类细菌表面展示系统的开发、改造和修饰,以及该技术在生物修复和生物传感器方面的应用作一综述.