冷休克对PG、HeLa细胞周期调控及p21WAF1/cip1蛋白表达的影响

目的 研究冷休克对p5 3基因突变的PG细胞、p5 3野生型的HeLa细胞的周期调控及 p2 1WAF1/cip1蛋白表达的影响。方法 将PG、HeLa细胞置 4℃冷冻 4h ,使细胞发生冷休克 ,用流式细胞仪分析细胞DNA含量及凋亡细胞百分率 ,Westernblot检测 p2 1WAF/cip1蛋白的表达。 结果 冷休克诱导PG、HeLa细胞发生G2 /M期周期阻滞及凋亡 ,p2 1WAF/cip1蛋白表达增高 (PG以 12h、HeLa以 18h最为显著 )。冷休克诱导PG、HeLa细胞发生G2 /M期周期阻滞及凋亡与 p2 1WAF/cip1蛋白表达增高同步。结论 冷休克诱导PG、HeLa细胞发生G2 /M期阻滞及凋亡、p2 1WAF/cip1表达的增高与细胞的 p5 3状态无关。

人肝细胞氧化应激模型中热休克蛋白90α对细胞周期蛋白B1的降解调控机制研究

目的 观察人肝细胞(L02)氧化应激模型中热休克蛋白90α(heat shock protein 90α, Hsp90α)和相关底物蛋白细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)的蛋白水平变化,以及Hsp90α表达下调后对Cyclin B1表达的影响,明确Hsp90α对Cyclin B1功能的影响,为氧化应激相关的肝脏疾病防治提供新思路。方法 以200μM H_(2)O_(2)建立氧化应激L02细胞损伤模型;通过CCK-8法观察氧化应激对细胞存活的影响,比色法测定细胞内谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量,流式细胞术检测细胞周期,免疫印迹法检测氧化应激对细胞内Hsp90α及Cyclin B1蛋白水平的影响。结果 随着氧化应激刺激时间的延长,GSH含量逐渐减少,抗氧化能力不断降低。从6 h开始,胞内GSH水平较对照组明显下降(均P<0.05);H_(2)O_(2)对L02细胞增殖的抑制程度增强;氧化应激后细胞周期检测点G2/M期阻滞明显;氧化应激导致胞内Hsp90α蛋白水平先增加后降低,在刺激24 h时Hsp90α表达出现明显下降,Cyclin B1蛋白水平则在24 h明显增加,与对照组相比,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论 氧化应激可动态影响细胞内Hsp90α及CyclinB1蛋白表达水平;氧化应激下,Hsp90α表达降低可影响与G2/M期调节有关的底物蛋白Cyclin B1水平,Hsp90α对Cyclin B1功能维持起保护性作用。

冷“休克”同步化羊水细胞传代培养在产前诊断中的应用

目的探讨冷“休克”同步化羊水细胞传代培养在产前诊断中的应用。方法实验组将原代培养至7天时置换出的旧培养基放置于4℃冰箱冷“休克”15天后，分离其内的M期细胞加入适量新培养基传代培养；对照组直接将原代培养至第7天时置换出的旧培养基离心，收集其内的M期细胞加入适量新培养基传代培养，不做冷“休克”处理。采用流式细胞术检测实验组和对照组活细胞、早期凋亡细胞及晚期凋亡细胞和死细胞的百分比；染色体G显带技术进行实验组和对照组的染色体核型分析，观察实验组染色体核型是否存在畸变。结果实验组收获的活细胞数（21．65±2．58）与对照组（34．80±2．02）比较差异有统计学意义（t=31．127，P〈0．01），实验组收获的早期凋亡细胞数（26．08±2．09）与对照组（23．79±2．31）比较差异有统计学意义（t=5．683，P〈0．01），实验组收获的晚期凋亡细胞及死细胞数（13．63±0．68）与对照组（12．95±0．69）比较差异有统计学意义（t=5．384，P〈0．01）；实验组染色体核型与对照组一致，均未见染色体发生畸变。结论将原代培养至7天时置换出的旧培养基放置于4℃冰箱15天后，分离其内的M期细胞继续传代培养，仍能获得一定数量的可分析分裂相，且染色体未见畸变，诊断结果可靠，应用该方法可确保一次性穿刺即可确保羊水细胞培养成功并得出最终的产前诊断。

从不同指征介入性产前诊断的染色体异常核型分布评估NIPT的临床应用

目的从不同指征介入性产前诊断的染色体异常核型分布评估NIPT的临床应用。方法羊水细胞培养、染色体制备、阅片过程均按操作常规进行;同时结合将(培养至7 d时置换出的)旧培养基放4℃冰箱保存种细胞的方法进行羊水细胞培养,可达到仅穿刺一次即培养成功的效果。统计不同产前诊断指征的异常染色体检出例数及种类,预测应用NIPT检测可能的检出率及漏诊风险。结果1342例接受介入性产前诊断孕妇中胎儿染色体异常108例,检出率为8.0%,其中36例为染色体平衡易位携带者,不具有临床表型;另72例可能具有不同程度的临床表型,包括21-三体39例、18-三体9例、13-三体1例,性染色体数目异常14例、性染色体结构异常3例、部分单体或三体4例、三倍体2例。结论以不良妊娠史者、染色体平衡易位携带者为第一指征者,胎儿染色体异常种类多不在NIPT检测范围内,故建议行介入性产前诊断;以超声胎儿结构异常为指征者,将有36.4%的染色体异常不在检测范围之内,建议行介入性产前诊断;以高龄、母血清学筛查高风险者,除染色体平衡易位携带者外,胎儿多为21、18号等染色体数目异常,在介入性产前诊断资源不足、孕妇有羊穿禁忌证或拒绝介入性产前诊断的情况下,可慎用NIPT技术进行检测,但在NIPT前应当充分告知孕妇其检测范围的局限性及漏诊风险。

同步化羊水细胞传代培养在产前诊断中的应用

目的探讨应用旧培养基内同步化羊水细胞（M期细胞）传代培养其细胞基数达到多少为最佳的培养方法以及旧培养基在4℃冰箱内的存放期限。方法对照组141份，每例接种2瓶，仅作原代培养。实验组140份，采用原代培养联合旧培养基内M期细胞传代培养及4~C冰箱储备种细胞的方法。结果羊水细胞培养成功率由92．2％（对照组）提高到100％（实验组），两者间的差异有统计学意义（x2=11．367，P〈O．01）；对照组原代培养原位制片获得的细胞克隆数（13．35±6．38）与实验组原代培养原位制片获得的细胞克隆数（25．31±6．68）比较，两者差异无统计学意义（P〉0．01）。实验组原位制片获得的细胞克隆数（25．31±6．68）与1：2传代培养原位制片获得的克隆数（90．68±8．41）比较，两者之间的差异有统计学意义（P〈0．01）；对照组与实验组获得的可分析分裂相数比较，两者之间的差异有统计学意义（x2=140．063，P〈0．01）；旧培养基4＂C冰箱保存2～12天后分离其内细胞传代培养同样可获得满意效果。结论旧培养基内M期细胞的再利用可获得较多的有效分裂相，提高了培养成功率，保留了原代培养原位制片羊水细胞克隆的完整性，有利于核型分析时真假嵌合体的鉴定，保证了分析结果的可靠性，确保了一次性穿刺即可达到羊水细胞培养成功的效果。