产冷活性β-半乳糖苷酶的菌株的筛选、鉴定及酶特性研究

目的筛选新的产冷活性β-半乳糖苷酶的菌株,为解决目前工业用β-半乳糖苷酶耗能大、pH要求高的难题创造条件。方法通过含X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的筛选培养基在油田附近土壤中分离纯化菌株并进行鉴定,以邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物测定酶特性。结果获得了一株新的产冷活性β-半乳糖苷酶的菌种,经形态学和16 s rDNA比对,初步鉴定为变形斑沙雷菌属,命名为Serratia proteamaculanssp.L3。该菌株所产β-半乳糖苷酶为胞外酶,粗酶液的最适温度为25℃,最适pH为7.0。结论产冷活性β-半乳糖苷酶的菌株的发现及酶特性的研究为进一步分子生物学机制的研究奠定了基础。

响应面法优化菌株Serratia proteamaculans sp. L 3产冷活性β-半乳糖苷酶

为了开发工业用酶,在前期菌株筛选的基础上,利用Design-Expert软件,通过Plackett-Bru-man设计与响应面法(RSM)相结合的实验统计方法实现对Serratia proteamaculans sp.L 3菌株产冷β-半乳糖苷酶培养基成分的优化.Plackett-Burman设计筛选出3个显著影响因子:K2HPO4,MgSO4和NaCl,应用中心组合设计和响应面分析确定产酶的最优组合为:K2HPO40.15 g·L-1,MgSO40.50 g·L-1,NaCl 0.76 g·L-1,此时预测的最高A420为0.370 4.经过验证实验,结果表示最佳产酶培养基成分条件下,优化后降解ONPG的能力提高了1.1倍.本研究为微生物β-半乳糖苷酶的后续工业化应用提供理论依据.

适冷β-半乳糖苷酶及其在食品工业中的应用

β-半乳糖苷酶,又称乳糖酶,广泛存在于细菌、真菌、酵母菌等微生物中,主要功能是乳糖水解和合成低聚半乳糖。利用β-半乳糖苷酶生产低乳糖牛奶等乳制品成为解决乳糖不耐受问题最有效的途径,然而常用的商业化β-半乳糖苷酶的最适反应温度大多较高,对pH的要求比较严格,存在生产成本较高、消耗能量高等问题。适冷β-半乳糖苷酶在低温下也具有较高的酶活性,广泛应用于食品行业中,尤其在乳品工业。在低温下水解乳糖,生产低乳糖或无乳糖乳制品,供乳糖不耐受者食用,可降低成本、节约能源,具有重要意义。该文综述了β-半乳糖苷酶的微生物来源、特性、催化特性的研究现状,对适冷β-半乳糖苷酶的来源、特性、耐冷机制及工业化应用进行了系统阐述,并对其前景进行了展望。

园艺作物果实β-半乳糖苷酶研究进展

β-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶GH35家族,参与了植物不同生长阶段细胞壁的合成与修饰,尤其对肉质水果发育和成熟过程中多糖的裂解具有重要作用。文章概述了β-半乳糖苷酶的蛋白功能、不同亚型、亚细胞定位和活性规律,重点阐述了该基因家族在园艺作物果实质地变化中的作用及相关研究进展。

普通烟草β-半乳糖苷酶基因(NtBGAL)的生信分析及其在不同组织及原核诱导的表达

【目的】探明普通烟草β-半乳糖苷酶基因NtBGAL的表达模式与蛋白特征,为后期创制烟草多用途利用的底盘材料提供依据。【方法】通过比对普通烟草K326基因序列与本氏烟草NbBGAL1基因的同源性,以K326的cDNA为模板经PCR技术克隆获得NtBGAL基因,随后利用生信工具软件分析其基因结构及蛋白理化性质,并采用qRT-PCR检测该基因在烟草不同组织部位(根、茎、叶和花)的表达模式,最后开展原核诱导表达、蛋白纯化及蛋白表征研究。【结果】克隆获得烟草NtBGAL基因,其与本氏烟草NbBGAL1基因同源性最高,二者具有相同的结构域(Motif);该基因定位于9号染色体上,含有18个内含子,mRNA长度为6649 bp,CDS长度为2541 bp,编码846个氨基酸,翻译的β-半乳糖苷酶属于GH35家族,NtBGAL蛋白的分子量为92.44 kDa,理论等电点(pI)为6.8,GRAVY为-0.222,定位于细胞壁。该基因在普通烟草不同组织部位的表达量为花>叶>茎>根,差异显著。在37℃下进行原核诱导,NtBGAL蛋白有明显表达;采用包涵体纯化方法获得较高纯度的NtBGAL蛋白。NtBGAL蛋白酶促反应最适温度为30~40℃,最适pH为4.0~6.5,Mn^(2+)浓度为0.05~0.15 mmol/L时对NtBGAL酶活性有增强作用。【结论】研究明确NtBGAL基因的组织表达模式及蛋白表征,为进一步通过改造NtBGAL基因,利用普通烟草生产人源化糖蛋白奠定基础。

多粘类芽孢杆菌适冷性新型β-半乳糖苷酶的重组表达和酶学性质

目的:本实验旨在挖掘一个适冷性新型β-半乳糖苷酶,为低温生产低乳糖乳制品或合成低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS)提供基础。方法:从多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)基因组中克隆一个β-半乳糖苷酶(PpBgal42A)基因,构建重组表达质粒pET-28a-PpBgal42A在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经亲和层析纯化后研究重组β-半乳糖苷酶的酶学性质,利用高效液相色谱检测各糖分浓度,以GOS转化率为指标,评价PpBgal42A的转糖苷能力。结果:PpBgal42A与酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)来源的糖苷水解酶42家族β-半乳糖苷酶同源性最高,为59.9%。纯化后,PpBgal42A的比活力为163.7 U/mg,分子量约为79 kDa。其最适pH和温度分别为pH7.5和35℃,在pH7.0~9.5范围内和4~35℃以下保持稳定,50℃时快速失活,35℃时的半衰期为1777 min。PpBgal42A利用350 g/L乳糖于30℃反应6 h后合成GOS的转化率为31.6%。结论:PpBgal42A是一个适冷性新型β-半乳糖苷酶,可水解乳糖并合成低聚半乳糖,具有潜在应用价值。

重组人α-半乳糖苷酶在悬浮CHO-S细胞中的表达、纯化及功能活性鉴定

目的 运用无血清可高密度悬浮培养的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells, CHO-S)表达体系,分泌表达并纯化重组人α-半乳糖苷酶(recombinant human α-galactosidase A, rhα-Gal A),验证其对法布雷病贮积底物神经酰胺三己糖苷(globotriaosylceramide, Gb3 or GL3)的清除效果。方法 构建人α-半乳糖苷酶基因gla融合6×His标签的表达载体pcDNA4-GLA,将其转染至悬浮CHO-S细胞中,表达纯化并检测rhα-Gal A糖基化形式、表达量及酶活性;通过与人皮肤成纤维细胞共孵育,观察rhα-Gal A是否能被摄取到胞内并有效清除Gb3。结果 研究结果显示,rhα-Gal A成功在CHO-S细胞中表达,表达量最高可达(100±20.6) mg·L^(-1),且rhα-Gal A被糖基化修饰,酶活与商品酶Fabrazyme酶活相近,为(59±9.1) kU·g^(-1);此外,rhα-Gal A能被有效摄取到人成纤维细胞胞内并靶向溶酶体进而有效清除Gb3。结论 利用瞬时转染技术在悬浮CHO-S细胞中成功表达并纯化出rhα-Gal A,具有良好的生物学活性且可有效清除Gb3,为我国法布雷病的酶替代疗法提供新的选择。

冷藏方式对桃采后果胶含量和β-半乳糖苷酶活性的影响

以采后包装和不包装的‘大久保’桃果实为材料,分别测定了其在8℃冷藏(A)、8℃冷藏10 d后转入0℃贮藏(B)和0℃冷藏(C)方式下的硬度、出汁率、果胶含量和β-半乳糖苷酶活性的变化。结果表明:在A、B冷藏方式下,包装较不包装处理显著抑制了果实的硬度下降、原果胶含量减少和可溶性果胶含量增加,降低了果实出汁率和-βgal活性;与冷藏期比较,货架期后冷藏方式A和B果实表现为硬度下降、原果胶含量减少、可溶性果胶含量增加,以及出汁率和-βgal活性升高。与冷藏方式A和B比较,冷藏方式C果实的硬度和原果胶含量较高,出汁率和可溶性果胶含量较低;货架期后,不包装的果实硬度和原果胶含量增加,可溶性果胶含量和-βgal活性降低,但包装处理却能减缓上述现象的发生。研究表明,桃采后用30μm聚乙烯袋包装、于8℃冷藏10 d后转入0℃贮藏处理,能使桃果实在贮藏期保持较低的可溶性果胶含量和较高的原果胶含量和出汁率,并能使桃在货架期正常后熟软化,是贮藏桃的一种较好方式。

耐热性α-半乳糖苷酶突变体的筛选及酶学性质研究

研究旨在改造株链球菌来源的α-半乳糖苷酶基因Gal_(2)7A,获得耐热性高的突变体。在常规PCR体系中加入不同水平的MnCl_(2),将基因克隆至载体pGAPZαA并成功构建表达酶产物的重组质粒pGAPZαA-Gal_(2)7A。将线性化的重组质粒电转至毕赤酵母GS115,在含有100 g/L博来霉素的YPDS平板上筛选耐热性提高的突变体,通过pNPG的方法测定重组酶的酶学性质为最适温度65℃,最适pH值6.5,Ag^(2+)、Hg^(2+)对重组酶的酶学活性具有明显的抑制作用,Cu^(2+)对重组酶的酶活性具有促进作用。研究表明,试验成功构建耐热α-半乳糖苷酶高效表达菌株29和54,在55℃保温10 min与同等条件下的野生型进行对比,加热前后的保留酶活比的增幅大于45%。

日粮添加α-半乳糖苷酶对断奶苏姜仔猪生长性能、养分消化率及血清免疫指标的影响

本试验将不同水平的α-半乳糖苷酶添加到断奶苏姜仔猪日粮中,研究对其生长性能、血清免疫指标和养分消化率的影响。试验将108只断奶苏姜仔猪平均分为4组,每组3个重复,每个重复9只仔猪,分别为对照组(喂养普通日粮)、试验Ι组(日粮+50U/kgα-半乳糖苷酶)、试验Ⅱ组(日粮+100U/kgα-半乳糖苷酶)、试验Ⅲ组(日粮+200U/kgα-半乳糖苷酶),试验期为40d。结果发现:与对照组相比,在日粮中添加不同水平的α-半乳糖苷酶对断奶苏姜仔猪的末重、平均日增重及料重比均有显著影响(P<0.05),其中添加100U/kgα-半乳糖苷酶对提高断奶苏姜仔猪的生长性能效果最显著(P<0.05),断奶苏姜仔猪平均日增重比对照组提高了9.07%,料重比较对照组降低了8.82%;其次,在日粮中添加不同水平的α-半乳糖苷酶对断奶苏姜仔猪血清中的IgA、IgG、IgM等免疫指标均有显著影响(P<0.05),其中添加100U/kgα-半乳糖苷酶的试验组免疫指标与对照组相比差异最显著(P<0.05),IgA、IgG、IgM分别提高16.5%、21.6%和52.9%。最后,在日粮中添加不同水平的α-半乳糖苷酶,对断奶苏姜仔猪的养分消化率也有显著影响(P<0.05),其中添加100U/kgα-半乳糖苷酶的试验组养分消化率与对照组相比差异最显著(P<0.05),粗纤维消化率和粗蛋白质消化率分别比对照组提高8.29%和8.02%。结果表明,在日粮中添加100U/kg的α-半乳糖苷酶,对断奶苏姜仔猪的生长促进效果最明显,可使断奶苏姜仔猪的饲料效率最佳。

β-半乳糖苷酶的来源、改造、异源表达及其在食品中的应用

β-半乳糖苷酶作为一种安全无毒的酶制剂,不仅广泛应用于食品工业领域中,而且在酶工程、蛋白质工程等生物技术领域也有着很大的应用潜力。微生物发酵法作为生产β-半乳糖苷酶的主流生产方法,仍存在发酵时间较长、提取率低等问题;而利用工程菌的异源表达系统生产β-半乳糖苷酶的方式具有表达量高、成本低等优点。本文对β-半乳糖苷酶异源表达系统的基因来源、表达宿主菌、表达方式以及β-半乳糖苷酶应用价值等进行阐述,旨在为新型β-半乳糖苷酶产品的开发利用提供科学依据与理论参考。

β-半乳糖苷酶荧光探针的研究进展

β-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶,在食品工业、基因工程、酶工程、蛋白质工程、生物医学等领域发挥着重要作用。β-半乳糖苷酶活性及含量的异常与癌症的发生发展密切相关,因此该酶检测对早期癌症诊断有着重要意义。传统酶活性检测方法具有一定的局限性,无法实现对β-半乳糖苷酶的原位无损检测。荧光探针因灵敏度高、选择性好、可用显微镜直接观察、分辨率高、响应时间短、操作方便、成本低等优点深受研究者青睐。在简述荧光探针设计原理的基础上,对近年来β-半乳糖苷酶荧光探针的设计合成研究进展进行了综述,阐述了β-半乳糖苷酶荧光探针在生物成像、早期癌症诊断等应用进展,为β-半乳糖苷酶高效检测技术的研究提供了帮助。

芽孢杆菌35家族β-半乳糖苷酶的性质及其在合成低聚半乳糖中的应用

低聚半乳糖是一种重要的益生元,芽孢杆菌(Bacillales sp.)来源的β-半乳糖苷酶具有转半乳糖苷活性,能合成低聚半乳糖。研究了一个新的芽孢杆菌来源的β-半乳糖苷酶的表达、酶学性质及其在合成低聚半乳糖中的应用。从芽孢杆菌中克隆了一个糖苷水解酶35家族的β-半乳糖苷酶基因(BABgal35A),并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。多重序列比对结果表明:BABgal35A与环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)来源的β-半乳糖苷酶同源性最高,为79.9%,是一个新型的β-半乳糖苷酶(命名为BABgal35A)。粗酶液经Ni-IDA亲和层析纯化得到电泳级纯酶,蛋白电泳分析表明其分子质量为60 kDa左右,最适pH值和温度分别为5.0和55℃,并且该酶在pH值为4.5~8.0,温度为20~45℃时稳定性好。BABgal35A对o NP-β-galactopyranoside具有较高的催化活性。该酶以乳糖为底物合成低聚半乳糖的产率达34%。研究结果表明,芽孢杆菌35家族β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖的制备中具有潜在的应用价值。

生物合成α-半乳糖苷酶的研究进展

α-半乳糖苷酶是一种外切糖苷酶,可用于改善和消除饲料及豆制食品中的抗营养因子,良好的生物催化能力使其在食品、饲料和医药等领域显示出巨大潜力,但目前α-半乳糖苷酶的微生物发酵产量及活性并不高。该文在阐述α-半乳糖苷酶的催化机制的基础上,对α-半乳糖苷酶的微生物来源,产α-半乳糖苷酶菌株的发酵以及该酶的异源表达和分离纯化进行了综述,并对开发低成本、高活性和高产量的α-半乳糖苷酶生产工艺进行展望,以期显著提高α-半乳糖苷酶的生产水平,为后续对α-半乳糖苷酶的产业化研究奠定基础。

普通酸奶制品在贮存过程中发酵剂菌的β-半乳糖苷酶活性测定及变化规律研究

采用菌体细胞蛋白重来测定β-半乳糖苷酶活性是比较精确的方法。β-半乳糖苷酶为胞内酶,通过对溶菌酶、超声波、丙酮干粉三种破壁方法比较,确定用超声波破壁法对乳酸菌细胞破壁。发酵剂菌体的β-半乳糖苷酶活性随酸奶样品贮存时间的延长而下降,由最初的0.9707下降到0.468(第15d)。确定β-半乳糖苷酶为导致酸奶制品发生后酸化的关键酶。

Fabry病的临床、病理和α-半乳糖苷酶A活性研究

目的分析我国4个Fabry病家族患者的临床表现和α-半乳糖苷酶A活性改变规律,探索脂质沉积物对血管内皮细胞血栓调节蛋白表达的影响。方法4个Fabry病家族的23例患者,发病年龄5～8岁,首发症状主要是发作性肢端疼痛,其中伴有血管角皮瘤4例,肾损害5例,伴有高血压病和胃肠道症状各3例。对4例先证者的腓肠神经标本进行组织学、超微组织学观察和血栓调节蛋白免疫组织化学染色,对2例先证者和5例发病的家庭成员测定血α-半乳糖苷酶A活性。结果4例先证者的腓肠神经小血管内皮细胞和平滑肌细胞以及神经束衣的成纤维细胞内出现大量致密嗜锇性颗粒。仅13%的血管出现血栓调节蛋白阳性表达,对照者80%的血管出现血栓调节蛋白阳性表达。男性患者的α-半乳糖苷酶A活性为正常对照者的12%,女性患者则为正常对照者的31%。结论血栓调节蛋白表达下降可能与血管内皮细胞脂质大量沉积有关并导致其抗凝功能下降,α-半乳糖苷酶A活性下降程度存在性别差异。

两种测定程序对饲用α-半乳糖苷酶活性检测结果的比较

根据α 半乳糖苷键物质及其结构组成,设计了两种饲用α 半乳糖苷酶活性的检测程序。结果表明,以棉子糖为底物的DNS法,因饲料中干扰因素较多,导致酶活性偏低。而以对硝基苯酚 α D 半乳糖吡喃糖苷底物的p NPG法,具有操作简便,灵敏度高,重现性好等特点。其测定条件为:反应系统pH4.0,反应温度40℃,反应时间10min,底物浓度5mmol/L。

发酵乳杆菌β-半乳糖苷酶转糖基活性研究

从传统发酵乳制品中筛选到1株转糖基活性较高的乳杆菌，经16SrDNA菌种鉴定为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum，EU621851）K4。以乳糖为底物，研究β-半乳糖苷酶粗酶液在不同pH、乳糖浓度、反应温度和时间的转糖基活性。结果表明在pH5．5、乳糖20％、温度50℃条件下反应48h，转糖基活性最高，能生成多种低聚半乳糖。研究发现在低乳糖含量（5％）和pH5～7范围内都具有明显的转糖基活性。用牛奶为原料进行转糖基能力测定，结果该酶既能降低牛乳中的乳糖含量，又能生成低聚半乳糖。因此，菌株Lb．fermentum K4在乳制品发酵中具有潜在的应用价值。

黄芪多糖对衰老HDFβ-半乳糖苷酶活性影响的实验研究

目的探讨黄芪多糖(APS)对衰老人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF)衰老相关β-半乳糖苷酶(SAβ-gal)活性的影响。方法MTT法测细胞活力;免疫组化法测衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数。结果黄芪多糖可以增强细胞活力,降低SAβ-gal染色阳性细胞数。结论黄芪多糖延缓HDF细胞衰老的机制之一可能是减少了SAβ-gal的表达。

马克斯克鲁维酵母β-半乳糖苷酶合成条件的优化及其酶学性质表征

β-半乳糖苷酶是广泛使用的食品添加剂,主要用于降解乳制品中的乳糖,缓解乳糖不耐受症状。该研究对实验室保藏菌株马克斯克鲁维酵母的发酵条件进行了优化。在20 g/L半乳糖、20 g/L玉米浆干粉、40℃、初始pH 6.5、150 r/min的条件下,粗酶液的酶活力为26.3 U/mL,表明该菌株具有利用廉价碳氮源高效生产β-半乳糖苷酶的潜力。通过DEAE阴离子交换层析进一步纯化得到比活力为124.09 U/mg的纯化酶。纯化后酶的最适温度40℃,最适pH 6,Km为5.28 mmol/L,kcat为4.74 s^(-1)。此外,发现该酶受Mg^(2+)的促进,在20~40℃表现出优异的热稳定性,40℃下30 min仍能保持95.6%的活力。因此,马克斯克鲁维酵母β-半乳糖苷酶比乳酸克鲁维酵母的热稳定性更好,具有潜在的工业应用潜力。