夹层胶原“三明治”法冻存复苏肝细胞的实验研究

目的研究胶原、表皮生长因子对新鲜分离及冻存复苏后Sprague-Dawley(SD)大鼠肝细胞活率、形态和功能的影响,期望建立一种较为完善的肝细胞体外培养及冻存复苏体系,为肝细胞移植、生物人工肝及相关肝细胞研究获取充足有效的肝细胞来源提供必须的技术支持和理论依据。方法采用胶原酶二步原位循环肝脏灌注法分离SD大鼠肝细胞,测定不同条件培养及冻存复苏后各组肝细胞的活性及功能。结果双层胶原及双层胶原+表皮生长因子组细胞活率、蛋白质含量及细胞功能均优于普通组(P<0.05)。结论双层胶原体外培养体系更接近于肝细胞体内生长环境,能有效的减少各种理化因素对肝细胞的损伤,有利于肝细胞在体外长期保存,是一种较为理想的培养及冻存复苏体系。

HL60细胞冻存复苏生物学特性对比分析

目的探讨不同冻存复苏条件对白血病细胞株HL60生物学特性的影响,并优化培养方法与条件。方法对比不同浓度DMSO冻存条件、不同复苏方法对复苏后细胞生物学特性的影响,并确定培养液血清最佳浓度。结果采用5%DMSO冻存防护效果好于其他组,改良后细胞的复苏存活率明显高于传统复苏方法。结论以5%DMSO作为HL60细胞冻存保护剂并采用改良复苏方法,可使细胞保持最佳生物学特性,12%血清为HL60细胞常规培养的最适浓度。

冻存复苏制备同体来源的细胞毒性T淋巴细胞

目的观察冻存复苏对淋巴细胞增殖及杀伤活性的影响,并探索小鼠同体CTL的制备。方法 5.0×106个/m L脾源性单个核细胞经CELLBANKER2小鼠淋巴细胞冻存液缓慢冻存,6 d后再采用39℃水浴快速复苏;分别取新鲜淋巴细胞和冻存复苏后(CP)淋巴细胞经体外100 ng/m L CD3ε单克隆抗体(m Ab)、10 ng/m L重组小鼠白细胞介素2(rm IL-2)刺激扩增7 d分别获取细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)和CP-CIK;骨髓来源的树突状细胞(DC)分别于同系异体来源和冻存复苏后自体来源的脾源性单个核细胞混合培养制备细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。台盼蓝拒染法分别计数活细胞,流式细胞术检测CD3+T及调节性T细胞(Treg)比例,ELISA检测上清中γ干扰素(IFN-γ)含量、乳酸脱氢酶(LDH)释放法分析细胞毒活性。结果淋巴细胞经冻存复苏后,细胞存活率为78%,冻存前、复苏后CD3+T淋巴细胞及Treg比例无统计学差异;CP-CIK与新鲜CIK在细胞扩增、Treg比例、上清中IFN-γ水平以及细胞毒活性均无明显差异;同体CTL和异体CTL在细胞扩增、Treg比例、上清中IFN-γ水平以及细胞毒活性方面也无显著差异。结论淋巴细胞的冻存复苏有助于获取与传统CTL同等增殖活性及杀伤活性的同体来源的CTL。

冻存复苏对胃肿瘤浸润淋巴细胞生物学特性的影响

本文对大胃肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ）进行了系列冻存复苏研究，观察其生物学特性的改变，实验证明，ＴＩＬ冻存３０天和３６０天，两者之间其活细胞加嘏率无显著性差异，新鲜分离的ＴＩＬ与冻存一年的ＴＩＬ，其增殖速度没有显著性改变，新鲜培养的ＴＩＬ杀伤活怀与与冻存后培养的ＴＩＬ杀伤活性无特别显著性差别；ＴＩＬ冻存前和冻存后期ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８细胞表型比较，两者无显著改变。

低温冰箱冻存复苏不同速率的细胞实验

冻存细胞不仅是保存标本的一种方法，也是继续进行实验研究的一种手段，正是如此，管理好细胞的冻存工作应成为十分关键的一环，管理的好坏，甚至可以直接影响到科研工作的进度。液氮保存细胞是传统的细胞冻存方法，但在实际工作中，液氮因易挥发和成本昂贵，且需要专人保管和及时补充液氮，因此给科研工作带来许多不便。因此，我们经过多次反复实验，分别利用超低温冰箱、液氮对细胞进行冻存复苏，通过对细胞存活率、细胞形态、活细胞数比较，

人耳软骨细胞冻存复苏后的体外成软骨能力及体内转归的研究

目的以无支架软骨膜片为模型,研究冻存对人耳软骨细胞的细胞活力、增殖和体外/体内软骨再生能力的影响。方法将小耳畸形患者术中废弃的残耳软骨,以胶原酶消化、分离,得到原代软骨细胞。将软骨细胞扩增至第1代(P1)后,分为实验组及对照组。实验组(Exp)以含有FBS和DMSO的冻存液,经程控降温仪和液氮冻存1个月后复苏,高密度接种,制备软骨膜片及可注射软骨;对照组(Ctrl)不经冻存继续扩增至第3代(P3),高密度接种,制备软骨膜片及可注射软骨。通过光学显微镜、CCK-8、活/死细胞染色、HE和阿利新蓝染色等,检测细胞形态、活力、增殖能力及软骨特异基质(ECM)的表达能力。通过每组体外软骨膜片的湿重、体积及生化成分定量检测,确定软骨细胞的体外成软骨能力。将每组软骨膜片制成新生软骨颗粒(可注射软骨),注射至裸鼠皮下(n=5),8周后取材,行大体观察、HE染色和生化成分定量检测,比较每组软骨细胞的体内成软骨能力。结果两组细胞的形态、活力、增殖能力和软骨特异的糖胺聚糖(GAG)形成能力无明显差异。相比对照组,实验组体外再生软骨的湿重及总胶原表达升高;但体内软骨再生能力两组亦无明显差异。结论细胞冻存复苏对人耳软骨细胞的细胞活力、增殖和体外/体内软骨再生能力无明显影响。

人脐带间充质干细胞冻存复苏后细胞表面标志物分子学变化(英文)

背景:间充质干细胞是具有自我更新能力且能够多向分化的干细胞。脐带属于胚胎外组织,是胎儿分娩后的废弃物,来源广泛,无伦理学限制,因此有望作为间充质干细胞来源的第一选择。目的:检测人脐带间充质干细胞冻存复苏前后细胞表面分子CD29、CD44、CD49e、CD73、CD90、CD34、CD45、CD271标志变化情况。方法:通过从人的脐带中分离培养间充质干细胞,分别观察原代细胞、P4、P8代细胞和冻存复苏后P2、P4、P8代细胞形态;通过流式细胞仪检测原代细胞、P4、P8代细胞和冻存复苏后P2、P4、P8代细胞表面分子标志CD29、CD44、CD49e、CD73、CD90、CD34、CD45、CD271。结果与结论:人脐带间充质干细胞冻存前与原代复苏后不同代数下细胞均表现出相同的表型,CD29、CD44、CD49e、CD73、CD90阳性,CD34、CD45、CD271阴性,提示人脐带间充质干细胞原代低温冻存复苏后细胞表面标志性分子无变化。

流式细胞术分析比较癌症患者新鲜和冻存复苏后外周血淋巴细胞亚群的实验研究

目的建立标准化的实验和分析方法，采用流式细胞术比较分析癌症患者新鲜和冻存复苏后的外周血淋巴细胞亚群的差异。方法于2014年6～12月收集肺恶性肿瘤患者静脉血样本（2mL／样本），每个样本取300止全血用于淋巴细胞亚群分析；剩余全血经裂解红细胞后冻存（40％或90％胎牛血清）。30d后复苏细胞，流式细胞术分析淋巴细胞亚群变化。结果复苏并培养24h后，癌症患者PBMC的存活率分别为（67．70±2．80）％（90％FCS）和（80．47±3．32）％（40％FCS，P=0．0069）。新鲜和冻存的的外周血CD3^＋、CD3^＋CD4^＋、CD3^＋CD8^＋,CD3^-CD16^＋56^＋,CD3^＋CD16^＋56^＋和CD4^＋CD25^＋T细胞的百分率之间无显著差异（P〉0．05，n=8，40％FCS）。结论短期冻存癌症患者的PBMC可用于后续检测T淋巴细胞亚群，尤其对于晚期癌症患者而言，可避免多次采血造成的负担同时提高实验的一致性。此外，本实验建立的方法也可用于临床抗肿瘤免疫治疗和其他免疫监测。

冻存胚胎复苏移植的影响因素

为探讨冻存胚胎复苏移植妊娠的影响因素 ,统计分析了 2 8个周期 12 7个冻存胚胎复苏移植的妊娠率与胚胎冻存前形态、细胞数、保存时间、复苏后存活率、培养至次日的继续分裂率等因素的关系 .表明妊娠周期冻存前胚胎形态良好比例、复苏后存活率、复苏后培养至次日继续分裂的比例有增高的趋势 ,胚胎细胞数妊娠与非妊娠周期相似 ,形态良好胚胎复苏后存活率显著高于形态不良者 .

冻存时间不同的成年动物肝细胞复苏后对重型肝炎胆红素代谢的效果比较

目的实验比较在液氮中冻存时间长短不同的成年动物肝细胞(adultanimalhepatocytes,AAH)复苏后对人体重型肝炎胆红素代谢的效果,探讨体外生物人工肝支持系统(extracorporealbioartificialliversupportsystem,EBLSS)使用冻存复苏AAH的实际意义。方法采用HE染色镜检肝细胞形态、台盼兰染色计数肝细胞成活率、肝细胞培养并贝克曼生化分析仪检测对重型肝炎胆红素的代谢效果。实验观察液氮中冻存1周、1个月、3个月复苏后的成年小白鼠肝细胞形态、存活率和对重型肝炎胆红素的代谢效果,同时设新鲜分离的肝细胞作对照组。结果冻存1周、1个月的肝细胞在光镜下形态无明显改变,冻存3个月的肝细胞胞质严重丢失;对照组、冻存1周、1个月、3个月的肝细胞成活率分别为91%、83%、76%、35%(与对照组比较,后三者分别P>0.05,P<0.01,P<0.01);四组肝细胞使重型肝炎总胆红素分别下降27.01%、23.02%、19.58%、2.33%,(与对照比较,后三者分别P<0.01,P<0.001,P<0.001)。结论EBLSS以使用新鲜分离的AAH为佳。

睾丸间质细胞传代、冻存、复苏初步研究

随着对细胞的不断传代,优势细胞逐渐生长,传代培养的细胞梭形占比逐渐加大,而生长速度慢或是生长活力低的细胞会被逐渐淘汰。细胞冻存复苏后的状态与冻存保护剂种类、冻存时间、冻存方式、细胞复苏方法等有关,也与各种生物学试验结果有关。为了更好地建立细胞库,实现其相应价值,笔者对此进行了试验探索,下面则是具体的试验过程和相关结论。

人结膜上皮细胞的培养鉴定及液氮冻存

目的:探索人眼结膜上皮细胞体外培养和细胞保存的最佳方法,建立人结膜上皮细胞系,进一步研究人结膜的病理、生理特点及为毒理试验提供可靠的细胞模型。方法:分别用组织块培养法、机械分离法及混合消化液培养法体外培养正常成年人结膜上皮细胞,通过观察细胞形态、生长特性并用原位免疫组化方法鉴定培养细胞;收集第3代和第4代融合的细胞液氮冻存,保存30天后复苏,观察复苏成功率。结果:3种取材方法中,混合消化液培养法细胞生长繁殖较快,培养细胞形态多样,贴壁生长。免疫组化Keratin染色阳性,细胞冻存复苏的成功率均达到90％。组织块培养法细胞生长比较缓慢,而机械分离法细胞未见贴壁生长。结论:混合消化液培养法是人结膜上皮细胞培养的最佳方法,通过液氮冻存可保存培养的人结膜上皮细胞。眼科学报2000;16:135-138。

兔骨髓基质干细胞的分离生长及冻存技术研究

目的:建立兔骨髓基质干细胞(MSC)体外分离、培养、增殖、冻存的方法,以及探讨其生物学特性。方法:抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液,采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化出MSC,并增殖。观察MSC的生长特性,测定其贴壁率及第3、8、13、18代的生长曲线,并评价其生物学特性。MSC在12.5%DMSO条件下经液氮或-60℃冻存复苏,测其成活率。结果:MSC为贴壁生长,以均一的梭形的成纤维细胞样生长,贴壁及增殖能力强,所测各代的生长曲线呈相似的S型,倍增时间约为35h。MSC需液氮保存,短期也可-60℃冰箱保存。结论:获得的兔MSC生长旺盛、增殖能力强,其分离、培养、纯化、增殖、冻存方法是可行的,可较长时间稳定地培养增殖、冻存,传代的MSC可保持其原代的生物学特性。MSC将是组织工程理想的种子细胞。

卵子的冷冻和复苏

从1986年澳大利亚报道第1例使用二甲基亚砜（DMSO）作为冷冻保护剂，采用程序冷冻技术，冻存复苏卵子进行体外受精并获得成功妊娠开始，卵子冷冻和复苏技术不断发展，目前已在辅助生殖领域得到了越来越广泛的应用，并成为生殖医学的研究热点。

激光辅助孵化对冻融胚胎移植临床结局的影响

目的探讨激光削薄法辅助孵化(AH)对冷冻第3天胚胎移植结局的影响。方法选取行第3天冷冻胚胎移植患者的1 024周期,其中964个周期行常规的第3天冻存胚胎移植(非AH组),60个周期于第3天冻存胚胎复苏后,用激光将1/4透明带削薄2/3后移植(AH组);分析两组的种植率、临床妊娠率、多胎率、活产率、流产率及生化妊娠率。结果两组的种植率、临床妊娠率、多胎率、活产率、流产率及生化妊娠率分别为43.2%和24.2%、58.3%和43.2%、45.7%和26.9%、78.4%和77.7%、21.6%和22.3%、6.7%和4.4%;其中AH组的种植率、临床妊娠率及多胎率与非AH组比较,差异有统计学意义(P<0.05);而活产率、流产率及生化妊娠率高于非AH组,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论采用激光削薄方法进行AH可以提高冷冻复苏第3天胚胎移植后的种植率及临床妊娠率,而对活产率无明显影响。

脐带血有核细胞不同提取和保存方法的比较

目的:通过对脐带血有核细胞(CBNC)的提取和保存方法探讨,为脐带血有核细胞分离、储存和应用提供科学依据。方法:采用3种方法(Ficoll-Paque分离液法、1%甲基纤维素法、红细胞裂解法)分离CBNC,并应用不同储存液在不同时间对细胞进行冷冻和复苏培养。结果:红细胞裂解液法分离所获得的有核细胞数分别是Ficoll-Paque分离液方法的2.9倍(P<0.05)和1%甲基纤维素分离方法的10倍(P<0.01);且红细胞裂解液法所得有核细胞种类(包括淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞)也明显增多;细胞集落形成率与前两种方法比较亦有显著性差异。H3-TdR掺入的细胞活力观察发现,在4℃和20℃条件下存放24h,不同温度下细胞活力没有明显改变。以人脐血血清+DMSO为保护液在液氮储存CBNC 1年,复苏后仍有很强的细胞集落形成能力。结论:应用红细胞裂解液分离提取CBNC获得的细胞数量和种类优于其他两种方法。CBNC冻存时适当加入人脐血清,复苏后克隆形成能力明显增强。

人羊水来源间充质干细胞冻存后生物学特征研究

目的体外分离培养人羊水间充质干细胞(human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells,HAFMSCs),观察低温冻存复苏后HAFMSCs生物学特征,为进一步研究奠定理论基础。方法取12份自愿捐赠的孕16～20周羊水标本,采用改良两步法分离培养HAFMSCs,用含量不同的FBS、DMSO冻存液冻存细胞,液氮冻存12周后42℃水浴复苏,锥虫蓝染色检测细胞存活率,MTT法检测细胞增殖速度并绘制生长曲线,流式细胞仪检测冻存复苏后HAFMSCs表型。对冻存复苏后的HAFMSCs进行成脂、成骨诱导分化培养,并分别采用油红O、von Kossa染色进行鉴定;实时荧光定量PCR分析细胞冻存前后Oct-4、Nanog mRNA表达差异。结果细胞冻存12周后,不同的冻存方案对细胞存活率影响有差异,优化的冻存方案为DMEM/FBS/DMSO=50%/40%/10%。冻存复苏后的HAFMSCs呈漩涡状排列,生长曲线呈S形,与冻存前细胞生长曲线相似。流式细胞仪检测示冻存复苏后细胞的MSCs表型CD29、CD44、CD73、CD90为阳性,造血干细胞表型CD34、CD45为阴性。成脂、成骨诱导21 d,油红O、von Kossa染色均呈阳性。实时荧光定量PCR检测示冻存前后Oct-4、Nanog mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HAFMSCs具有体外增殖快、分化能力强的优势;并可耐受短期冻存,复苏后细胞存活率高,生物学特征及分化潜能未发生明显变化,冻存液DMEM/FBS/DMSO=50%/40%/10%是较好冻存方案。

肝细胞移植术——介入放射学的新领域

与传统的原位肝移植相比,肝细胞移植具有简单易行、应用灵活等优点。特别是介入放射学的发展,可运用经导管技术进行肝细胞移植术,对介入放射学而言,这是一极富吸引力和挑战性的新领域。本文就肝细胞移植的历史、现状及目前尚未解决的问题作一全面的综述,特别是冻存复苏、移植方法及基因治疗方面。