应用生物反应器建立人用冻干狂犬病疫苗(Vero细胞)生产工艺的研究

应用15L生物反应器,采用片状载体对Vero细胞进行高密度培养、制备高毒力滴度的狂犬病毒收获液,经纯化后生产人用冻干狂犬病疫苗。采用15L生物反应器对培养方法(批次培养和连续灌流培养)进行试验,收获高毒力滴度的狂犬病毒收获液并制备人用冻干狂犬病疫苗。结果表明:Vero细胞在接种狂犬病毒后可以连续收获病毒液达到25d以上,冻干狂犬病疫苗的效价可以达到5.54IU/剂。本工艺可以用于进行大规模的人用冻干狂犬疫苗的生产。

冻干狂犬病疫苗热原检测在HL-60单核细胞激活实验中的方法转移和验证研究

目的研究人早幼粒白血病HL-60单核细胞激活实验在人狂犬疫苗冻干人用狂犬病疫苗热原检测中的可行性。方法将已建立的HL-60单核细胞激活实验进行实验室间方法转移,并进行方法验证;参照《中国药典》细菌内毒素检查法中光度测定法中的干扰试验,用HL-60-IL-6单核细胞激活实验检测13批冻干人用狂犬病疫苗中的回收率及其热原含量。结果以不同浓度内毒素标准品刺激HL-60细胞导致细胞分泌IL-6的量计算与内毒素浓度的线性,R^(2)均为0.95以上;计算最低检测限不超过0.125 EU·mL^(-1);以内毒素含量为0.5、1.0 EU·mL^(-1)的溶液做回收实验,考察方法的准确度;通过HL-60-IL-6检测13批冻干人用狂犬病疫苗,内毒素的回收率均在50%~200%;对4批热原检查、内毒素含量测定不合格的冻干人用狂犬病疫苗和附带的3批注射用水,该方法检测结果与家兔热原检查法和内毒素测定法的结果一致。结论以IL-6为检测指标的HL-60单核细胞激活实验适用于冻干人用狂犬病疫苗的热原物质检测。

液体与冻干狂犬病疫苗临床反应与免疫原性观察

目的研究液体与冻干狂犬病疫苗的临床反应和免疫原性。方法对300例暴露于狂犬病的病人进行常规5针注射,其中100例使用国产Vero细胞液体狂犬病疫苗,100例用国产Vero细胞冻干狂犬病疫苗,100例用进口Vero细胞冻干狂犬病疫苗,观察每针注射后的局部反应和全身反应;在免疫后14d和42d(全程注射后14d)用间接免疫荧光法检测抗体水平。结果国产液体疫苗、国产冻干疫苗和进口冻干疫苗局部反应发生率分别是28.6%、3.6%、3.2%。全身反应发生率分别是4.4%、1.2%、0.8%。免疫14d后国产液体疫苗、国产冻干疫苗、进口冻干疫苗的抗体阳转率分别是82%、96%,98%。免疫42d后抗体阳转率分别93.68%、98.98%、98.99%。结论冻干狂犬病疫苗的临床反应和免疫原性优于液体狂犬病疫苗。

液体与冻干狂犬病疫苗副反应与效果观察

目的研究国产液体与冻干狂犬病疫苗的副反应和免疫原性。方法对850例暴露狂犬病病人进行常规5针注射,分别是345例使用Vero细胞液体狂犬病疫苗,505例使用Vero细胞冻干狂犬病疫苗,观察每针注射后的局部副反应和全身副反应,在免疫后14d～42d(全程注射后14d)用间接免疫荧光法检测抗体水平。结果液体与冻干狂犬病疫苗局部副反应分别为14.2%、6.0%,全身副反应发生率分别为4.9%、2.4%,免疫14d后抗体阳性率分别是62.5%、89.9%,免疫42d后抗体阳性率分别为97.7%、98.6%。结论国产冻干狂犬病疫苗的副反应和免疫原性优于液体狂犬病疫苗。

液体与冻干狂犬病疫苗副反应与效果观察

目的研究国产液体与冻干狂犬病疫苗的副反应和免疫原性。方法对850例暴露狂犬病病人进行常规5针注射,分别是345例使用Vero细胞液体狂犬病疫苗,505例使用Vero细胞冻干狂犬病疫苗,观察每针注射后的局部副反应和全身副反应,在免疫后14d和42d(全程注射后14d)用间接免疫荧光法检测抗体水平。结果液体与冻干狂犬病疫苗局部副反应分别为14.2%、6.0%,全身副反应发生率分别为4.9%、2.4%,免疫14d后抗体阳性率分别是62.5%、89.9%,免疫42d后抗体阳性率分别为97.7%、98.6%。结论国产冻干狂犬病疫苗的副反应和免疫原性优于液体狂犬病疫苗。

国产冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的接种反应及其免疫原性

目的观察国产冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的接种反应及其免疫原性。方法观察组200例和对照组50例暴露后,按照0、3、7、14、28d免疫程序,分别接种国产、进口冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)。观察组接种疫苗后,观察全身和局部反应情况。采用快速荧光灶抑制试验(RFFIT)检测观察组和对照组接种后的血清中和抗体水平。结果观察组疫苗接种后,局部红肿、硬结、疼痛、瘙痒发生率分别1.4%、0.8%、17.1%和2.4%;全身反应发热、皮疹、头痛、疲劳乏力和其他反应发生率分别为1.2%、0.4%、2.4%、4.2%和0.3%,且在第7天完全消失。观察组与对照组疫苗首剂接种后7d,抗体阳转率分别为40.3%和37.0%,14d分别为95.5%和97.7%,差异无统计学意义;且首剂接种后45d,抗体阳转率均为100%。观察组和对照组疫苗首剂接种后7、14、45d,血清中和抗体GMT差异无统计学意义,14、45d血清中和抗体GMT均大于0.5IU/ml。结论国产冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)接种反应轻微,并具有良好的免疫原性。

国产冻干人用狂犬病疫苗的安全性及免疫原性观察

目的 观察国产冻干人用狂犬病疫苗(人二倍体细胞)的安全性及免疫原性.方法 选取我中心2014年6月—2016年6月收治的300例狂犬病暴露者,按照随机数字表法将其分为观察组和对照组,每组各150例.观察组接种国产冻干人用狂犬病疫苗,对照组接种进口冻干人用狂犬病疫苗,每次接种后观察72 h内局部反应及全身反应发生情况,于首剂免疫后7 d、14 d、45 d检测血清中和抗体.结果 2组接种者局部反应及全身反应发生率无明显差异(P>0.05).首剂免疫后7 d、14 d、45 d 2组接种者血清中和抗体几何平均滴度(GMT)及抗体阳转率均不存在明显差异(P>0.05).结论 国产冻干人用狂犬病疫苗(人二倍体细胞)接种安全性高,具有良好的免疫原性.

冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)过敏性试验研究

目的研究冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)有无过敏反应。方法采用豚鼠主动全身过敏试验、小鼠腘窝淋巴结试验和大鼠被动皮肤过敏试验,全面评价冻干人用狂犬病疫苗肌肉注射能否引起过敏反应。结果冻干人用狂犬病疫苗豚鼠主动全身过敏试验出现弱阳性反应;小鼠腘窝淋巴结试验结果为阳性,大鼠被动皮肤过敏试验出现潜在的阳性反应。结论冻干人用狂犬病疫苗肌肉给药可能引起过敏反应,临床应用需密切关注。

费休氏容量法测量冻干人用狂犬病疫苗中水分含量的不确定度分析

目的对费休氏容量法测量冻干人用狂犬病疫苗中水分含量的不确定度进行分析,为评价该方法的准确性和可靠性提供科学依据。方法建立费休氏容量法测量冻干人用狂犬病疫苗中水分含量的数学模型,找出影响不确定度的因素,并对各个不确定度分量进行评估。结果计算出各变量的不确定度,取包含因子K=2,置信概率为95%,费休氏容量法测量冻干人用狂犬病疫苗中水分含量的扩展不确定度为0.082%。结论卡尔费休容量法检测冻干人用狂犬疫苗中水分含量时,不确定度主要由测定时卡尔费休试液的消耗体积和滴定度F值产生,该评价方法适用于冻干狂犬疫苗水分测定的不确定度评定与报告。

卡尔费休容量法测定冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中水分含量

本文建立了卡尔费休容量法测定冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中水分含量的方法。将卡氏干燥炉温度设置为150℃,加热时间为10 min,联用卡氏干燥炉测定样品中的水分含量,并与未联用卡氏干燥炉的方法进行比较。试验表明,联用卡氏干燥炉测定水分的结果重复性好,操作简单方便。该方法可用于冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中水分含量的测定工作。

冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)肌肉刺激性试验研究

目的观察冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)肌肉给药后有无刺激反应。方法选取新西兰兔4只,左侧股四头肌肌肉注射冻干人用狂犬病疫苗1 m L 3次,右侧同法肌肉注射生理盐水作为对照。药后72 h取给药部位肌肉进行病理组织学检查。结果病理组织学检查结果显示给药侧肌组织肌纤维呈凝固性坏死,间质出血、水肿,单核细胞浸润;对照侧肌肉亦未见刺激反应。结论冻干人用狂犬病疫苗肌肉注射可能引起注射部位刺激反应。

两种狂犬病疫苗联合人狂犬病免疫球蛋白的效果分析

目的了解高州市犬伤重伤暴露人群注射冻干和液体人用狂犬病疫苗及联合注射人狂犬病免疫球蛋白的效果。方法调查对象为2005年8月1日～2006年11月30日到高州市疾控中心就诊的犬伤重伤者(全为Ш级伤)。狂苗用7针法(0、3、7、14、28d,第一第二针次加注1支)和5针法联合注射人狂犬病免疫球蛋白,全程免疫后第30d用酶联免疫法检测血清抗体水平,联合使用武汉生物制药研究所生产的人狂犬免疫球蛋白(批号20050702-1,生产日期20050501,有效期20080817),剂量为20IU/Kg体重,治疗中观察副反应。结果狂苗免疫抗体阳性率达到99.13%(574/579),不同程度的反应率为3.45%(20/579),579人中注射冻干狂苗7针法361人,抗体阳性率(360/361)99.72%,副反应为(5/361)1.38%,注射液体狂苗7针法59人,抗体阳性率(59/59)100%,副反应为(7/59)11.86%,注射液体狂苗5针法159人,抗体阳性率(155/159)97.48%,副反应为(12/159)7.5%,无中强反应发生。人狂犬病免疫球蛋白对伤口有抗感染、促进结痂、愈合作用。经设对照组比较,实验组平均结痂时间较对照组早2.43d,愈合时间早0.94d。结论冻干人用狂犬病疫苗7针法及联合应用人狂犬病免疫球蛋白治疗安全,副作用少,保护率高;狂犬病免疫球蛋白对伤口有促进伤口结痂、愈合作用。

HPLC同时测定药用卤化丁基橡胶塞中8种抗氧剂的可提取量及其在冻干人用狂犬病疫苗中的迁移量

目的建立高效液相色谱法(HPLC)同时测定药用卤化丁基橡胶塞中8种抗氧剂可提取量及其在冻干人用狂犬病疫苗中迁移量的方法,为橡胶类药包材研究和质量控制标准的修订提供参考,有效保障药品安全。方法以十八烷基键合硅胶为填充剂(Waters XBridge C18色谱柱,4.6 mm×250 mm,5μm),以0.1%甲酸水溶液为流动相A,以体积分数0.1%甲酸甲醇溶液为流动相B,梯度洗脱(0.0~10.0 min,30%A→20%A;10.0~17.0 min,20%A;17.0~19.0 min,20%→1%A;19.0~37.5 min,1%A;37.5~39.0 min,1%→30%A;39.0~42.0 min,30%A);流速1.2 mL·min^(-1);柱温:30℃;检测波长277 nm。结果8种抗氧剂在10~500μg·mL^(-1)内呈良好的线性关系(r>0.9998);精密度试验的RSD为0.2%~2.4%;稳定性试验的RSD为1.3%~3.7%;提取回收率为85.7%~98.1%;迁移回收率为97.7%~99.8%。6家企业8批次药用胶塞样品中共计检出2种抗氧剂,其迁移样品中均未检出抗氧剂。结论本方法操作简单,稳定准确,灵敏度高,经方法学验证,可用于药用卤化丁基橡胶塞中抗氧剂可提取量及其在冻干人用狂犬病疫苗中的迁移量的测定。

冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)上市后在≥18岁人群中暴露前免疫接种的安全性及免疫原性

目的评价冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)(简称狂犬病疫苗)上市后在≥18岁人群中暴露前免疫接种的安全性及免疫原性。方法2022年6—9月选择贵州省和山西省≥18岁人群作为研究对象。受试者分别按0、7、28 d各接种1剂狂犬病疫苗,于第1剂疫苗接种前及接种第3剂后14 d静脉采血5.0 mL。采用免疫荧光灶试验进行狂犬病病毒中和抗体检测,收集每剂疫苗接种后0~7 d不良事件。结果共120人完成入组,其中120人完成第1剂狂犬病疫苗接种,119人完成第2剂狂犬病疫苗接种,118人完成第3剂狂犬病疫苗接种。局部不良事件症状以疼痛为主,全身不良事件症状以发热、疲劳/乏力、头晕、关节痛、腹泻为主。接种第1剂狂犬病疫苗前抗体阳性率为2.54%,抗体几何平均浓度(geometric mean concentration,GMC)为0.40 IU/mL。完成3剂疫苗接种后,抗体阳性率和阳转率均为100%,抗体GMC为9.68 IU/mL,抗体几何平均增长倍数(geometric mean increase,GMI)为23.99。接种第1、2、3剂狂犬病疫苗0~7 d的不良事件发生率分别为22.50%、13.45%和4.24%。结论狂犬病疫苗上市后在≥18岁人群中开展暴露前免疫具有良好的安全性及免疫原性。

冻干人用狂犬病疫苗原液纯度体积分子排阻高效液相色谱检测方法的建立及验证

目的 建立冻干人用狂犬病疫苗原液纯度的体积分子排阻高效液相色谱(size exclusion column-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)检测方法,并进行验证。方法 采用TSK-gel G6000PWXL色谱柱(7.8 mm×30 cm,13μm)进行测定,流动相为:0.1 mol/L PB缓冲液(pH 7.8);流速为:0.5 mL/min;检测波长为:280 nm;进样量为:20μL;柱温为:30℃。验证方法的系统适用性、专属性、精密性、耐用性,并确定检测限和定量限。采用建立的方法检测3批冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液及1批冻干人用狂犬病疫苗(人二倍体细胞)原液的纯度。结果 参比品与两种基质制备的冻干人用狂犬病疫苗原液目的蛋白色谱峰的分离度均> 1.5,峰拖尾因子均<1.5;空白溶剂在目的蛋白出峰位置无吸收峰,不干扰测定;精密性验证中的保留时间和峰面积RSD均<2.0%;定量限为10μg/mL,检测限为4μg/mL;参比品在278、280、282 nm 3种不同检测波长下连续进样3次,保留时间和峰面积RSD均<2.0%。4批冻干人用狂犬病疫苗原液的纯度均> 97%。结论 建立的冻干人用狂犬病疫苗原液纯度SECHPLC检测方法具有良好的专属性、精密性及耐用性,为人用狂犬病疫苗的质量控制提供了可靠方法。

国产冻干人用狂犬病纯化疫苗(Vero细胞微载体)的接种反应和免疫原性

目的观察国产冻干人用狂犬病纯化疫苗（Vero细胞微载体）的接种反应和免疫原性。方法在山东省高密市按临床方案的入选标准选取年龄在10-60岁,身体健康,无犬伤史、狂犬病疫苗接种史及该疫苗接种禁忌证的志愿者,分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期进行临床试验,按照免疫程序,接种国产冻干人用狂犬病疫苗,Ⅱ期临床试验以进口同类疫苗作为对照,进行接种反应和免疫原性观察。结果试验组疫苗接种后,不良反应发生率低,以人数计Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期不良反应发生率分别为6.1%、7.8%和7.7%,未见中、强反应,反应均为注射部位疼痛,不伴有局部红肿和硬结,为局部弱反应,未出现体温升高等全身反应,72 h时疼痛消失。Ⅱ、Ⅲ期临床免疫后,血清抗体阳转率14和45 d均为100%。试验组与对照组不良反应发生率和免疫后血清抗体阳转率差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论国产冻干人用狂犬病纯化疫苗（Vero细胞微载体）接种反应轻微,且具有良好的免疫原性。

冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)在10～60岁健康人群中的安全性及免疫原性

目的评价冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)在10~60岁健康人群中的安全性及免疫原性。方法在广西岑溪市和苍梧县选择1 200名10~60岁健康人群,采用随机、盲法、同类制品阳性对照的试验设计,将1 200名受试者按1∶1随机配对,分别接种试验及对照疫苗(市售国产同类制品)。按0、3、7、14、28 d免疫程序接种,观察首剂疫苗接种后42 d随访期内全身和局部不良反应;于首次接种后14及42 d采集静脉血,通过快速荧光灶抑制试验检测狂犬病病毒中和抗体,计算抗体几何平均浓度(GMC)。结果共有1 199名受试者完成安全性观察,试验疫苗组(600名)和对照疫苗组(599名)的全身反应发生率分别为12.33%和18.03%(P<0.05),常见症状均为发热(发生率分别为8.00%和13.19%);局部反应发生率分别为5.33%和10.52%(P<0.05),均以疼痛为主(发生率分别为4.17%和8.85%)。1 147名受试者完成免疫原性观察,试验疫苗组(571例)和对照疫苗组(576例)首剂疫苗免后14 d抗体阳转率分别为100.00%和99.83%,42 d均达100.00%,差异均无统计学意义(P>0.05);14 d抗体GMC分别为8.94和7.96 IU/ml,42 d分别为17.26和15.04 IU/ml,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)具有良好的安全性及免疫原性。

冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)在豚鼠体内主动过敏反应试验

目的观察冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)在豚鼠体内主动过敏反应情况。方法将18只雌性豚鼠随机分为3组:阴性对照组(给予0.9%氯化钠注射液,致敏剂量为0.5 ml/只,激发剂量为1 ml/只)、阳性对照组[给予人血白蛋白,致敏剂量为20 mg/(0.5 ml·只),激发剂量为40 mg/(1 ml·只)]、供试品组[给予冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞),致敏剂量为1剂/(0.5 ml·只),激发剂量为2剂/(1 ml·只)],每组6只。致敏试验均经豚鼠后肢肌肉多点注射,隔日免疫1次,共免疫3次;末次致敏后14 d进行激发试验,均经豚鼠足部静脉注射给药,观察各组豚鼠的一般临床症状、体重及全身过敏反应症状。结果致敏期间,所有动物均未见异常表现。试验期间,各组豚鼠体重均呈增长趋势。静脉激发后,阴性对照组豚鼠未见过敏反应症状,过敏反应呈阴性;阳性对照组过敏反应呈阳性至极强阳性;供试品组动物过敏反应呈弱阳性至阳性。结论冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)安全性良好,为其临床使用提供了实验依据。

冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)冻干保护剂的筛选

目的筛选适用于冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的冻干保护剂。方法用同一批冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液在同一冻干条件下,改变右旋糖酐40、海藻糖及人血白蛋白3种保护剂主要成分的含量,组合成6种保护剂配方,分别制备成半成品。冻干后检测成品外观、疫苗效力及热稳定性,确定最佳冻干保护剂配方。以最佳保护剂配方制备6批成品进行适用性验证,并选择3批成品进行长期稳定性验证。结果确定最佳冻干保护剂的配方为4%海藻糖、3%右旋糖酐40、1%蔗糖、0.5%甘露醇、2%人血白蛋白。以该配方制备的6批成品的各项检测指标均符合《中国药典》三部(2010版)的要求,其中3批成品经2~8℃保存12个月后的效价较稳定。结论筛选获得了最佳冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的冻干保护剂,且具有良好的稳定性。

冻干无佐剂Vero细胞狂犬病疫苗免疫应答动态观察

目的评价国产冻干无佐剂Vero细胞狂犬病疫苗的免疫原性。方法选择既往无明确狂犬病疫苗接种史和犬伤史、符合研究方案制定的入选标准和排除标准为研究对象,对暴露于狂犬病的患者采用常规5针注射。观察对象于首针接种前、首针接种后7、14、28、45d,全程后6个月采集血样检测抗狂犬病中和抗体。结果符合入选标准和排除标准的观察对象90名常规接种5针冻干无佐剂Vero细胞狂犬病疫苗。观察对象接种前狂犬病抗体均为阴性,接种首针后7d狂犬病抗体阳转率为12.22%,接种首针后14d阳转率达到100%,接种首针后28、45d和全程后6个月的阳性率均为100%。接种首针后7d抗狂犬病病毒综合抗体的几何抗体平均滴度(GMT)仅为0.27IU/ml,接种首针后14d狂犬病抗体的GMT达到2.52IU/ml,较首针接种后7d增长9.33倍。接种首针后28、45d狂犬病抗体的GMT分别达到4.43、7.08IU/ml,较首针后14d分别增长1.76倍、2.81倍。全程接种后6个月狂犬病抗体的GMT仍达到8.41IU/ml。结论国产冻干无佐剂Vero细胞狂犬病疫苗具有良好的免疫原性,6个月内再被暴露于狂犬病动物者可以不需要接种狂犬病疫苗。