准噶尔雅罗鱼β-肌动蛋白基因启动子的克隆及其活性功能初步检测

以开发利用新疆濒危鱼类准噶尔雅罗鱼(Leuciscus merzbacheri)基因资源为研究目的,利用PCR技术克隆准噶尔雅罗鱼的β-actin基因,得到的β-actin基因片段SZ21包含启动调控区,大小为2398bp。SZ21的启动调控区包括β-actin基因上游调控序列、第1、第2、第3和第4外显子部分序列。上游调控序列中含有对转录起重要作用的CAAT框、TATA框和CArG框等元件。对启动子序列在线分析表明,获得的启动子含有E-box、RU49、ZBPF、CEBP、CREB等多个重要转录因子结合位点。用AatⅡ破坏真核表达载体pEGFP-N1-AFPⅢ中的CMV启动子,将准噶尔雅罗鱼的SZ21启动调控区克隆到载体pEGFP-N1-AFPⅢ(CMV坏)上,构建成重组表达载体β2pEGFP-N1-AFPⅢ。脂质体转染BHK-21细胞。结果表明,克隆的准噶尔雅罗鱼β-actin基因启动子SZ21具有启动EGFP报告基因在哺乳动物细胞中表达的活性。通过BHK-21绿色荧光细胞的传代证实,克隆的启动子具有持续启动蛋白基因表达的活性,在细胞传代中可以遗传。PCR检测传代的BHK-21绿色荧光细胞基因组DNA,均能检测到SZ21目的片段。文章成功分离了具有活性功能的准噶尔雅罗鱼β-actin基因启动子。

准噶尔雅罗鱼标记放流评价

为了积极救护准噶尔雅罗鱼的种质资源,2019年首次在新疆精河入艾比湖三角洲开展准噶尔雅罗鱼标记放流,放流地点为艾比湖南岸湖滨区,标记方法有4种,分别是PIT频射芯片、色素注射、CWT线码和荧光(ARS)浸染标记,2019—2020年共标记3.2万尾。结果表明:准噶尔雅罗鱼PIT频射芯片标记伤口使用100 mg·L^(-1)的高锰酸钾溶液涂抹消毒,有利于损伤组织迅速结痂,减少损伤处病原体感染;色素注射标记颜色以绿色为佳,植入鱼类上额的皮下组织,标记横向长度为10~12 mm;CWT线码标记的植入位置为上额的皮下组织;荧光浸染标记中茜素红S(ARS)浓度160~180 mg·L^(-1)对准噶尔雅罗鱼未造成明显损伤;4种标记成活率均高于98.8%,标记保持率均高于93.7%,说明4种方法适合准噶尔雅罗鱼的放流标记。该结果可为准噶尔雅罗鱼的增殖放流及效果评估工作提供科研基础。

准噶尔雅罗鱼ISSR-PCR反应体系的建立与优化及引物筛选

为研究准噶尔雅罗鱼的遗传多样性,对ISSR-PCR的反应条件进行了优化和适合引物的筛选,采用正交设计方法,选用L9(34)正交表,以准噶尔雅罗鱼的基因组DNA为模板,对影响PCR反应较大的4个因素:Taq酶、Mg2+、dNTPs、引物在3个水平上进行优化试验,得到准噶尔雅罗鱼最优ISSR-PCR反应体系:25μL反应体系中含有1×PCR buffer、0.5 UTaq酶、3.0 mmol/LMgC l2、250μmol/L dNTPs、0.75μmol/L引物、DNA模板30 ng。利用优化体系从32条引物中筛选得到13条适用引物,并确定了各引物最佳退火温度。

准噶尔雅罗鱼仔鱼饥饿试验及不可逆点的确定

为了更好地救护和增殖中国特有易危物种准噶尔雅罗鱼,在水温(21.0±1.5)℃条件下,利用人工采卵授精法获得准噶尔雅罗鱼初孵仔鱼进行饥饿试验,确定仔鱼不可逆点(PNR),研究投饵对仔鱼的生长、发育和行为的影响。结果显示:1)准噶尔雅罗鱼仔鱼3日龄开口摄食,开始营外源性营养,仔鱼卵黄囊于5日龄已基本被消耗完毕,混合营养期仅维持2 d,属于易遭受饥饿胁迫鱼类;2)初次摄食率为36.0%,初次摄食率最高在7日龄,可达96.6%,PNR出现在仔鱼孵化后的9~10日龄,3日龄后饥饿组对仔鱼卵黄囊的吸收速度影响极显著(P<0.01)。仔鱼具有摄食能力仅6~7 d,在到达PNR后3 d左右饥饿组即全部死亡,其耐受饥饿能力较差;3)在饥饿胁迫条件下的仔鱼对卵黄囊的吸收进程慢于正常对照组仔鱼,5日龄后饥饿对仔鱼体长影响显著(P<0.05),饥饿组仔鱼6日龄生长发育出现负增长,7日龄开始出现脊索弯曲、腹部凹陷、胸角,集群性、初次摄食力均与饥饿时间呈负相关,并且表现出一系列明显的由饥饿导致的形态和行为学特征。

准噶尔雅罗鱼原种的采捕、暂养、运输和救治

为探索准噶尔雅罗鱼最佳的异地迁移方法,积极开展种质资源保护,本研究采用地笼网、拦河网和围网进行采捕,放入微型土池、水泥池、网箱等3种暂养池暂养,再利用帆布水箱、铁制水箱和鱼苗袋将暂养后的原种长距离运输到新疆水生野生动物救护中心,经采用氯化钠、聚维酮碘和高锰酸钾救治后进行驯养。结果显示:在精河入艾比湖三角洲区域,围网捕捞成活率可达97.47%;网箱暂养成活率高达92.86%;鱼苗袋充氧降温运输,成活率可达97.17%;在救治方面,采用15~20 mg/L高锰酸钾溶液药浴20~30 min,能起到更好的杀菌消毒和促进伤口愈合的效果,保证成活尾数。3年共计采捕准噶尔雅罗鱼原种534尾,经驯化保种195尾,最终存活率为36.52%,成功地进行异地迁移,为今后规模化开展苗种繁育奠定了良好基础。

茜素红S对准噶尔雅罗鱼幼鱼的急性毒性与标记效果

采用单因子半静态急性毒性实验法研究了茜素红S(ARS)对准噶尔雅罗鱼幼鱼的毒性效应,旨在科学跟踪和监测增殖放流标记的准噶尔雅罗鱼,以期为ARS标记工作提供理论依据及数据参考。结果表明:在水温17℃~23℃条件下,准噶尔雅罗鱼幼鱼体重为(5.21±0.34)g,中毒症状主要表现为体表黏液腺分泌不断增多、眼球损伤、鳃丝发暗甚至粘连有红色絮状物、肠道充血出血、肝脏功能损伤、胆囊出血肿胀以至发紫发黑等。ARS对准噶尔雅罗鱼幼鱼的24 h、48 h、72 h、96 h的半致死浓度分别为377.2 mg/L、336.7 mg/L、306.2 mg/L、291.7 mg/L,安全浓度为80.5 mg/L。ARS浓度为200 mg/L时,96 h成活率为100%;ARS浓度为450 mg/L时,48 h全部死亡。随着浓度的增加,ARS对准噶尔雅罗鱼幼鱼的毒性也增加,呈正相关性。ARS浓度分别在250 mg/L、300 mg/L、350 mg/L时,中毒后存活的幼鱼经继续养殖30 d,平均摄食率为60.60%,平均成活率为59.91%,97尾幼鱼机体基本恢复活力,能够正常摄食生长。综上,ARS对准噶尔雅罗鱼幼鱼的毒性为低毒性,适合标记放流。ARS能在准噶尔雅罗鱼幼鱼的失耳石、微耳石上形成标记环,在可见光下标记环呈紫红色。ARS浓度为200 mg/L时(浸染24 h)标记效果强烈,幼鱼既未出现死亡,又能达到最佳染色标记效果。

准噶尔雅罗鱼组织同工酶表达特性

使用不连续PAGE法,分析了10尾准噶尔雅罗鱼(Leuciscus merzbacheri)眼睛、鳃、皮、背部肌肉、鳍和肝胰脏6种组织的10种同工酶(LDH,CCO,EST,CAT,POD,ME,MDH,G6PD,GDH,ADH)的差异表达,并对部分同工酶基因位点及表达酶谱表型进行了分析,以期为其种质资源保护和开发以及遗传育种等方面的研究提供基础资料。结果显示,10种同工酶中9种在6种组织中出现了明显的组织差异性,仅CCO在6种组织中的差异性较小。在对准噶尔雅罗鱼的10种同工酶的遗传多样性分析中,共记录到了21个基因位点,其中Est-1、Me-B、s-MDH、G6pd-A、G6pd-B和Adh-A为多态性基因位点。多态位点比例为:P=6/21=28.57%。

准噶尔雅罗鱼染色体核型及带型的初步研究

以肾细胞作材料,采用秋水仙素-低渗-空气干燥法、Ag-NORs、C-带和G-带显带技术对准噶尔雅罗鱼(Leuciscus merzbacheri)染色体进行了研究。结果表明:(1)准噶尔雅罗鱼2n=50,核型组成为18m+14sm+6st+12t,NF=82,没有异型性染色体分化。(2)Ag-NORs的数目在不同的细胞中表现出多态性,数目为1～2个,出现1个Ag-NORs的频率最低(10%),出现2个的频率最高(70%);Ag-NORs主要出现在m1对和m4对同源染色体上;未发现有Ag-NORs联合的现象。(3)准噶尔雅罗鱼的染色体均呈现C-带阳性,可分为着丝粒C-带和端粒C-带。(4)同源染色体上G-带带纹基本一致,其带纹在每对染色体上的数目及分布具有明显特征性。

准噶尔雅罗鱼β-肌动蛋白基因启动子克隆及序列分析

利用PCR方法克隆了准噶尔雅罗鱼(Leuciscus merzbacheri)的β-actin基因启动子片段SZ21,大小是2398bp。对克隆的启动子序列进行了转录调控元件的生物信息学预测分析,同时,基于启动子中包含的开放阅读框和内含子序列,探讨了准噶尔雅罗鱼与鲤鱼(Cyprinus carpio)、草鱼(Ctenopharyngodon idella)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)、团头鲂(Megalobrama amblycephala)、泥鳅(Misgurnus mizolepis)间的系统进化关系。结果显示,该启动子序列的3个核心启动子转录元件:CAAT-box、CArGmotif和TATA-box分别在转录起始位点(+1)上游的-89、-59、-26处,序列中还含有MEF2、SATB、CHRF、INRE、MTEN、E-box、RU49、ZBPF、CREB、Enhance region、CEBP位点等多种转录调控元件。在剪接体内含子中,剪接位点遵循GT…AG法则。启动子SZ21序列含有3个内含子和155个氨基酸。内含子1、内含子2、内含子3的系统发育分析表明,团头鲂与草鱼和青鱼的亲缘关系要比与准噶尔雅罗鱼的更近一些,这与传统分类中的亲缘关系显示不一致,其原因尚需探讨。

新疆赛里木湖准噶尔雅罗鱼生物学特征观测

对生活于新疆赛里木湖的准噶尔雅罗鱼的年龄、生长、肥满度、食性和繁殖等生物学特性进行了观测研究。在赛里木湖,1+龄准噶尔雅罗鱼平均体长为8.6cm,2+龄为13.0cm,3+龄为16.7cm,4+龄为18.3cm。其体长与体重的相关关系为:W=0.008934L3.28640(r=0.995)。雌雄个体最小性成熟年龄均为2+龄,繁殖时间在8～9月,绝对怀卵量平均为19454粒/尾,卵粘性。该鱼为杂食性,在赛里木湖主要以钩虾为食。

新疆3种雅罗鱼的多元形态

为了揭示高体雅罗鱼(Leuciscus idus)、贝加尔雅罗鱼(Leuciscus baicalensis)和准噶尔雅罗鱼(Leuciscus merzbacheri)的形态信息和规律,指导新疆雅罗鱼物种的识别、资源保护和良种选育。本研究运用主成分分析、聚类分析及判别分析,对 3 种鱼的 11 个可量指标和 18 个框架指标进行了多元形态差异分析。主成分分析结果提取 3个主成分,贡献率分别为 57.71%、9.019%、6.502%,累积贡献率为 73.23%;主成分 1 的贡献指标主要集中于头部和尾柄部,头部指标主要包括 HL/BL、 ML/BL、 SL/BL、 L1-2/BL、 L1-3/BL和 L2-3/BL共计 6个指标,尾柄部包括 CL/BL、L6-8/BL、L6-8/BL、L7-8/BL 和 L8-9/BL 共计 5 个指标。聚类分析结果显示,高体雅罗鱼和贝加尔雅罗鱼亲缘关系较近,高体雅罗鱼、贝加尔雅罗鱼与准噶尔雅罗鱼亲缘关系较远。判别分析筛选出 11 个指标(集中于头部和尾柄部),建立了新疆 3种雅罗鱼的形态判别函数,将 3种鱼的数据代入函数,得到高体雅罗鱼与贝加尔雅罗鱼之间相互判错的概率大,与准噶尔雅罗鱼之间判错的概率均较小;高体雅罗鱼与贝加尔雅罗鱼的个体判别准确率(P1、P2)均为 80%以上,准噶尔雅罗鱼的个体判别准确率(P1、P2)达到 95%以上;非交互验证综合判别率为 91.2%,交互验证综合判别率为 89.4%,两种综合判别率均高且接近,认为判别公式是可信的。新疆 3 种雅罗鱼被分为两支群体,彼此之间形态差异主要体现在头部和尾柄部,且能够用多元回归函数进行判别。