马钱子对三种软骨细胞凋亡模型的影响

目的:观察中药马钱子对三种软骨细胞凋亡模型的影响。方法:在兔软骨细胞培养体系中分别加入2mmol/L硝普钠(SNP)、2mmol/LSNP+马钱子、10-4mol/L全反式维甲酸(ATRA)、10-4mol/LATRA+马钱子;在人胚胎软骨细胞培养体系中加入30ng/L肿瘤坏死因子α(TNFα)、TNFα+马钱子,各组培养24h后,采用AnnexinV/PI双参数法对软骨细胞凋亡进行定量检测。结果:软骨细胞在加入SNP、ATRA、TNFα发生凋亡时,加入马钱子能降低SNP、ATRA诱导的软骨细胞凋亡率(P<0.01,P<0.05),但对TNFα诱导的软骨细胞凋亡,无明显抑制作用(P>0.05)。结论:中药马钱子对部分软骨细胞凋亡有一定抑制作用。

二烯丙基二硫启动人白血病HL-60细胞凋亡模型的建立

目的寻找二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人白血病HL-60细胞凋亡的启动点,建立DADS启动HL-60细胞凋亡模型。方法实验设未处理组、处理组和撤药组,分别采用细胞计数、流式细胞术、DNA凝胶电泳、Western blot等方法,绘制生长曲线,检测凋亡率、活化的caspase-3表达率以及DNALadder、凋亡相关蛋白的检测。结果3.6mg.L-1DADS作用HL-60细胞1d,与对照组相比,细胞数没有明显变化,而作用2～6d,细胞数分别减少24.1%、36.5%、44.2%、52%、53.6%。DADS作用1、2d,凋亡率分别为3.1%、4.3%,与未处理组(3.0%)差异无显著性,而作用3～5d的凋亡率分别达到8.5%,15.2%,27.4%,均高于未处理组(P<0.05)。DADS作用2～5d撤药后再培养至d6,凋亡率分别为7.9%,12.4%,16.5%,18.8%,高于未处理组的3.3%(P<0.05)。处理2～5d后,活化的caspase-3的表达率分别为10.0%、10.4%、14.9%、17.3%,均高于未处理组5.4%(P<0.05)。处理组中DADS处理4d后DNA凝胶电泳出现梯状条带,而DADS作用2～5d撤药后再培养至d6均出现明显梯状条带。Westernblot结果表明,从作用2d起,caspase-3表达开始上调,而Bcl-2表达开始下调。结论3.6mg.L-1DADS诱导人白血病HL-60细胞凋亡的启动点为处理2d。

ATP对大鼠成肌细胞抗H_2O_2凋亡模型分析

为了探讨解决L6大鼠成肌细胞被H2O2损伤的问题,分别用1.210 48、2.420 96、4.841 92 g/L ATP溶液对成肌细胞处理后,利用MTT法、流式细胞仪和荧光凋亡抗体检测了细胞损伤程度.结果表明,经H2O2损伤后L6成肌细胞存活率明显降低,凋亡率增加.各种剂量ATP溶液均能提高L6成肌细胞的存活率,促使抗凋亡因子bcl-2表达增加,促凋亡因子bax表达降低,减少凋亡的发生.其保护程度随ATP溶液剂量的减少而增强,在1.210 48 g/L剂量时效果最为显著.ATP溶液对H2O2诱导损伤的L6大鼠成肌细胞具有明显保护作用,其机制是通过mTOR/STAT3信号通路增强凋亡抑制因子bcl-2表达、抑制凋亡促进因子bax表达,从而与抑制细胞凋亡有关.

构建游离脂肪酸诱导胰岛细胞凋亡模型验证球形脂联素的拮抗作用

目的:构建游离脂肪酸(棕榈酸)诱导胰岛细胞凋亡模型,并观察球形脂联素对胰岛细胞凋亡的拮抗作用。方法:实验于2004-15/2005-30在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心完成。构建游离脂肪酸诱导胰岛细胞凋亡模型及分组:采用小鼠胰岛素瘤细胞株βNIT-1,取对数生长期的细胞,按1×105个/孔的密度接种于6孔板,细胞生长至80%融合时将随机细胞分为3组,每组3孔,分别为对照组,棕榈酸组,棕榈酸+球形脂联素组。3组培养基均含5g/L的牛血清白蛋白、体积分数为0.03胎牛血清及体积分数为0.01的无水乙醇;棕榈酸组又加含有终浓度为500μmol/L棕榈酸;棕榈酸+球形脂联素组又加终浓度为500μmol/L棕榈酸和0.5mg/L脂联素。处理48h后终止实验。采用Hochest33342和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测棕榈酸诱导胰岛细胞凋亡率和凋亡指数及脂联素处理后脂性凋亡的改善情况。结果:①经Hochest33342染色检测3组小鼠胰岛素瘤细胞株βNIT-1细胞凋亡指数明显不同(F=300.270,P<0.05),棕榈酸组明显高于对照组犤(12.40±1.57)%,(2.05±0.59)%犦,说明500μmol/L棕榈酸可成功构建胰岛细胞凋亡模型,经脂联素处理后凋亡指数明显降低犤(12.40±1.57)%,(3.87±0.93)%犦,说明球形脂联素组对胰岛细胞凋亡有拮抗作用。②经脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测小鼠胰岛素瘤细胞株βNIT-1细胞凋亡指数3组明显不同(F=191.221,P<0.05),棕榈酸组明显高于对照组犤(26.33±5.6)%,(2.32±0.78)%犦,说明500μmol/L棕榈酸可成功构建胰岛细胞凋亡模型,经脂联素处理后凋亡指数明显降低犤(2.32±0.78)%,(4.90±0.82)%,P<0.05犦说明球形脂联素组对胰岛细胞凋亡有拮抗作用。结论:①Hoescht染色法及脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法结果均表明在体积分数为0.03胎牛血清、5g/L的牛血清白蛋白的Dulbecco改良的Eagle培养液条件下加入终浓度为500μmol/L棕榈酸处理细胞48h可成功构建胰岛细胞凋亡的细胞模型。②球形脂联素可拮抗胰岛细胞的脂性凋亡,从而发挥了其调节糖脂代谢的作用。

人重组Fas配体体外诱导细胞周期特异性凋亡模型的建立及其意义

以Molt-4、Jurkat细胞株和外周血淋巴细胞(peripheralbloodlymphocyte,PBL)为靶细胞,检测细胞膜上Fas的表达。人重组Fas配体(recombinanthumanFasligand,rhFasL)诱导细胞6～36h后用改良后的API等方法检测细胞凋亡及诱导凋亡过程中细胞周期蛋白的变化,探讨Fas介导的细胞凋亡与细胞周期的关系。结果显示:rhFasL诱导Molt-4、Jurkat细胞株和植物血凝素刺激进入细胞周期的PBL的凋亡具有细胞周期特异性并始动于G1期;而G0期PBL的细胞膜上虽然也有Fas的表达,但不能诱导细胞凋亡。研究还发现rhFasL诱导细胞凋亡时G1期的细胞周期蛋白D3明显升高,细胞周期蛋白E明显下降。以上结果表明rhFasL体外诱导的细胞凋亡发生在晚G1期,细胞凋亡的发生与细胞是否通过限制点进入细胞周期有关,细胞凋亡发生于晚G1期是G1期细胞周期蛋白E的下降和检测点的监督导致DNA受损的细胞不能通过G1/S交界的结果。

体外培养的家兔视网膜色素上皮细胞凋亡模型的建立

【目的】探讨建立体外培养的家兔视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡模型的实验方法。【方法】实验组为加入浓度分别为0、100、200、400、600、800和1000μmol/L的吲哚美辛(I N),对照组为加入等体积无水乙醇,分别作用家兔RPE细胞24 h,用MTT法测量OD值来观察细胞凋亡的数量,对其进行定量分析。【结果】I N浓度分别为200、400、600、800、1000μmol/L作用RPE细胞24 h,其OD值分别为0.2094±0.0113、0.0799±0.0809、0.0685±0.0746、0.0538±0.0512和0.0501±0.0616,与对照组OD值0.3012±0.0395比较,都有显著性差异,有统计学意义。【结论】浓度≥200μmol/L的I N可以诱导RPE细胞有实验意义的凋亡。

肿瘤坏死因子α诱导大鼠软骨细胞凋亡模型的建立及鉴定

背景:肿瘤坏死因子α是诱导骨关节炎软骨细胞凋亡的主要细胞因子,对骨关节炎的病理进程具有重要调节作用。目的:比较不同质量浓度肿瘤坏死因子α诱导大鼠软骨细胞凋亡模型,为进一步探讨药物对软骨细胞凋亡的调控作用提供理论支持。方法:清洁级4周龄SD大鼠,采用机械-Ⅱ型胶原酶消化法获取膝关节软骨细胞,并用不同质量浓度的肿瘤坏死因子α(0,10,20,30,40μg/L)诱导建立软骨细胞的凋亡模型,倒置相差显微镜观察软骨细胞的形态结构,Ⅱ型胶原免疫组化鉴定软骨细胞,MTT检测软骨细胞的活性,DAPI检测软骨细胞的凋亡情况。结果与结论:(1)体外培养软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫组化染色可见胞浆呈棕黄色,为阳性细胞;(2)软骨细胞凋亡率,干预48 h肿瘤坏死因子α10,20,30μg/L明显高于0μg/L(P<0.01),肿瘤坏死因子α40μg/L明显高于10μg/L(P<0.01);(3)软骨细胞活性,干预48 h肿瘤坏死因子α10,20,40μg/L明显低于0μg/L(P<0.01),肿瘤坏死因子α20μg/L明显低于10μg/L(P<0.05),肿瘤坏死因子α40μg/L明显低于10μg/L(P<0.01)、20μg/L(P<0.05)。(4)结果说明,20μg/L肿瘤坏死因子α能成功建立炎症介导软骨细胞凋亡模型。

斑马鱼眼部细胞凋亡模型的建立

目的建立邻苯二甲酸二丁酯(DBP)诱导的斑马鱼眼部细胞凋亡模型,并用于抗眼部细胞凋亡药物的活性评价。方法斑马鱼受精后30 h(hpf),加入DBP(0.1、10、50、100μmol·L^-1)18 h和42 h,观察斑马鱼的存活率;将30或54 hpf的斑马鱼在直射光或非直射光条件下,加入DBP(0.1、1、5、10、50μmol·L^-1)造模18 h,吖啶橙染色(AO),采用体视荧光显微镜观察斑马鱼眼部细胞凋亡情况;造模同时,给予不同浓度N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)或人参皂苷Rg1,观察药物对斑马鱼眼部细胞凋亡的影响。结果DBP造模18、42 h,10μmol·L^-1及以下浓度对鱼卵存活率无明显影响,50μmol·L^-1及以上浓度会致使斑马鱼存活率明显降低(P<0.01);30 hpf的斑马鱼在10μmol·L^-1 DBP造模18 h后显示明显的眼部细胞凋亡(P<0.01)。斑马鱼在72 h可见眼部细胞自发性凋亡,且与光照条件无关。在该造模条件下,NAC或人参皂苷Rg1均能抑制斑马鱼眼部细胞凋亡(P<0.05)。结论利用DBP可快速高效地建立斑马鱼眼部细胞凋亡模型,该模型可用于药物活性的快速评价。

基于干眼症细胞凋亡模型观察淫羊藿总黄酮含药血浆对foxp3mRNA的作用

目的基于干眼症细胞凋亡模型观察淫羊藿总黄酮含药血浆对foxp3mRNA的作用。方法对雄性新西兰大耳白兔的泪腺上皮细胞进行培养,实验采用3代泪腺上皮细胞,将其随机分为淫羊藿总黄酮、雄激素和空白组。建立干眼细胞模型,将含有淫羊藿总黄酮、丙酸睾酮和空白的血浆分别加入三组泪腺上皮细胞进行干预,然后加入Trizol试剂分离RNA,最终免疫反应相关因子Foxp3mRNA的表达采用定量PCR法来检测。结果雄激素组和淫羊藿总黄酮组中Foxp3mRNA的含量高于空白组,差异显著(P <0.01);淫羊藿总黄酮组中Foxp3mRNA的含量高于雄激素组,差异显著(P <0.01)。结论含有淫羊藿总黄酮的血浆可增加干眼泪腺上皮细胞凋亡模型中Foxp3mRNA的含量。淫羊藿总黄酮含药血浆可增加Foxp3mRNA的含量来减少细胞凋亡。

NDRG2与转录因子NF-κB在不育症患者及动物睾丸间质细胞凋亡模型中的作用

睾丸间质细胞凋亡是一些临床不育症，例如，唯支持细胞综合征以及生精功能低下的患者睾丸活检标本中常见的病理改变。前期研究证实，许多促凋亡因子，例如，NF—κB（nuclear factor—kappaB）和Fas，在这一过程中发挥着重要作用。然而，睾丸间质细胞凋亡的具体信号通路仍不清楚。

体外培养成人心肌细胞凋亡模型的建立

目的 建立缺氧诱导体外培养的成人心肌细胞凋亡情况。方法 用胰蛋白酶和胶原酶进行消化 ,用差速黏附贴壁法、Brdu加入和人为破坏成纤维细胞法纯化心肌细胞 ,用IMDM培养基培养 ,4～ 6d后将体外培养的成人心肌细胞置于 3 %氧气、92 %氮气及 5 %二氧化碳孵箱中 ,6、12、2 4、48h缺氧后再恢复正常条件培养 4h ,造成缺氧损伤所致细胞凋亡模型 ,分别用倒置显微镜、电镜、TUNEL法技术检测凋亡发生的情况。结果 心肌细胞经历缺氧损伤后 ,倒置显微镜、电镜、TUNEL染色均观察到凋亡阳性细胞。TUNEL法定量检测 ,心肌细胞缺氧培养 6、12、2 4、48h后 ,其凋亡率分别为 :( 3 3± 0 9) %、( 8 3± 1 8) %、( 16 1± 2 6) %和( 19 4± 2 3 ) %。结论 心肌细胞凋亡率随着缺氧时间的延长而增高 。

顺铂诱导非洲绿猴肾细胞凋亡模型的建立

目的:建立常见凋亡诱导剂顺铂(Cisplatin)诱导非洲绿猴肾细胞(Vero)凋亡的模型,为进一步研究抗凋亡基因在细胞凋亡中的分子机理打下基础。方法:分别以不同浓度的顺铂处理Vero细胞48h,用噻唑蓝(MTT)比色法、Gimesa染色、流式细胞术检测,观察处理后细胞的生长活力和凋亡情况。结果:以未处理的细胞作为对照组,1、2、3、4、5μg/mL的顺铂处理的Vero细胞生存率分别为(79.02±6.10)%、(68.84±4.42)%、(56.66±4.07)%、(46.83±3.76)%、(29.04±5.93)%(P<0.01);经顺铂诱导后细胞形态学发生明显改变,出现膜小泡和凋亡小体形成等凋亡细胞特征;流式细胞仪检测,0、1、2、3、4、5μg/mL的顺铂处理的Vero细胞后凋亡率分别为1.66%±0.19%、16.65%±1.26%、24.82%±1.03%、36.22%±1.04%、48.49%±1.24%、43.34%±1.17%(P<0.01)。结论:本实验成功建立顺铂诱导非洲绿猴肾细胞凋亡模型,将有助于进一步探讨目的基因在Vero细胞凋亡作用的的分子机制。

淫羊藿总黄酮含药血浆对泪腺上皮细胞凋亡模型Caspase-3及Caspase-8表达的影响

目的观察淫羊藿总黄酮含药血浆对雄兔泪腺上皮细胞半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)及Caspase-8表达的影响,探究其作用机制。方法将体外培养的雄兔泪腺上皮细胞,随机分为淫羊藿黄酮治疗组(黄酮组)、含雄激素培养对照组(雄激素组)和空白对照组(空白组)。分别加入含淫羊藿总黄酮血浆、丙酸睾酮、空白血浆干预48 h后,各组加入双氧水(H2O2)诱导细胞凋亡。采用Western Blot法检测Caspase-3、Caspase-8的表达情况。结果与空白组比较,黄酮组及雄激素组Caspase-3、Caspase-8蛋白表达降低(P<0.01),同时黄酮组较雄激素组的Caspase-3、Caspase-8蛋白表达降低(P<0.01)。结论淫羊藿总黄酮含药血浆作用于泪腺上皮细胞凋亡模型可抑制Caspase-3及Caspase-8的表达。

六味地黄汤药物血清抗血管内皮细胞凋亡的作用

目的 :研究六味地黄汤及其药物血清对血管内皮细胞 (VEC)损伤模型的保护作用。方法 :本实验利用大肠杆菌内毒素 (LPS)致VEC凋亡模型 ,并通过MTT、细胞周期和凋亡细胞的检测 ,观察了药物血清对VEC的保护作用 ,并通过MDA、SOD等指标探讨其作用机理。结果 :六味地黄汤药物血清可减轻LPS对VEC的损伤 ,抑制VEC凋亡发生 ,促进VEC增殖 ;并可通过增加VEC分泌SOD ,清除MDA ,而达到其减轻LPS对内皮细胞损伤的目的。结论 :六味地黄汤具有保护VEC损伤模型的作用 ,这种作用将有助于血栓性疾病的防治。

氧化苦参碱对H_2O_2诱导的L_6成肌细胞凋亡的影响

研究氧化苦参碱对L6大鼠成肌细胞H2O2凋亡的影响.采用过氧化氢损伤L6大鼠成肌细胞的方法,建立L6大鼠成肌细胞H2O2凋亡模型.使用剂量为0.3,0.15,0.75 g/L的氧化苦参碱处理细胞.应用MTT法统计存活率和流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率,用DAPI荧光染色、HE染色以及Bax和Bcl-2抗体鉴定损伤程度,Western blot检测蛋白质差异.结果表明,H2O2损伤的成肌细胞存活率降低,凋亡率增加.各种剂量氧化苦参碱能提高成肌细胞的存活率,促使Bcl-2增高,Bax降低.对成肌细胞的保护程度随氧化苦参碱剂量增加而增强,在剂量为0.3 g/L时,效果显著,其次是0.15、0.75 g/L的氧化苦参碱.其生理生化机制是氧化苦参碱保护H2O2通过NFκB信号通路造成的大鼠成肌细胞凋亡模型.结果显示,氧化苦参碱具有作为新的抗氧化药物的潜力.

过氧化氢诱导体外培养的人脾细胞凋亡

目的:研究过氧化氢(H2O2)对人脾细胞影响的时效和量效关系,以获得稳定的人脾细胞凋亡模型. 方法:采用研磨法获得悬浮的人脾细胞,将细胞分组后给予相应的生理盐水或不同浓度的H2O2处理.运用四唑盐(MTT)比色法检测线粒体功能,将细胞与Annexin V—FITC/PI混合孵育后使用流式细胞仪检测早期凋亡细胞. 结果:人脾细胞线粒体功能及凋亡率与H2O2呈剂量一效应关系,随着H2O2浓度的增高,线粒体功能逐渐降低,而凋亡率则随H2O2浓度的增高而增加.同时它们与H2O2处理时间也存在时间-效应的关系.各处理组间细胞总凋亡率分别为55.01±9.11%(100μmol/L),44.07±9.00%(50μmol/L),30.20±6.75%(25 μmol/L)和9.97±1.68% (对照组)存在显著差异(P<0.05),以H2O2 100 μmol/L处理的细胞组于6 h达到凋亡高峰(69.28±3.01)%. 结论:H2O2可以诱导体外培养的人脾细胞凋亡,建立人脾细胞凋亡模型.

豁痰祛瘀法对糖尿病大鼠早期耳蜗毛细胞凋亡的影响

目的:探讨中医豁痰祛瘀法对四氧嘧啶糖尿病大鼠早期内耳病变中细胞凋亡的防护作用。方法:采用四氧嘧啶腹腔注射诱发糖尿病内耳病变大鼠模型,同时用中药复方高、低剂量灌胃治疗,并设立正常对照组、模型对照组、西药都可喜组(都可喜灌胃)、西药都可喜+优降糖组(二者混合灌胃),应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端技术(TUNEL)试剂盒进行测试。结果:TUNEL显示糖尿病大鼠耳蜗毛细胞、螺旋神经节细胞、血管纹内皮细胞出现凋亡细胞,而正常对照组无阳性凋亡细胞,模型对照组TUNEL阳性细胞数均明显高于中药复方组(P<0.05)。结果:豁痰祛瘀中药能够抑制糖尿病导致的耳蜗外毛细胞、螺旋神经节细胞等细胞的凋亡,改善听功能。

脉冲染料激光不同治疗周期对兔耳增生性瘢痕成纤维细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨不同治疗周期脉冲染料激光照射对增生性瘢痕动物模型伤口愈合过程中成纤维细胞增殖与凋亡的影响。方法:大耳白兔10只,建立兔耳腹侧面增生性瘢痕模型,对比研究在瘢痕形成过程中不同治疗周期(1周治疗组与2周治疗组)脉冲染料激光照射对兔耳瘢痕成纤维细胞的影响,采用免疫组化方法检测增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达和细胞凋亡的原位检测。结果:兔耳增生性瘢痕经不同治疗周期(1周治疗组与2周治疗组)脉冲染料激光照射后,按不同时间段取材进行免疫组化染色比较,两组无明显差异。结论:不同治疗周期脉冲染料激光照射均可抑制兔耳增生性瘢痕成纤维细胞的增殖过程,诱导细胞凋亡。但从减轻医生工作强度及减轻病患治疗费用角度考虑,利用脉冲染料激光治疗增生性瘢痕2周一次较为合适。

D-半乳糖致大鼠衰老模型的研究

目的探讨D-半乳糖腹腔注射法致大鼠衰老的合适剂量，以复制可靠的大鼠衰老模型。方法32只SD大鼠随机均分为D-半乳糖低（15rag／kg）、中（30mg／kg）、高（60mg／kg）剂量组和假手术组四组，Y型迷宫测定各组大鼠认知能力；焦油紫染色，TUNEL法检测其海马区细胞形态学变化、神经元凋亡；免疫组织化学染色检测P-AKt表达水平。结果和假手术组相比较，其他三组大鼠错误次数增加、时间延长，海马区锥体细胞层损伤严重，可见较多TUNEL阳性神经元，P-AKt活性明显降低，尤以D-半乳糖高剂量组最明显。结论D-半乳糖高剂量组大鼠认知障碍、海马区细胞凋亡及P-AKt表达障碍最明显，可以复制出与衰老大鼠程度近似的模型。

大鼠外伤性视神经损伤后P53、Bax和Caspase3蛋白的表达

目的:探讨大鼠外伤性视神经损伤后不同时间点的视网膜神经节细胞(RGCs)病理形态学改变,P53、Bax和Caspase3蛋白表达变化及其与视神经损伤发生机制的关系。方法:成年雌性Wistar大鼠72只,随机分9组,每组8只,其中2组分别为正常组和假伤组,其余为实验组。实验组应用液压颅脑损伤仪建立大鼠视神经损伤动物模型,分别于伤后1、3、5、7、9、14、28d各处死8只,病理学观察RGCs的改变,免疫组化方法分析P53、Bax和Caspase3在视网膜中的表达变化。结果:视神经损伤后ldRGCs开始减少,14d内呈快速减少,14d后减少速度减慢,28d后趋于稳定;P53、Bax、Caspase3伤后表达较正常组和假伤组明显增加。结论:视神经损伤后RGCs数目减少是其视功能下降的重要病理基础,凋亡是RGCs的死亡机制之一,P53、Bax和Caspase3在RGCs凋亡发生中起重要作用。