猪ASC及Ub基因的克隆及真核表达重组质粒的构建

炎症小体不仅参与机体的天然免疫反应,同时还参与机体抗病毒等多种宿主防御反应。在多种疾病相关信号通路反应中都伴随着蛋白质的泛素化修饰。NOD样受体(NLRs)介导的炎症小体信号通路中,凋亡相关点状样蛋白(ASC)是关键的接头蛋白。为了解猪瘟病毒(CSFV)感染对ASC泛素化水平的影响,通过RT-PCR从猪血管内皮细胞(ECs)中扩增获得ASC和泛素(Ub)的全长cDNA双链片段,连接至克隆载体pMD-18T,获得重组克隆质粒pMD-ASC和pMD-Ub。双酶切pMD-ASC获得ASC目的序列,连接至pcDNA3.1-Flag,双酶切pMD-Ub获得Ub目的序列,连接至pcDNA3.0-HA,获得重组表达质粒pcDNA3.1-Flag-ASC和pcDNA3.0-HA-Ub。将pcDNA3.1-Flag-ASC和pcDNA3.0-HA-Ub转染ECs,Western blot在蛋白水平检测ASC和Ub的表达。结果表明,成功构建了带有Flag标签的ASC真核表达质粒和带有HA标签的Ub真核表达质粒,且在ECs中获得高效表达,为进一步体外研究CSFV调控猪血管内皮细胞ASC泛素化的机制提供了实验基础。