crp缺失对猪霍乱沙门氏菌强弱毒株毒力的影响

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法将强毒株C78-1致弱,用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株,虽具有较好的免疫原性,但仍有一定的残余毒力。SC-1是临床分离的猪霍乱沙门氏菌强毒株。为了研制更加安全的弱毒株,利用重组自杀性质粒通过接合转移的方法构建了猪霍乱沙门氏菌C500株、C78-1及SC-1的crp缺失株。C78-1、crp-C78-1、SC-1、crp-SC-1、C500、crp-C500 6个毒株经小鼠毒力试验检测。LD50结果显示,crp缺失对猪霍乱沙门氏菌的毒力影响不大,毒力只是略为降低,其中以crp-C500株毒力最弱。综上所述,可以选用crp-C500株毒株作为猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株的选择。

重组沙门菌C78-1△crp（pEGFP-WAP-HNP-3）的构建及生物学特性研究

目的：构建大鼠乳清酸蛋白（WAP）启动子调控下的人防御素3（HNP-3）的重组减毒猪霍乱沙门菌C78-1△crp（pEGFP-WAP-HNP-3）,并对其生物学特性进行研究。方法将质粒pEGFP-WAP-HNP-3电转到减毒猪霍乱沙门菌C78-1△crp感受态,构建重组沙门菌C78-1△crp（ pEGFP-WAP-HNP-3）,并进一步研究其生物学特性。结果 PCR和测序结果表明C78-1△crp（pEGFP-WAP-HNP-3）构建成功。进行生物学特性分析表明,重组菌与亲本株C78-1相比失去了利用麦芽糖、鼠李糖等的能力,生长速度显著减慢,能够稳定遗传所携带的HNP-3基因,重组菌株的毒力约是亲本株C78-1的1/300,且重组菌注射到兔乳腺后的分泌乳中能够检测到HNP-3融合蛋白条带。结论重组菌C78-1△crp（pEGFP-WAP-HNP-3）构建成功,并能够分泌HNP-3融合蛋白,为进一步研究重组菌的功能提供基础资料。

猪霍乱沙门菌缺失株ΔcyaC78-1和ΔcrpΔcyaC78-1的构建及其生物学特性比较

为开发更加安全有效且遗传背景清晰的减毒猪霍乱沙门菌活疫苗,运用自杀性质粒介导的等位交换技术缺失cya基因,分别构建猪霍乱沙门菌缺失株ΔcyaC78-1和ΔcrpΔcyaC78-1,并将两者的生物学特性与ΔcrpC78-1和疫苗株C500进行比较。以猪霍乱沙门菌C78-1为模板,分别扩增cya基因的上臂和下臂,然后通过中间转移载体pBluescriptⅡSK(+)克隆至自杀性质粒pRE112中,构建重组自杀性质粒pREΔcya,再与C78-1和ΔcrpC78-1分别进行接合转移,通过两步法筛选ΔcyaC78-1和ΔcrpΔcyaC78-1。PCR及测序结果表明,ΔcyaC78-1和ΔcrpΔcyaC78-1构建成功。生物学特性检测结果表明,所构建的ΔcyaC78-1和ΔcrpΔcyaC78-1的血清型和生化特性与ΔcrpC78-1保持一致,并能够稳定遗传Δcya基因;两者的生长速度明显慢于疫苗株C500,且ΔcrpΔcyaC78-1的生长速度最慢。小鼠毒力试验表明,ΔcyaC78-1的毒力高于ΔcrpC78-1约1.7倍,较疫苗菌株C500下降至58.2%,但ΔcrpΔcyaC78-1的毒力较ΔcrpC78-1下降至0.194%,较C500下降至0.065%。构建的猪霍乱沙门菌缺失株ΔcyaC78-1、ΔcrpΔcyaC78-1遗传稳定,背景清晰,毒力降低,尤其是ΔcrpΔcyaC78-1双缺失株的毒力较疫苗株C500降低显著,为筛选更加高效的减毒猪霍乱沙门菌疫苗和进一步开发适用于猪的口服活疫苗载体奠定了良好基础。