冻干鼻喷流感减毒活疫苗病毒滴度FFA法的建立及验证

目的:建立并验证荧光灶法(FFA)检测冻干鼻喷流感减毒活疫苗病毒滴度的可行性。方法:采用FFA分别检测冻干鼻喷流感减毒活疫苗H1N1型、H3N2型、B型单一病毒收获液病毒滴度,并验证该方法的专属性、准确度、精密度、线性和耐用性。结果:该方法专属性良好;准确度回收率均为80%~115%,病毒滴度的试验内及试验间精密度RSD值均<10%;3个型别样品稀释倍数对数与病毒滴度呈线性关系,相关系数R2均>0.98;不同孵育温度的病毒滴度RSD值均<10%,耐用性良好。结论:建立的FFA具有良好的专属性、准确度、精密度、线性及耐用性,可用于冻干鼻喷流感减毒活疫苗病毒滴度检测。

玉林市重组禽流感病毒三价灭活疫苗的免疫效果探究

高致病性禽流感属于一类动物疫病,也是人畜共患病,其病毒毒株为H5和H7血清亚型。高致病性禽流感自2021年在欧美及亚洲国家肆虐以来,对我国乃至世界养禽业都造成了巨大损失,其中危害最严重的是H5N8亚型禽流感[1]。为降低H5N8亚型禽流感对我国家禽的危害,农业农村部经过多重评估和临床试验,对禽流感H5+H7亚型三价灭活疫苗毒株进行了调整,并于2022年将新疫苗投入使用。

新型水禽用三价禽流感病毒载体疫苗可有效阻断H5和H7亚型禽流感病毒感染与传播

2020年以来,H5亚型高致病性禽流感病毒先后在欧洲出现,并在欧洲引发大规模疫情,随后通过野鸟迁徙传入非洲、亚洲及北美多个国家,引起更大规模的疫情暴发。据世界动物卫生组织(WOAH)统计,新型H5N8和H5N1病毒在全球已累计导致约3亿多只家禽死亡或被扑杀,给养禽业造成了巨大损失。此次禽流感疫情导致大量家禽死亡或被扑杀,部分国家出现了“鸡蛋荒”。

猪繁殖与呼吸综合征两种减毒活疫苗免疫后病毒载量及抗体水平分析

为了解A、B两种商用猪繁殖与呼吸综合征减毒活疫苗免疫猪后病毒血症及抗体水平的差异,在后备母猪场随机选择100头35日龄后备母猪,分为A、B两组,分组后猪混养14 d。试验猪50日龄时,对A组50头后备母猪免疫A疫苗(1头份/头),B组50头后备母猪免疫B疫苗(1头份/头),疫苗免疫后0、1、2、3、5、7、10、14、21、28、35 d各组猪随机采集血样10份,荧光定量PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒载量,ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体。结果显示,B疫苗免疫后,试验猪的猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒血症期持续时间更久,持续至免疫后35 d;A疫苗免疫后,试验猪的猪繁殖与呼吸综合征病毒载量更高;B疫苗免疫后试验猪的N蛋白抗体水平变化趋势更稳定;B疫苗免疫后试验猪的PRRSV GP蛋白抗体水平更高。试验结果表明B疫苗的免疫效果优于A疫苗。

流感病毒改造新策略及其应用

流感病毒有着极强的变异性和传播性,常在全球范围内引起季节性的流感爆发。流感病毒的基因组序列、蛋白结构与功能、病毒的包装机制等环节研究相对清楚,也是一种重要的模式病毒,用于条件控制基因元件的发现和确证,构建智能响应型病毒等。随着反向遗传学与合成生物学的发展,通过基因工程改造的流感病毒能更好地控制病毒复制来提高疫苗的安全性,以及诱发机体产生强烈的免疫反应,在肿瘤免疫治疗领域引发广泛关注。本文描述了蛋白质水解靶向嵌合病毒、条件复制型流感减毒活病毒和高干扰素敏感病毒等三种新型减毒流感病毒改造策略,并对编码过早终止密码子的嵌合抗原肽的流感病毒、与PD-L1或CTLA4免疫检查点重组的流感病毒、截短的NS1片段表达GM-CSF的流感病毒分别对黑色素瘤、肝癌的溶瘤作用进行评述。未来,将通过创新性地运用不同策略、不同病毒来构建减毒活疫苗和溶瘤病毒,以便在临床上获得更加安全有效的治疗手段。

共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒的构建及免疫效果评价

旨在构建能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒,有望开发抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗,为控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路,对NDV疫苗载体的构建和优化有重要的参考意义。利用反向遗传技术,以rDHN3-mF为骨架,在病毒基因组的P和M之间的非编码区插入全长膜结合HA和另外一个带有截短跨膜结构域的可溶性HA蛋白,获得了能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的基因Ⅶ型NDV减毒株重组病毒rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA。通过鸡胚接种、Western blot、血凝效价(HA)及平均鸡胚致死时间(MDT)等试验来检测重组病毒的稳定性以及生物学特性,将重组病毒以10~6 EID_(50·)只^(-1)剂量免疫7日龄SPF鸡并测定血凝抑制(HI)抗体,在免疫后28 d对各组进行攻毒保护试验。结果显示:重组病毒在鸡胚中连续传至十五代后HA基因无突变发生;Western blot证明重组病毒可稳定高效地表达特异性的HA蛋白;重组病毒的生长曲线说明了重组病毒与亲本毒株具有相似的复制特性和低毒力特征;重组病毒免疫组的SPF鸡均能产生针对NDV或者H9N2 AIV的特异性HI抗体;攻毒保护试验结果:重组病毒均能对攻毒后的鸡产生100%保护效果;喉、肛拭子检测结果说明重组病毒可显著减少NDV与H9N2 AIV的体外排毒;气管与肺qPCR检测结果显示攻毒后3 d, rDHN3mF-2HA较rDHN3mF-HA更显著地降低了脏器中H9N2 AIV含量。本研究成功构建了共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感HA蛋白的基因Ⅶ型重组NDV,为H9N2 AIV和NDV的一种新型重组基因工程二联活载体疫苗的研制与应用奠定了基础。

H9亚型禽流感病毒分离鉴定及鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒病三联灭活疫苗对其免疫保护效果研究

【目的】研究鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)(简称:新流腺)三联灭活疫苗(La Sota株+BX13株+DC株)对禽流感病毒(AIV)流行毒株的免疫保护效果,为新流腺三联灭活疫苗的研发提供数据支撑。【方法】本研究对2019-2022年分别对从河北石家庄、北京密云、河北衡水、广西南宁发病鸡群中采集的病料进行AIV分离鉴定;利用MegAlign软件分析BX13株和2019-2022年分离株之间的相似性及亲缘关系;采用新流腺三联灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫后21 d测定H9亚型AIV HI抗体,同时用同源BX13株和本试验中AIV分离株进行攻毒试验,检测新流腺三联灭活疫苗对H9亚型AIV流行毒株的保护效果。【结果】2019-2022年从河北、北京和广西发病鸡群中分离获得4株AIV,均为H9亚型AIV,分别命名为SJZ19、MY20、HS21和NN22株;BX13株与2019-2022年4个分离株的相似性较高,在95.3%~96.3%之间;BX13株和4个分离株均属于DK-HK-Y280-97所在亚群的分支;新流腺三联灭活疫苗免疫后,各免疫组鸡H9亚型AIV HI抗体效价明显上升,达到9.2~9.9 log2,而对照组鸡抗体为阴性;用同源BX13株攻毒后,对照组鸡100%(5/5)阳性,免疫组鸡100%(10/10)阴性,保护率为100%;用4株H9亚型AIV分离株攻毒后,对照组鸡100%(5/5)阳性,免疫组鸡90%(9/10)~100%(10/10)阴性,保护率为90%~100%。【结论】以BX13株制备出的新流腺三联灭活疫苗对目前的流行毒株具有较好的免疫保护效果。

水痘减毒活疫苗冻干工艺的优化

目的:对冻干水痘减毒活疫苗的冻干工艺参数进行筛选和优化。方法:通过设计单因素试验和正交试验对水痘减毒活疫苗的关键冻干工艺参数进行优化,采用优化后的冻干曲线制备冻干水痘减毒活疫苗,并测定制品水分含量、外观、病毒滴度等指标。结果:最佳工艺参数为升华干燥温度-20℃,升华干燥真空度10 Pa,解析干燥温度30℃,解析干燥时间8 h;采用优化后冻干曲线制备的疫苗外观为乳白色或白色疏松体,复溶后为澄明液体,可微带乳光,无异物;各种理化性质及水分含量均符合规定,且制品病毒滴度符合标准。结论:优化后的冻干曲线适用于冻干水痘减毒活疫苗的制备。

减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的实验免疫效果研究

将运送H5亚型禽流感病毒DNA疫苗重组减毒鼠伤寒沙门氏菌以1.0×1010CFU剂量口服接种1日龄SPF雏鸡,结果表明重组菌对雏鸡具有良好的安全性。将重组菌SL7207(pVAX1-HA)和X4550(asd-pVAX1-HA)以2×109CFU的剂量两次口服免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡,同时,将重组菌分别与pVAX1-IFN-γ或pVAX1-IL2(200μg/只)联合免疫,通过测定小肠粘膜抗体效价,结果显示,重组菌单独免疫组和联合免疫组能激发机体产生粘膜免疫应答,且与空载体组、空白对照组以及油苗组之间存在显著性差异(P<0.05)。攻毒后,免疫保护结果显示无论是重组菌单独免疫组还是联合免疫组均与空载体组和空白对照组之间存在显著性差异(P<0.05),而重组菌单独免疫组与联合免疫组之间不存在显著性差异,说明重组菌SL7207(pVAX1-HA)和X4550(asd-pVAX1-HA)能够提供机体抵抗HPAIV H5亚型强毒攻击的良好的免疫保护作用,这为进一步筛选出基于粘膜免疫途径的新型禽流感基因工程疫苗奠定了基础。

以减毒沙门氏菌运送的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的构建及其对小鼠的免疫原性

根据GenBank中已发表的H5亚型禽流感病毒HA基因序列 ,设计一对引物 ,通过RT PCR扩增鹅源H5亚型高致病力禽流感病毒HA基因 ,测序确认后 ,将其克隆入真核表达载体pVAX1和asd pVAX1得到重组表达载体pVAX1 HA和asd pVAX1 HA。将重组质粒转染P815细胞 ,经间接免疫荧光试验证实 ,HA基因在细胞内得到了瞬时表达。进一步将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4 5 5 0得到两种运送DNA疫苗的重组沙门氏菌X4 5 5 0 (pVAX1 HA)和X4 5 5 0 (asd pVAX1 HA) ,以 1× 10 9CFU 只的剂量两次口服免疫BALB c小鼠 ,免疫小鼠不仅可以检测到HA特异性的血清抗体应答 ,而且还能抵抗稳定表达H5亚型禽流感病毒HA基因的P815肥大细胞瘤的攻击 ,说明该运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌系统在体内能够成功释放所携带的质粒 ,并且能够刺激机体产生保护性免疫应答。

稳定携带H5亚型禽流感病毒候选DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及其免疫原性

采用PCR技术从重组质粒pVAX1-HA扩增出禽流感病毒JSGO(H5N1)株的血凝素(HA)基因,将其克隆入真核表达质粒pmcDNA3.1+中,获得重组表达质粒pmcDNA3.1-HA。通过电穿孔转化法将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207*,构建成功携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207*(pmcDNA3.1-HA)。经体内体外试验证实,重组质粒pmcDNA3.1-HA在沙门氏菌中的稳定性显著高于pcDNA3.1-HA。将重组菌SL7207*(pmcDNA3.1-HA)和SL7207*(pcDNA3.1-HA)分别以2×109CFU剂量两次口服免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠可产生针对禽流感病毒HA蛋白的黏膜抗体。重组菌以5×109CFU剂量两次口服免疫试验鸡,免疫鸡的小肠样品中可测到针对禽流感病毒HA蛋白的黏膜抗体,且SL7207*(pmcDNA3.1-HA)免疫组的抗体效价高于SL7207*(pcDNA3.1-HA)免疫组。免疫保护试验结果显示,SL7207*(pmcDNA3.1-HA)和SL7207*(pcDNA3.1-HA)免疫组的免疫保护率均与空载体组之间存在显著性差异(P<0.05),且SL7207*(pmcDNA3.1-HA)免疫组的保护率较SL7207*(pcDNA3.1-HA)免疫组提高了22.6%,说明稳定携带H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的减毒沙门氏菌具有良好的免疫原性和免疫保护性。

季节性流感疫苗毒株药学变更管理的探讨

世界卫生组织(WHO)每年都会对全球流行性感冒病毒进行监测,并给出相应指引,引导当年季节性流感疫苗的生产。疫苗生产企业每年根据WHO推荐的流行性感冒病毒生产当季流感疫苗。对于季节性流感疫苗毒株的变更,涉及流行性感冒监测系统,数据收集分析,疫苗株推荐,类似株/种子株筛选及分发、扩增制备,疫苗生产及检定、分发、接种等多个环节,疫苗生产企业如何进行变更管理,关系到疫苗的安全性、有效性和质量可控性。本文就季节性流感疫苗毒株药学变更的国内外法规要求、国内季节性流感疫苗毒株药学变更现状、毒株变更开展的药学工作进行了探讨,以期为疫苗生产企业季节性流感疫苗毒株药学变更管理提供参考,同时也为其他疫苗毒株药学变更管理提供思路。

减毒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗诱导对新城疫病毒的免疫保护

探讨了以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体传递新城疫病毒 DNA疫苗的安全性、免疫原性和可行性。将含新城疫病毒 ( NDV) F4 8E9株融合蛋白 ( F)基因的真核表达质粒 pc DNA3- F的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 ZJ111株 ( ZJ111/ pc D-NA3- F菌株 ) ,以 10 8CFU进行首免 ,2周后二免 ,二免后 4周攻击强毒株 F4 8E9,观察其安全性和免疫原性 ,同时设只含空载体 pc DNA3的 ZJ111/ pc DNA3菌株对照及口服 PBS对照。结果表明 :重组 ZJ111/ pc DNA3- F菌株具有良好的安全性 ,对强毒株攻击的保护率达 6 4 .7%。重组 ZJ111/ pc DNA3- F菌株不仅能诱导雏鸡产生 NDV EL ISA抗体 ,而且诱导产生的法氏囊 B淋巴细胞和胸腺 T淋巴细胞增殖反应显著高于 ZJ111/ pc DNA3对照组。这些结果提示 ,减毒沙门氏菌为载体不仅可直接将 NDV F基因呈递给鸡体细胞进行表达 ,产生抗 NDV的体液免疫 ,而且还可诱导细胞免疫应答。

H9N2亚型禽流感病毒NS1基因缺失减毒活疫苗候选株对蛋鸡的免疫效力评价

为评价H9N2亚型禽流感病毒(AIV)NS1基因缺失减毒活疫苗候选株r TX-NS1-128对蛋鸡的免疫效力,本研究对蛋鸡H9N2亚型AIV母源抗体半衰期、疫苗适宜免疫时间、抗体免疫保护临界值以及免疫鸡抗体消长规律等进行研究。结果显示,雏鸡H9亚型AIV母源血凝抑制(HI)抗体半衰期为3.29 d。雏鸡母源抗体水平对疫苗的免疫效果有较大的影响,以母源HI抗体滴度约为4 log2时免疫为宜。少数HI抗体滴度为4 log2~6 log2的免疫鸡攻毒后可在5 d或3 d内从咽喉短暂排毒,HI抗体滴度为4 log2、5 log2、6 log2和≥7 log2时攻毒保护率分别为80%、90%、90%和100%,建议该疫苗的抗体免疫保护临界值为5 log2。鸡一次免疫后平均HI抗体滴度在5 log2以上可持续9周左右。本研究为H9N2亚型禽流感新型减毒活疫苗的开发和应用提供依据。

以减毒鼠伤寒沙门氏菌运送的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的安全性与免疫效力

将运送 H5亚型高致病力禽流感病毒 DNA疫苗的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 X4 5 5 0 (p VAX1- HA)和 X4 5 5 0 (asd-p VAX1- HA )以 1× 10 1 0 CFU的剂量腹腔注射 1日龄 SPF白莱航雏鸡 ,结果表明 ,二者均具有良好的安全性。对 SPF白莱航鸡的免疫原性试验结果表明 ,这 2种细菌均能刺激鸡体产生高水平的肠道粘膜免疫应答 ,但是不能有效地激发血清抗体应答。对商品代伊莎褐蛋鸡的免疫效力试验初步结果显示 ,X4 5 5 0 (asd- p VAX1- HA)免疫鸡能够抵抗强毒的攻击 ,保护指数为 77.8% ,而 X4 5 5 0 (p VAX1- HA)

人乳头瘤病毒16L1-减毒志贺氏杆菌为载体疫苗的构建及免疫效应初步鉴定

为预防高危型人乳头瘤病毒16型(HPV16)诱发宫颈癌,制备以减毒志贺氏杆菌为载体的HPV16预防疫苗,以期载体可介导机体产生粘膜免疫反应,达到预防HPV16感染的目的。为此构建了以HPV16L1为免疫原的减毒志贺氏杆菌苗,并初步鉴定候选疫苗的减毒特性和免疫效果。利用基于志贺氏杆菌virG/icsA基因的表达载体(pHS3199),将HPV16L1基因插入后构成pHS3199-hpv16L1质粒,电穿孔法将其转入减毒志贺氏杆菌sh42,经筛选获得重组减毒sh42-HPV16L1工程菌。用免疫印迹法检测HPV16L1蛋白表达,连续传代法确定其传代和目的蛋白表达的稳定性;豚鼠角膜巩膜炎症试验检测细菌的毒力和菌苗的免疫效果;小鼠红细胞凝集抑制试验检测免疫血清对病毒样颗粒(VLP)的中和活性。免疫印迹检测证实,重组菌株sh42-HPV16L1可稳定表达HPV16L1;豚鼠角膜巩膜炎症试验证实,该候选菌苗无致病性。减毒sh42-HPV16L1经结膜囊途径免疫豚鼠,可以产生特异性体液免疫应答,免疫动物体内的血清、肠道、阴道分泌物中抗HPV16L1VLPIgG、IgA含量显著高于对照组,并且sh42-HPV16L1免疫动物血清可明显抑制HPV16L1VLP引起的小鼠红细胞凝集。因而sh42-HPV16L1将是一种潜在的HPV16候选预防疫苗。

减毒沙门菌运送的H9N2亚型禽流感病毒DNA疫苗的研制及其免疫试验

根据GenBank中已发表的H9N2亚型AIV HA基因序列设计并合成一对PCR引物,通过RT-PCR扩增A/Chicken/Shanghai/3/2002(H9N2)AIV毒株的HA基因,测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1和asd-pVAX1得到重组表达质粒pVAX1-HA和asd-pVAX1-HA。将重组质粒转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验证实,HA基因在细胞内得到了瞬时表达。进一步将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207和X4550,得到两种运送DNA疫苗的重组沙门菌SL7207(pVAX1-HA)和X4550(asd-pVAX1-HA)。以5×109cfu/只的剂量两次口服接种1日龄的商品代伊莎褐蛋鸡,免疫鸡既能检测到HA特异性的血清抗体应答,又能检测到黏膜免疫应答,采用A/Chicken/Shanghai/3/2002(H9N2)AIV毒株经滴鼻和口服同时攻毒免疫鸡后,这两种疫苗抑制免疫鸡排毒的效果与灭活疫苗有显著差异。

甲型流感病毒HA基因核酸疫苗表达载体的构建及表达

目的构建含有甲型流感病毒HA基因的核酸疫苗表达载体,转染COS-7细胞,并检测目的蛋白的表达。方法将甲型流感病毒New Caledonia/20/99(H1N1)接种鸡胚后,收获尿囊液,提取流感病毒总RNA,RT-PCR法扩增HA基因。经亚克隆后获得质粒pMD-T/HA,酶切鉴定后测序,将其与质粒pVAX1分别双酶切后连接,构建甲型流感病毒表达载体pVAHA。脂质体法转染COS-7细胞,并检测目的蛋白的表达。结果扩增出1700 bp片段,与预期的HA基因大小相符,测序结果与GenBank报道一致,酶切鉴定表明甲型流感病毒表达载体pVAHA构建正确,Western blot检测证明了流感病毒HA蛋白的表达。结论已成功构建了甲型流感病毒HA基因核酸疫苗表达载体pVAHA。

携带禽流感病毒DNA疫苗的减毒鼠伤寒沙门菌的免疫效力

将从重组质粒pVAX1-HA中扩增的HA基因和从pVAX1-HA-CpG中切出的HA-CpG基因分别克隆入pcDNA3.1(+)载体中,获得重组质粒pcDNA3.1-HA和pcDNA3.1-HA-CpG。将上述重组质粒分别转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验检测发现HA基因可在COS-7细胞中表达。将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,构建成携带DNA疫苗的重组沙门菌SL7207(pcDNA3.1-HA)和SL7207(pcDNA3.1-HA-CpG)。将重组菌分别以5×109CFU口服免疫1日龄鸡2次,重组菌免疫组产生的小肠黏膜抗体效价与空载体组及油乳剂灭活疫苗组间存在显著差异。攻毒免疫保护结果表明,SL7207(pcDNA3.1-HA-CpG)免疫组与空载体组之间存在显著差异,而SL7207(pcDNA3.1-HA)免疫组则与空载体组间无显著差异,说明CpG可增强DNA疫苗的免疫效果。