减毒结核分枝杆菌H37Ra感染小鼠模型的实验研究

目的:研究减毒结核分枝杆菌(M.tb)H37Ra感染小鼠模型及其病理损伤的机制。方法:将清洁级Balb/c小鼠分为对照组和M.tb模型组,各3只。将H37Ra按照每只小鼠1×106CFU的剂量,经尾静脉注射感染小鼠,分别于感染7、14和21 d后,无菌操作取小鼠肺和脾脏组织,测量肺和脾脏的脏器系数,匀浆后行活菌培养;肺和脾脏组织冷冻切片,行HE染色观察病理损伤情况。结果:小鼠感染M.tb 14和21 d后,脾脏脏器系数均较感染7 d后显著升高(P<0.01和P<0.05)。感染7 d后,肺和脾脏组织匀浆均可检出活菌,脾脏组织H37Ra活菌量明显高于肺脏,并随感染时间逐渐增加;感染14 d后,肺组织病理观察可见明显感染性病变损伤。结论:M.tb H37Ra经尾静脉注射感染小鼠模型可造成部分结核病样病理性损伤。

超声介导缓释型载药纳米粒促进抗结核药物增效杀菌的实验研究

目的探讨超声介导缓释型载药聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)共聚物纳米粒对减毒牛结核分枝杆菌的体内外增效杀菌作用。方法采用双乳化法制备PLGA载左氧氟沙星(LEV)缓释纳米粒(LEV-NPs),并检测其物理特性和药物释放情况。将卡介苗(BCG)菌液随机分为LEV组(仅加入LEV)、超声联合LEV组(加入LEV后立即经超声辐照)、超声联合LEV-NPs组(加入LEV-NPs后立即经超声辐照)及对照组(加入等量PBS缓冲液),实验处理24 h后检测各组活菌落数,观察各组BCG活死菌变化及其表面结构。建立SD大鼠皮下BCG结核肉芽肿模型,将20只大鼠分为LEV组(仅皮下注射LEV)、超声联合LEV组(皮下注射LEV后立即经超声辐照)、超声联合LEV-NPs组(皮下注射LEV-NPs后立即经超声辐照)及对照组(皮下注射等量生理盐水),于治疗后第3、7、14天分别测量各组大鼠皮下BCG结核肉芽肿体积,计算并比较各组治疗效果。结果制备的LEV-NPs呈大小均一的球形,分散性良好,粒径为(282.42±3.55)nm,Zeta电位为-(20.40±0.63)mV,载药率、包封率分别为6.21%、65.30%;LEV-NPs在24、48、72 h自然条件下LEV累计释放率分别为31.2%、45.7%、46.9%。体外实验显示,超声联合LEV-NPs组细菌活性下降最明显,菌落存活率约26%,与其余各组比较差异均有统计学意义(均P<0.01);激光共聚焦显微镜下示超声联合LEV-NPs组可见视野下呈明亮的红色荧光,以死菌为主,仅见少量活菌落;场发射扫描电镜下示超声联合LEV-NPs组细菌数量明显减少,菌体伸展、断裂,细菌损伤情况最严重。体内实验显示,超声联合LEV-NPs组大鼠皮下BCG结核肉芽肿体积较其余各组明显减小(均P<0.05)。结论超声介导LEV-NPs可显著提高LEV对减毒牛结核分枝杆菌的体内外杀菌效果,具有协同增效作用。

利用InSyTe FLECT/CT成像技术动态观察急性肺结核小鼠感染模型的构建

目的构建可应用于活体成像的近红外荧光减毒牛型结核分枝杆菌,并利用三维荧光发射计算机断层扫描(InSyTe FLECT/CT)成像技术动态观察不同感染途径下急性肺结核小鼠感染模型的建立。方法通过基因重组的方式将近红外荧光蛋白(near-infrared fluorescent protein,iRFP)基因iRFP720插入到游离型载体pMV261质粒,将携带iRFP720基因的质粒转染至Mycobacterium bovis BCG str.Pasteur 1173P2(简称BCG)中,筛选出稳定表达iRFP720荧光蛋白的单克隆菌株Mycobacterium bovis BCG str.Pasteur 1173P2::pMV261-iRFP720(简称BCG-iRFP720)。体外传代扩增后分别经腹腔和尾静脉接种途径感染C57BL/6N小鼠,建立可视化急性肺结核小鼠感染模型,通过InSyTe FLECT/CT成像技术动态观察荧光菌株在小鼠体内分布情况。结果获得了高水平稳定表达近红外荧光蛋白的BCG-iRFP720荧光菌株。该荧光菌株体外多次传代后在细胞水平和动物体内水平均能被激发出明显红色荧光,将稳定表达荧光蛋白的单克隆菌株分别经腹腔和尾静脉接种途径感染小鼠,InSyTe FLECT/CT活体成像发现,腹腔注射感染后第5天可见小鼠肺部红色荧光出现,而尾静脉注射感染后第1天即可见小鼠肺部红色荧光出现。结论成功建立了稳定表达近红外荧光蛋白的减毒牛型结核分枝杆菌菌株。采用InSyTe FLECT/CT成像技术构建的可视化急性肺结核小鼠感染模型是拓展分枝杆菌在体内生长、转移及治疗相关研究的理想模型。

结核病疫苗的临床试验进展

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的全球性传染性疾病。卡介苗作为在全球普遍接种的结核病疫苗,可降低儿童重症结核病的发病率,但对减少成人结核病的发病率价值有限。新型结核病疫苗的研发对全球结核病防治目标的达成必不可少,本研究就已进入临床试验阶段的疫苗进行综述,并介绍目前疫苗的研究策略。

卡介苗生产用菌株全基因组测序

【目的】对我国生产用卡介苗上海D2PB302菌株(简称“卡介苗上海D_(2)株”)全基因组进行测序及部分基因功能预测。【方法】取卡介苗上海D2株(编号D2-JIA12-1)样品DNA,采用第三代测序平台PacBio RSⅡ进行全基因组测序,并结合二代测序数据得到最终的基因组序列。对基因序列分别进行rRNA预测和tRNA预测,对预测的基因进行基本的功能注释,并选取其中肺内表达结核分枝杆菌(MTB)在小鼠体内感染过程中高表达编码(IVE-TB)抗原基因序列、减毒结核分枝杆菌疫苗(MTBVAC)作为目的序列与结核分枝杆菌H37Rv序列(NC_000962.3)比对。【结果】卡介苗上海D2株基因组序列长度为4 045 232 bp,GC含量为65.66%。Glimmer3.02软件共预测出4 259个基因,基因的平均长度为933 bp,其中1 783个基因是假定蛋白,其余2 476个基因具有明确的生物学功能,与毒力基因库比对后得到144个毒力基因,包含29个Ⅶ型分泌系统基因,10个N端具有保守的脯氨酸-谷氨酸(PE)和脯氨酸-脯氨酸-谷氨酸(PPE)序列的蛋白质家族基因。【结论】明确了卡介苗上海D_(2)株全基因序列的背景资料,并为后续开展主要抗原基因的遗传稳定性检测奠定了广泛的基础。