表达胃癌MG7-Ag模拟表位的减毒鼠伤寒杆菌疫苗的研制和初步鉴定

目的 研制可表达胃癌ＭＧ７－Ａｇ模拟表位的减毒鼠伤寒杆菌疫苗。 方法将ＮｃｏⅠ位点和ＭＧ７－Ａｇ模拟表位编码序列的互补序列设计到上游引物的５′端。以含有ＨＢｃＡｇ全序列的质粒ｐ１．２Ⅱ为模板，通过ＰＣＲ扩增，获得ＭＧ７－Ａｇ模拟表位与ＨＢｃＡｇ的融合基因。将目的基因插入载体ｐＵＣｍ－Ｔ，经酶切鉴定和序列测定证实后，再亚克隆至与减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４５５０互补的质粒ｐＹＡ３３４１中，再以此重组质粒转化减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４５５０。结果序列测定证实，ＰＣＲ产物为胃癌ＭＧ７－Ａｇ模拟表位与ＨＢｃＡｇ的融合基因片段；最终得到含有目的基因片段的重组表达载体ｐＹＡ３３４１。重组质粒在Ｘ４５５０中的表达产物，经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ表明，在相对分子质量（Ｍｒ）约在２２ ０００处有１条可与抗ＭＧ７ ｍＡｂ特异性结合的多肽表位。结论成功地研制可表达胃癌ＭＧ７－Ａｇ模拟表位减毒鼠伤寒杆菌疫苗，为进一步研究其在胃癌免疫治疗中的作用奠定了基础。

幽门螺杆菌尿素酶减毒鼠伤寒杆菌疫苗诱导小鼠黏膜免疫应答的研究(英文)

目的研究表达幽门螺杆菌(H.pylori)尿素酶B亚单位(UreB)的减毒鼠伤寒杆菌活菌重组疫苗口服免疫Balb/c小鼠后的黏膜免疫应答状况。方法将已构建成功的表达UreB的重组减毒鼠伤寒杆菌SL3261/pTC01-Ureb口服免疫Balb/c小鼠，12周后检测肠液和血清中的特异性抗体反应。结果疫苗组小鼠胃黏膜炎症程度的差异无统计学意义。结论表达H.pylori UreB的减毒鼠伤寒杆菌SL3261/pTC01-UreB能够诱导小鼠产生抗H.pylori的黏膜免疫，可用作抗H.pylori感染的口服疫苗。

沙眼衣原体主要外膜蛋白在减毒鼠伤寒杆菌中的表达及初步鉴定

目的采用作为疫苗载体的减毒鼠伤寒杆菌致死性平衡系统 ,构建能异源表达沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)的重组菌株。方法以D型Ct的DNA为模板 ,用所设计的特异性引物扩增编码CtMOMP高变区(VDI～VDIV)基因 ,并将扩增产物定向克隆至质粒pUC19中。序列分析后 ,再亚克隆至与减毒鼠伤寒杆菌X4550互补的质粒pYA3341中 ,以重组质粒转化减毒鼠伤寒杆菌X4550。结果对构建的重组菌以种特异性抗CtMOMP单克隆抗体(mAb)做蛋白印迹表明 ,在相对分子质量(Mr)约为33000处表达有1条带 ,表达量约占菌体总蛋白的13 %。结论成功地构建了能表达MOMP的重组菌株并获得表达。

含恶性疟原虫基因片段的重组减毒鼠伤寒杆菌的免疫效果

减毒鼠伤寒杆菌可被用作外源抗原基因经口导入宿主免疫系统的载体,能有效地激发起宿主针对该外源抗原的免疫应答反应.恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(merozoite surfaceprotein 1,MSP1)是恶性疟原虫红内期的重要候选抗原.我们已成功地将克隆有恶性疟原虫MSP1第1号基因片段(M1)的pQE质粒导入了减毒鼠伤寒杆菌x4064株中,构建成x4064(pQEM1)重组菌,测定了其在小鼠体内的稳定性.本文就X4064(pQEM1)重组菌接种小鼠后所激发的针对M1蛋白的免疫应答进行了初步的检测.

克隆有恶性疟原虫MSP1基因片断的pQE质粒在减毒鼠伤寒杆菌X4064株中的表达

为探讨克隆有恶性疟原虫ＭＳＰ１基因片断的重组ｐＱＥＭ１质粒在减毒鼠伤寒杆菌中的表达。使用转化和转导的方法构建减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＲＥＰ４／ｐＱＥＭ１）；通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＱＥＭ１）和减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＲＥＰ４／ｐＱＥＭ１）的表达。实验结果成功地构建了减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＱＥＭ１），Ｘ４０６４（ｐＲＥＰ４／ｐＱＥＭ１）的诱导型表达量高于Ｘ４０６４（ｐＱＥＭ１）的组成型表达量。

表达恶性疟原虫裂殖子表面蛋白-1片段的减毒鼠伤寒杆菌的构建

目的 检测恶性疟原虫裂殖子表面蛋白 1基因在减毒鼠伤寒直菌X40 6 4株中的表达。方法 将 7个克隆有恶性疟原虫裂殖子表面蛋白 1基因片段的表达质粒 pQEM用氯化钙法转化到修饰系统正常、限制系统缺陷的鼠伤寒杆菌LB5 0 0 0中 ,再通过专一性噬菌体P2 2 转导入腺苷酸环化酶基因、环腺苷酸受体基因双重突变的减毒鼠伤寒杆菌X40 6 4株中 ,用质粒酶切、Westernblot鉴定构建的重组菌株、测定重组菌株的表达。结果 成功地构建了 7个重组减毒鼠伤寒杆菌X40 6 4(pQEM )株 ,重组pQEM质粒在减毒鼠伤寒杆菌X40 6 4株中获得了表达。结论 X40 6 4(pQEM )

表达疟原虫裂殖子表面蛋白1减毒鼠伤寒杆菌的稳定性

目的检测含恶性疟原虫裂殖子表面蛋白１基因片断的重组减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＱＥＭ１）的入侵宿主能力，所含质粒的稳定性和再表达能力。方法用含恶性疟原虫裂殖子表面蛋白１第１号基因片段的重组减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＱＥＭ１）灌胃接种ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，用平板培养法、质粒酶切和免疫印迹反应，鉴定从小鼠组织中分离到的该重组菌，测定其表达能力，及在小鼠组织中的消长。结果从小鼠组织中分离到的减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４株含有重组的ｐＱＥＭ１质粒；减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＱＥＭ１）体外表达了恶性疟原虫裂殖子表面蛋白１第１号片断；Ｘ４０６４（ｐＱＥＭ１）在小鼠组织中的消长曲线与Ｘ４０６４的消长曲线基本一致。结论重组ｐＱＥＭ１质粒能稳定地存在于减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４株中，不妨碍其入侵宿主细胞，从小鼠组织中分离到的Ｘ４０６４（ｐＱＥＭ１）依然具有表达Ｍ１蛋白的能力。

Hp尿素酶B亚单位减毒鼠伤寒菌重组疫苗的制备和生物效应研究

目的研制表达幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)的减毒鼠伤寒杆菌重组疫苗,并观察其生物学效应。方法以幽门螺杆菌标准株——悉尼株(SS1)的基因组DNA为模板,构建Hp尿素酶B亚单位减毒鼠伤寒杆菌重组疫苗SL3261/pTC01-UreB。经口服免疫BALB/c小鼠后,检测肠液中抗UreB的特异性IgA抗体和血清中IgG抗体,同时观察小鼠体重、胃黏膜炎症程度等一般情况。结果构建Hp-UreB的SL3261/pTC01-UreB菌株,连续传80代可稳定表达Hp-UreB,菌落提取质粒后酶切及PCR鉴定均与pTC01-UreB符合;SDS-PAGE和Western blot显示pTC01-UreB转化SL3261可表达与Hp-UreB亚单位相符的相对分子质量约61000蛋白,该蛋白能与抗Hp兔血清反应;SL3261/pTC01-UreB口服免疫BALB/c小鼠的肠液中抗UreB的特异性IgA抗体和血清中IgG抗体明显增高,而小鼠体重和胃粘膜炎症指数与对照组差异无显著意义。结论Hp-UreB的减毒鼠伤寒杆菌重组疫苗SL3261/pTC01-UreB口服免疫小鼠可诱导特异性免疫应答。

沙眼衣原体重组口服活疫苗的构建及其口服免疫的特性

目的 观察所构建的沙眼衣原体 (Ct)重组疫苗株对小鼠的免疫特性 .方法 以减毒鼠伤寒杆菌致死性平衡系统为载体构建 Ct重组疫苗株 .将重组疫苗株用 L B培养基连续传代 5 0次 ,比较传代前后携带质粒、生化反应性及蛋白表达情况 ,以鉴定重组子的稳定性 .并以不同浓度的重组菌活菌液口服免疫 BAL B/c小鼠 ,检测外源基因的插入和表达对减毒株毒性的影响 .口服免疫后不同时间检测小鼠小肠 Peyer氏结、肠系膜淋巴结、脾脏及子宫粘膜的重组菌的分布 .结果 重组菌连续传代 5 0次保持稳定 ,并具有较好的安全性 .所构建的菌株仍保持在小肠、肠系膜淋巴结、脾脏及粘膜等的定居能力 .结论 所构建的重组疫苗株具有较好的稳定性和安全性 。